يتم دعم وأيد AF بمنحة بدءا من مجلس البحوث الأوروبي في إطار البرنامج الإطاري السابع للجماعة الأوروبية (FP7 / 2007-2013) / اتفاق ERC غرانت N ° 203413 ومركز منيرفا لبيو الهجين systems.HA معقدة ومنظمة العفو الدولية بواسطة داليا ودان رشاف الزمالة لطلاب درجة متقدمة في الجامعة العبرية في القدس.

1. تصميم صفيف الببتيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم تسلسل البروتين المستهدف في متداخلة جزئيا 10-20 بقايا الببتيدات. تختلف كمية التداخل على تجربة محددة وموارد مختبر الأداء، ولكن من حيث المبدأ يعد التداخل كان ذلك أفضل. عند تصميم الببتيدات تأخذ بعين الاعتبار العناصر المعروفة هيكل الثانوي في البروتين يمكن أن يكون مسؤولا عن التفاعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمر مجموعة الببتيد مصممة من خلال الباعة التجارية. هنا، الببتيدات استخدام تساهميا منضمة إلى مجموعة من خلال C-المحطة. </li></ol> 2. حجب غير محددة وملزمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل العازلة 50 ملي تريس أو الفوسفات التي تحتوي على 0.05٪ توين 20 (TBST / PBST) والتكيف مع درجة الحموضة المطلوبة مع كمية قياسه من حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم (من أجل معرفة قوة الأيونية دقيقة) وقوة الأيونية المطلوب مع كلوريد الصوديوم . هنا، استخدم الرقم الهيدروجيني من 7.5 والقوة الأيونية من 150 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل حجب2.5٪ (ث / ت) مسحوق الحليب منزوع الدسم في TBST / PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع غير محددة وملزمة، تزج في مجموعة 5 مل من عرقلة الحل. احتضان مجموعة لمدة 2-4 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر. </li></ol> 3. احتضان مع البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مجموعة الأولى مع 5 مل من عرقلة الحل لمدة 30 ثانية ثم مرتين مع TBST 5 مل / PBST لمدة 5 دقائق على شاكر في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مجموعة غسلها مع 5 مل من صاحب الموسومة حل البروتين تحتوي على 2.5٪ (ث / ت) مسحوق اللبن منزوع الدسم لمنع غير محددة وملزمة. هنا، استخدام 4.5 ميكرومتر من حل البروتين (STIL 500-650) الذائب في محلول منع وصفها. ملاحظة: عادة 5-10 ميكرومتر البروتين وتستخدم للفحص، ولكن تركيز البروتين يمكن أن يكون حتى ما يصل الى 2-3 ميكرومتر، اعتمادا على تقارب ملزمة وتركيزات محلية من الببتيدات التي تربط على مجموعة (كفاءة التوليف). المخزن المؤقت الذي البروتينتم حل يمكن أن تختلف ولكن هو شائع لتخفيف البروتين باستخدام نفس الحل الحجب هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المصفوفة في حل البروتين ل08/03 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. </li></ol> 4. احتضان مع الأجسام المضادة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع مجموعة 5 مل TBST / PBST. غسل الأول هو لمدة 30 ثانية تليها اثنين من 5 دقائق يغسل على شاكر في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مجموعة غسلها مع 5 مل من المخفف HRP-مترافق الأضداد (1: 1500) في وجود مخزن مؤقت الحضانة التي تحتوي على نفس المكونات في نفس تركيزات كما عرقلة الحل، لمدة 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. الأجسام المضادة يمكن ربط إما بروتين الهدف أو العلامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تجارب السيطرة اختبار تفاعل الأجسام المضادة مع الببتيدات على مجموعة، وخاصة إذا كان يحتوي على مجموعة من الببتيدات والبروتينات المستهدفة (على سبيل المثال، لoligomerization دراسات) بتكرار نفس البروتوكول دون الظريفص 3، تفرخ مع البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع مجموعة 5 مل TBST / PBST. غسل الأول هو لمدة 30 ثانية تليها اثنين من 5 دقائق يغسل على شاكر في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 5. قراءة صفيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ تطوير معان كيميائي مع ECL الغربية عدة الركيزة النشاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الكشف مع محلل الصورة الانارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل النتائج. تأكد من أن كلا من التكرارات على مجموعة تظهر نفس الإشارات، وبالتالي فإن النتائج لا يمكن الاعتماد عليها. إذا كان من المعروف هيكل شريك البروتين، والبحث عن هيكل لالببتيدات ملزمة والبحث عن مواقع الربط. حتى الببتيدات التي هي الآن في تسلسل يمكن أن يكون وثيق معا في بنية التعليم العالي وإنشاء موقع ملزم. </li></ol>

<ol>
	<li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptides+to+study+protein&#8211;protein+interactions.">Using peptides to study protein&#8211;protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li><li>Geysen, H. M., Wagner, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+or+mass+encoding+of+combinatorial+libraries.">Isotope or mass encoding of combinatorial libraries.</a> Chemistry &amp; Biology. 3 (8), 679-688 (1996).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot-synthesis:+an+easy+technique+for+the+positionally+addressable,+parallel+chemical+synthesis+on+a+membrane+support.">Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support.</a> Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).</li><li>Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+protein-protein+interactions+using+peptide+arrays.">Studying protein-protein interactions using peptide arrays.</a> Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).</li><li>Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Mapping+of+Linear+Antibody+Epitopes+in+Human+Serum+Albumin+Using+High-Density+Peptide+Arrays.">Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays.</a> PLoS ONE. 8 (7), (2013).</li><li>Uecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+substrate+peptide+for+the+FLT3+receptor+tyrosine+kinase.">A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase.</a> British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).</li><li>Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-activity+relationship+studies+using+peptide+arrays:+the+example+of+HIV-1+Rev-integrase+interaction.">Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction.</a> Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique:+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports&#8212;principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports&#8212;principles and applications.</a> Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).</li><li>Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+and+Small+Molecule+Microarray+for+High+Throughput+Cell+Adhesion+and+Functional+Assays.">Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays.</a> Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).</li><li>Castiel, A., Danieli, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Stil+protein+regulates+centrosome+integrity+and+mitosis+through+suppression+of+Chfr.">The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr.</a> Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).</li><li>Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STIL+protein+contains+intrinsically+disordered+regions+that+mediate+its+protein-protein+interactions.">The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions.</a> Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).</li><li>Izraeli, S., Lowe, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIL+gene+is+required+for+mouse+embryonic+axial+development+and+left-right+specification.">The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification.</a> Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).</li><li>Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+SIL+gene+is+correlated+with+growth+induction+and+cellular+proliferation.">Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation.</a> Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).</li><li>Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Cell-cycle-regulated+expression+of+STIL+controls+centriole+number+in+human+cells.">a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).</li><li>Tang, C. J., Lin, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+microcephaly+protein+STIL+interacts+with+CPAP+and+is+required+for+procentriole+formation.">The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation.</a> Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).</li><li>Vulprecht, J., David, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIL+is+required+for+centriole+duplication+in+human+cells.">STIL is required for centriole duplication in human cells.</a> Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).</li><li>Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sil+phosphorylation+in+a+Pin1+binding+domain+affects+the+duration+of+the+spindle+checkpoint.">Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint.</a> Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).</li><li>Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCL/TAL1+interrupting+locus+derepresses+GLI1+from+the+negative+control+of+suppressor-of-fused+in+pancreatic+cancer+cell.">SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell.</a> Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).</li><li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity.">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li><li>Olaussen, K. a., Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines.">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li><li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+Vif&#8211;A3G+interaction+using+peptide+arrays:+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides.">Mapping the Vif&#8211;A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li><li>Katz, C., Benyamini, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+the+interaction+between+the+antiapoptotic+Bcl-2+family+proteins+and+the+proapoptotic+protein+ASPP2.">Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).</li><li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+(tBID)+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+(MTCH2)+Protein:+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY.">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li><li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly.">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الببتيد فحص مجموعة هو أداة ممتازة لتحديد مواقع الربط من البروتين المستهدف في شركائها. هذا الاختبار هو سريعة وسهلة لأداء ويمكن الحصول على النتائج في واحد أو يومين عمل. الببتيد فحص مجموعة هي متعددة ويمكن استخدامها لأغراض كثيرة. أنها يمكن أن تستخدم لوصف تعديلات ما بعد ا...

البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية الحية. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين. هذا لأن الببتيدات يمكن توليفها بسهولة وتسمح بالتركيز على موقع التفاعل معين من جهة، وعلى أهداف متعددة في البروتين بطريقة إنتاجية عالية على الآخر 1،2 اليد. فحص مجموعة الببتيد هو سريعة وسهلة لأداء طريقة للحصول على كمية كبيرة من البيانات حول تفاعلات البروتين المستهدف مع العديد من الشركاء في وقت قصير 3. خلافا لأساليب الكيمياء الحيوية أو الفيزيائية الحيوية الأخرى لكشف وتحليل تفاعلات البروتين البروتين، وفحص مجموعة الببتيد يتطلب تركيز منخفض جدا من البروتين ويمكن الكشف ضعيفة جدا ملزمة. صفائف الببتيد يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات في التفاعلات الببتيد البروتين مثل رسم الخرائط من البروتين البروتين أو مواقع التفاعل مستقبلات يجند 4، واجهات هومو أو مغاير oligomerization، والأجسام المضادة التي تميز الحواتم 5، ودراسة الأنشطة الإنزيمية 6 وإنتاجية عالية بالهيكل علاقة النشاط (SAR) دراسات (7). لإجراء استعراض معمق حول فحص مجموعة الببتيد رؤية كاتز وآخرون. 4 عدة أنواع من المصفوفات الببتيد موجودة حاليا. هناك نوعان من الاستراتيجيات الصناعية الكبرى لجعل صفائف الببتيد: تركيب الببتيدات قبل إرفاقها إلى دعم قوي، أو تركيب الببتيدات مباشرة على دعم قوي، وذلك أساسا باستخدام 4،8 تقنية SPOT. الويتم تصنيعه الببتيدات على دعم قوي عادة بنسبة 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) كيمياء 8. بين مخططات الاصطناعية شيوعا هي مرفق الببتيد من خلال محطة N (على سبيل المثال، JPT صفائف pepstar 9) والتعلق الببتيد من خلال محطة C (على سبيل المثال، PEPSCAN صفائف pepchip 10، JPT صفائف pepspot 9 و INTAVIS صفائف celluspot 11) 4. الدعم القوي يمكن أن تختلف وهكذا يفعل كيمياء اقتران الببتيد إليها. يمكن تركيبها الببتيدات CYS لإنهاء الشرائح الزجاجية عبر مجموعة ثيول 12. وN محطة من الببتيد يمكن تساهميا منضما إلى مجموعة الهيدروكسيل على الغشاء السليلوز من خلال الأسترة من الأحماض الأمينية المرفقة 8. هنا نقدم بروتوكول مفصلة لفرز المصفوفات الببتيد كوسيلة لدراسة تفاعلات البروتين البروتين. مجموعة استخدمنا هي مجموعة Celluspots، وهي مجموعة صغيرة تحتوي على عمو كبيرالاتحاد الوطني للعمال من البقع (التكرارات تصل إلى 384 نقاط) على الغشاء السليلوز صغيرة تدعمها شريحة زجاجية. وهذا يتيح العمل مع كميات منخفضة من البروتين والأجسام المضادة والحصول على كمية كبيرة من البيانات في تجربة واحدة. يحتوي هذا مجموعة أيضا كثافة عالية الببتيد الذي يسمح الكشف عن انخفاض تقارب ملزمة. واستخدمت المصفوفة لرسم خرائط التفاعل STIL-CHFR، وهو أمر مهم للغاية للسيطرة تكاثر الخلايا العادية 13. تفاعل غير المنضبط بين اثنين من البروتينات يمكن أن يؤدي إلى تطور السرطان. عن طريق تعيين هذا التفاعل وجدنا موقع ملزم محدد والمخلفات 14 ملزمة. هذا يمهد الطريق لتصميم مثبطات العقلانية التي تحول دون هذا التفاعل البروتين البروتين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:231px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptide array</td>
			<td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">His-probe Antibody (H-3) HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8036 HRP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-ECL Kit</td>
			<td>Biological industries</td>
			<td>20-500-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Skim Milk</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:119px;">232100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LAS-3000 camera&#160;</td>
			<td>FUJI film</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying protein-protein interaction sites using peptide arrays

البروتين البروتين التفاعلات توسط معظم العمليات في الخلية والسيطرة التوازن الحية للكائن الحي. تفاعلات البروتين ضعف قد يؤدي إلى المرض، مما يجعل تفاعلات البروتين أهداف هامة المخدرات. وبالتالي فمن المهم جدا لفهم هذه التفاعلات على المستوى الجزيئي. يتم دراسة التفاعلات البروتينية باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التي تتراوح بين المقايسات الخلوية والكيموحيوية لفحوصات الفيزيائية الحيوية الكمية، وهذه يمكن أن يؤديها إما مع البروتينات كامل طول، مع مجالات البروتين أو مع الببتيدات. الببتيدات تخدم أدوات ممتازة لدراسة تفاعلات البروتين منذ الببتيدات يمكن تصنيعه بسهولة والسماح للتركيز على مواقع التفاعل محددة. صفائف الببتيد تمكن من تحديد مواقع التفاعل بين اثنين من البروتينات وكذلك الكشف عن الببتيدات التي تربط البروتين المستهدف لأغراض علاجية. أنها تسمح أيضا إنتاجية عالية دراسات ريال. لتحديد مواقع الربط، وtypiكال الببتيد عادة يحتوي على مجموعة متداخلة جزئيا 10-20 بقايا الببتيدات المستمدة من سلاسل كاملة من واحد أو أكثر من البروتينات شريك من البروتين الهدف المنشود. فحص مجموعة للربط البروتين المستهدف يكشف عن الببتيدات ملزمة، المقابلة لمواقع الربط في البروتينات شريك، في وسيلة سهلة وسريعة فقط باستخدام كمية صغيرة من البروتين. في هذه المقالة وصفنا بروتوكولا لفحص صفائف الببتيد لرسم خرائط مواقع التفاعل بين البروتين المستهدفة وشركائها. تم تصميم مجموعة الببتيد على أساس تسلسل البروتينات شريك مع مراعاة الهياكل الثانوية الخاصة بهم. كانت المصفوفات المستخدمة في هذا البروتوكول صفائف Celluspots بواسطة INTAVIS الآلات Bioanalytical إعدادها. تم حظر مجموعة لمنع غير محددة ملزمة ثم حضنت مع البروتين دراستها. الكشف باستخدام الأجسام المضادة يكشف الببتيدات ملزم المقابلة لمواقع محددة تفاعل بين البروتينات.

STIL هو بروتين centrosomal مهم للغاية. التي تسيطر عليها الانقسام الخلوي العادي وانتشار الخلايا 13،15 - 19. STIL يتفاعل مع العديد من البروتينات 18،20،21، ومعظم التفاعلات تحدث خلال دورها المركزي، وهي المنطقة المختلين جوهريا (IDR) 14. قمنا بتصميم مجموعة مكونة من الببتيد?...

Watch this Scientific Journal Video about Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays at JoVE.com

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

identifying-protein-protein-interaction-sites-using-peptide-arrays

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Video: Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

انقسام اليوبيكويتين الخميرة يستند الغشاء الهجين ثنائي (الأسطورة) النظام : أداة قوية لتحديد البروتين البروتين التفاعلات

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

تحديد البروتين البروتين التفاعل في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء الكبار حسب جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

تحليل خصوصية البروتين ليسين ميثيل عن طريق SPOT الببتيد صفائف

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

الجينوم على نطاق فحص التفاعلات بين البروتينات التي كتبها البروتين جزء التكملة الفحص (PCA) في الخلايا الحية

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...