المؤلفان بالشكر إلى موظفي إدارة التكنولوجيا الحيوية الصيدلية والبيولوجيا الجزيئية وPelsmacker خصوصا دي مونيك لإعداد هذا الفيروس المسمى المشعة. ونحن ممتنون للميركس إلين وHadewych Halewyck على ملاحظاتهم للاهتمام ومناقشات وBleeser دي جيريت لمساعدته في المختبر. وأيد هذا العمل من الناحية المالية من منحة OZR من جامعة بروكسل الحرة (OZR1807)، وvoor فون Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) ومنظمة الصحة العالمية (TSA 200410791). ليز Schotte زميل predoctoral من voor فون Vlaanderen Onderzoek Wetenschappelijk (FWO).

المبدأ (A) ونظرة عامة على طريقة (B) وصفت في الشكل 1. 1. إعداد المخزن المؤقت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ملزم / غسيل عازلة عن طريق إذابة فوسفات الصوديوم هيدروجين (50 ملم) وكلوريد الصوديوم (300 ملم) في مجال المياه وضبط درجة الحموضة إلى 8.0. وبالإضافة إلى ذلك إضافة توين 20 (0.01٪ (M / V) تركيز النهائي)، ميثيونين (2٪ (M / V) تركيز نهائي)، والزلال (0.1٪ (M / V) تركيز نهائي)، والتكيف مع حجم المطلوبة. </li></ol> 2. إعداد حبات مغناطيسية إعداد حبات مغناطيسية وفقا لدليل التعليمات. لفترة وجيزة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend حبات المغناطيسي باستخدام دوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل، بالنسبة لكل عينة، 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي معلق (40 ملغ / مل) في أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات مغناطيسية باستخدام مغناطيس، حتى طاف هو واضح (+ / - 30 ثانية) وإزالة طاف بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسلحبات مغناطيسية مرتين: resuspend الخرز في 150 ميكروليتر من تجليد الكتب / غسل العازلة. ترحيل حبات مغناطيسية إلى جانب واحد من أنبوب باستخدام مغناطيس حتى طاف هو واضح، وإزالة بعناية وطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 40 ميكرولتر من تجليد الكتب / غسيل العازلة، ولكل عينة، إلى resuspend الخرز (10 ملغ / مل). </li></ol> 3. تقارب التقاط الفحص ملاحظة: لقياس النشاط الإشعاعي الخلفية (الكونية) (0٪ النشاط الإشعاعي)، يتم إضافة أي فيروس radiolabeled على عينة الرقابة 1. بدلا من ذلك، يتم إضافة حجم نفسه ملزم / غسل العازلة. ملاحظة: يتم تعريف النشاط الإشعاعي 100٪ عن طريق التحكم 2 عينة التي تضاف جميع المكونات ما عدا nanobody. بدلا من ذلك، يتم إضافة حجم نفسه ملزم / غسل العازلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب 2000 نسخة في الدقيقة من 35 S المسمى (β-الإشعاع) نوع الفيروس سلالة سابين 1 9، تضعف مع تجليد / غسيل العازلة إلى 80 ميكروليتر إلى لوحة microtiter 96-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 &amp; Mش؛ لتر من تخفيف nanobody إلى الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلط لمدة 10 ثوان باستخدام شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح هذه العينات لاحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة 40 ميكرولتر من تعليق الخرز المغناطيسي غسلها واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، في ظل اهتزاز بشكل مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخرز وطاف باستخدام مغناطيس ونقل طاف مسح في أنبوب. </li></ol> 4. قياس النشاط الإشعاعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل 50 ميكرولتر من طاف من الخطوة 3.6 في قارورة العد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من السوائل ومزيج التلألؤ. قياس النشاط الإشعاعي في عداد β-التلألؤ. </li></ol> 5. إعادة تدوير الخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع حبات المغناطيسي المستخدمة في الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 2 دقيقة أو حتى يتم الحصول على طاف واضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وresuspend حبات في 6 مل هيدروكسيد الصوديوم M 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق على multiplأنابيب ه واحتضانها في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مغناطيس لجمع حبات مغناطيسية وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل 2٪ SDS-حلا لكل أنبوب وresuspend باستخدام دوامة. تغلي خلال 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخرز وإزالة طاف. Resuspend حبات في 1 مل EDTA M 0.2 (الأس الهيدروجيني = 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان هذه الأنابيب في حمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق، ومرة ​​أخرى، وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الماء إلى كل أنبوب وresuspend الخرز. جمع الخرز وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة يغسل مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وresuspend حبات في 1 مل حل ملي 10 2 كوكلي. وضع على شاكر لمدة 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف باستخدام مغناطيس لجمع الخرز وresuspend في 1 مل من تجليد الكتب / غسل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وتغسل حبات مرتين باستخدام 1 مل من 20٪ (V / V) الايثانول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend حبات في حجمها الأصلي من 20٪ (V / V) وآخرونhanol للحصول على حبات مجدد في تركيز 40 ملغ / مل. </li></ol> 6. تفسير النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسوف تستخدم مراقبة عينة 1، والذي أضيف أي فيروس radiolabeled، لتصحيح النشاط الإشعاعي للخلفية، وإلى تعيين قيمة النشاط الإشعاعي 0٪. تعيين مستوى التحكم في نموذج 2، والذي لا يحتوي على nanobody وحيث بالتالي كل فيروس radiolabeled يبقى في طاف، حيث بلغت قيمة النشاط الإشعاعي 100٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسبة النشاط الإشعاعي في طاف (= 1٪) هي مقياس لهطول الأمطار العام (= 100 - 1٪) من فيروس radiolabeled من nanobody. </li></ol> 7. ممثل النتائج وتظهر النتائج ممثل لهذا التقارب في فحص التقاط أرقام 2 و 3 و 4. في الشكل 2، يظهر تقارب من PVSS38C، محددة nanobody لفيروس شلل الأطفال،. تم اختبار تقارب من PVSS38C لمدة ثلاثة مستضدات مختلفة من poliovirus اللغة الأصلية هي: مستضد (N-المستضد)، الصاخب مستضد (H-المستضد) ومفارز 14S. N-مستضد هو الفيروس الذي هو المعدية سليمة. عندما يتم تسخين فيروس (20 دقيقة عند 56 درجة مئوية) أو تعلق على سطح صلب (نتائج غير منشورة)، والتشكل من التغييرات قفيصة، مما أدى إلى فقدان (جزئي) من الحمض النووي الريبي الفيروسية والبروتين قفيصة VP4، وفارغ تتشكل capsids التي تسمى ثم H-مستضدات. مفارز 14S هي وسيطة الجمعية. يتم التعرف على هذه المستضدات من قبل مجموعات مختلفة من الأجسام المضادة بعد التطعيم (10) وتملك الحواتم مختلفة لذلك ومواقع مستضدي. في الشكل ويمثل نسبة النشاط الإشعاعي وجدت في طاف بوصفها وظيفة من تركيز nanobody. ويمكن ملاحظة أن النشاط الإشعاعي في طاف من العينات التي تحتوي على الوحدات الصغرى 14S radiolabeled يتناقص مع زيادة تركيزات من PVSS38C nanobody. يمكن أن يترجم هذا على أنه زيادة في كمية من فيروس شلل الأطفال 14S مفارز يخدعnected إلى PVSS38C nanobody وبشكل غير مباشر إلى حبات مغناطيسية. ويمكن للاسر عيار (= تركيز nanobody اللازمة للقبض على 50٪ من فيروس radiolabeled) يحسب بيانيا كما 0.099 نانومتر. ويلاحظ أي تقارب من PVSS38C لمستضدي-N و H-مستضدي شكل من فيروس شلل الأطفال. من هذه البيانات يتم تفسيرها أن PVSS38C يتفاعل مع حاتمة التي موجود حصرا على الوحيدات 14S وليس على الشكلين مستضدي أخرى من فيروس شلل الأطفال. لإثبات أن الخسارة من النشاط الإشعاعي من طاف ليست سوى نتيجة للتقارب محددة من nanobody نحو مستضدات لها، تم إجراء فحص نفسه مع Nb1، وهي ولدت nanobody ضد منظم والنسخي lrpB من sulfataricus Sulfolobus ومعروفة لديهم اي تفاعل مع أي مستضد فيروس شلل الأطفال. يظهر نتيجة لهذا الفحص في الشكل 3. كل فيروس radiolabeled يبقى في supernatants تبين أنه لا يوجد تفاعلNb1 ضد الأشكال المستضدية ثلاثة من فيروس شلل الأطفال. تم اختبار استنساخ النتائج وفقا لتكرار التجربة لمجموعة من ثماني مرات لمدة nanobody معين (أي PVSP29F) في أيام مختلفة وبواسطة أشخاص مختلفين. وتظهر النتائج في الشكل 4. تم حساب قيمة متوسط ​​نسبة النشاط الإشعاعي في طاف لكل تركيز nanobody ويتم تمثيلها في المراسلات مع الانحراف المعياري. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة على مبدأ (A) وطريقة (ب) من الفحص. A.، صاحب الموسومة nanobodies التي تعترف على وجه التحديد لمستضد فيروس شلل الأطفال معينة سوف تكون قادرة على التفاعل مع حبات المغلفة الكوبالت المغناطيسي، وسوف يعجل هذا الفيروس المسمى بالإشعاع. تضاف nanobodies باء، صاحب المفتاحية لفيروس شلل الأطفال المسمى بالإشعاع والمحتضنة. الكوبالت المغلفة هي حبات مغناطيسيةوأضاف ويتم تنفيذ الفصل المغناطيسي للمستضد محدد / غير منضم. يتم قياس النشاط الإشعاعي من طاف ويمكن الحصول على كمية المستضد القبض عليه. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" /> الشكل 2. القبض على الانجذاب المغناطيسي حبات من مستضدات فيروس شلل الأطفال من قبل مختلف PVSS38C nanobody. وتمثل نسبة النشاط الإشعاعي وجدت في طاف بوصفها وظيفة من تركيز PVSS38C. ويمكن لل14S يمكن العثور على وجود علاقة تركيز على الاستجابة، والتي تبين تفاعل PVSS38C مع حاتمة الحالي حصرا على 14S. دون تفاعل كبير مع N-، ولا يمكن الكشف عن H-مستضد، على الرغم من أن يلاحظ تافهة غير محددة الاستيلاء على تركيزات عالية جدا. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" /> الشكل 3. القبض على الانجذاب المغناطيسي حبات من مستضدات فيروس شلل الأطفال من قبل مختلف Nb1 nanobody </stronز&gt;. وتمثل نسبة النشاط الإشعاعي وجدت في طاف بوصفها وظيفة من تركيز Nb1. ومن المعروف Nb1 لديهم اي تفاعل مع أي مستضد فيروس شلل الأطفال أو الوحيدات. منذ تم العثور على 100٪ من النشاط الإشعاعي في طاف، لم يكن الفيروس غير ملزمة على وجه التحديد إلى Nb1. فقدان النشاط الإشعاعي في الشكل 2 ولذلك فقط بسبب تقارب محددة من nanobody نحو مستضدات لها. <img alt="الشكل 4." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" /> الشكل 4. استنساخ للفحص. ويمثل قيمة متوسط ​​نسبة النشاط الإشعاعي في طاف بوصفها وظيفة من تركيز nanobody. وتكررت التجربة ثماني مرات في أيام مختلفة وبواسطة أشخاص مختلفين. ويمثل الانحراف المعياري كما الأشرطة العمودية.

<ol>
	<li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus.">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li><li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins.">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li><li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method:+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus.">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li><li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens.">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li><li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent:+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A.">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li><li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. a. j. y. a. n. a., Bendahman, E., N, ., Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li><li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies.">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+camel+antibodies:+current+status.">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li><li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation.">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li><li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen.">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li><li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads.">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li><li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Immunoassay Handbook. , (2005).</li><li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis.">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li><li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER.">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

في البروتوكول، يتم تعريف النشاط الإشعاعي للمستضد التفاعل مع nanobody مثل فقدان فيروس radiolabeled من طاف. ولذلك فإن كمية النشاط الاشعاعي عجلت (= 100 - 1٪) ويمكن تقدير (منضمة إلى حبات المغناطيسي) بطريقة غير مباشرة من النشاط الإشعاعي في طاف (= 1٪). من ناحية أخرى، فإنه من الممكن أيضا لقي...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; اسم كاشف</strong</td&gt;<td<strong&gt; شركة</strong</td&gt;<td<strong&gt; فهرس العدد</strong</td&gt;<td<strong&gt; تعليقات</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; عزلته أبوغزاله Dynabeads والمنسدلة</td&gt;<td&gt; إينفيتروجن</td&gt;<td&gt; 101.03D</td&gt;<td&gt; حبات مغناطيسية</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Optiphase &#39;HiSafe&#39; 2</td&gt;<td&gt; بيركن إلمر</td&gt;<td&gt; 1200 - 436</td&gt;<td&gt; ومضات السائل</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

a liquid phase affinity capture assay using magnetic beads to study protein-protein interaction: the poliovirus-nanobody example

في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. بشرط أن يكون المفتاحية واحد من البروتين والمسمى بروتين آخر، لا يمكن تنفيذ هذا الأسلوب من أجل التحقيق في البروتين البروتين التفاعلات. لأنه يقوم على يد واحدة على الاعتراف من البروتين الموسومة بواسطة حبات الكوبالت المغناطيسي المغلفة و من ناحية أخرى على التفاعل بين المعلمة وبروتين بروتين معين 2 الذي يسمى. أولا، يتم خلط البروتينات المسماة والموسومة وحضنت في درجة حرارة الغرفة. تضاف حبات المغناطيسي، والتي تعترف علامة، ويتم فصل جزء محدد من البروتين المسمى من الكسر غير منضم باستخدام مغناطيس. ويمكن تحديد كمية البروتين المسمى التي يتم التقاطها بطريقة غير مباشرة عن طريق قياس إشارة من البروتين المسمى بقي في جزء غير منضم. الطور السائل ووصف تجربة التقارب مفيد للغاية عندما البروتينات تحويل متعلق بتكوين جزئي الحساسة والحمارعايد. ويتجلى في وضع وتطبيق فحص للتفاعل بين فيروس شلل الأطفال وفيروس شلل الأطفال الاعتراف nanobodies 1. فيروس شلل الأطفال منذ حساسة للتحويل متعلق بتكوين جزئي 2 عندما تعلق على سطح صلب (نتائج غير منشورة)، ويقتصر استخدام ELISA، وينبغي لذلك يفضل نظاما يستند إلى أن المرحلة السائلة. مثال على نظام المرحلة السائلة المستندة غالبا ما تستخدم في polioresearch 3،4 هو بروتين الصغيرة A-مناعي اختبار 5. على الرغم من هذا الاختبار أثبت تطبيقه، يقتضي وجود FC-هيكل، والذي هو غائب في nanobodies 6،7. ومع ذلك، وفرصة أخرى، ويمكن هذه مثيرة للاهتمام ومستقر واحد نطاق الأجسام المضادة 8 المهندسة بسهولة مع مختلف به. وتستخدم على نطاق واسع (له) 6 علامة يظهر تقارب لأيونات ثنائي التكافؤ مثل الكوبالت والنيكل أو، والتي يمكن عن دورهم تطلى بسهولة على حبات مغناطيسية. ونحن بالتالي وضعت هذه كمية بسيطةتقارب فحص القبض على أساس الخرز الكوبالت المغناطيسي المغلفة. وصفت فيروس شلل الأطفال مع 35 S لتمكين التفاعل دون عوائق مع nanobodies وتقديم كشف كمية ممكنة. الأسلوب السهل القيام بها ويمكن أن تنشأ مع انخفاض التكلفة، والذي تدعمه بمزيد من إمكانية حبات المغناطيسي تجديد بشكل فعال.

Watch this Scientific Journal Video about A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example at JoVE.com

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. هذا هو أسلوب موثوق بها على أساس التفاعل بين حبات مغناطيسية والبروتينات الموسومة (على سبيل المثال nanobodies) من ناحية، والتقارب بين بروتين المفتاحية والثانية، والبروتين المسمى (مثل فيروس شلل الأطفال) من جهة أخرى.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

a-liquid-phase-affinity-capture-assay-using-magnetic-beads-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K Views.  Vrije Universiteit Brussel. في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. هذا هو أسلوب موثوق بها على أساس التفاعل بين حبات مغناطيسية والبروتينات الموسومة (على سبيل المثال nanobodies) من ناحية، والتقارب بين بروتين المفتاحية والثانية، والبروتين المسمى (مثل فيروس شلل الأطفا...

Video: A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron regulatory proteins, IRP1 and IRP2. They bind to iron responsive elements (IREs) within the untranslated regions (UTRs) of several target mRNAs, thereby controlling the mRNAs translation or stability. IRE/IRP interactions have been widely studied by EMSA. Here, we describe the EMSA protocol for analyzing the IRE-binding activity of IRP1 and IRP2, which can be generalized to assess the activity of other RNA-binding proteins as well. A crude protein lysate containing an RNA-binding protein, or a purified preparation of this protein, is incubated with an excess of32 P-labeled RNA probe, allowing for complex formation. Heparin is added to preclude non-specific protein to probe binding. Subsequently, the mixture is analyzed by non-denaturing electrophoresis on a polyacrylamide gel. The free probe migrates fast, while the RNA/protein complex exhibits retarded mobility; hence, the procedure is also called &#8220;gel retardation&#8221; or &#8220;bandshift&#8221; assay. After completion of the electrophoresis, the gel is dried and RNA/protein complexes, as well as free probe, are detected by autoradiography. The overall goal of the protocol is to detect and quantify IRE/IRP and other RNA/protein interactions. Moreover, EMSA can also be used to determine specificity, binding affinity, and stoichiometry of the RNA/protein interaction under investigation.

Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example

Here we present a protocol to analyze RNA/protein interactions. The electrophoretic mobility shift assay (EMSA) is based on the differential migration of RNA/protein complexes and free RNA during native gel electrophoresis. By using a radiolabeled RNA probe, RNA/protein complexes can be visualized by autoradiography.

التحول التنقل الكهربي الفحص (EMSA) لدراسة التفاعلات RNA-البروتين: حفيظة / IRP مثال

RNA/protein interactions are critical for post-transcriptional regulatory pathways. Among the best-characterized cytosolic RNA-binding proteins are iron ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.