فإن الكتاب أود أن أشكر مايكل Alifrangis وAbildtrup العلا للالتنميط الجيني من الطفيليات وهولم كريستينا للمساعدة التقنية الممتازة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (منحة 55005511)، ومؤسسة وندبيك (R9-A840 منحة) ومؤسسة نيلز بوهر.

1. جيل من تبدي الكريات الحمر المصابة مختارة فرشلي لهذا الفحص، ويتم الحصول على أفضل النتائج عند استخدام الثقافات اختيار طازجة للتعبير سطح PfEMP1 البروتين. في هذه التجربة سيما P. 3D7 وقد تم اختيار النسب المنجلية باستخدام الاجسام المضادة المحددة كما هو موضح سابقا 1. يوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد 200 ميكرولتر من خلايا الدم معبأة من P. المنجلية الثقافة التي تحتوي على 2-5٪ IE مرحلة متأخرة بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الدم في 2 مل من 37 ° C الحارة حل الجيلاتين 0.75٪ في أنبوب العقيمة 14 مل، ويترك لمدة 15-20 دقيقة في C ° 37 للسماح للIE غير مصاب وخاتم المرحلة إلى الرواسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد IE في وقت متأخر من المرحلة، أي مرحلة العليا، في أنبوب جديد 14 و مل يغسل مرتين مع 10 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 50 ميكرولتر من PfEMP محددة المضادة1 الأجسام المضادة في 2 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام وتصفية العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزج غسلها في وقت متأخر من مرحلة IE مع أمصال مضادة للتعقيم المخفف في أنبوب العقيمة 14 مل واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في 800 x ج لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرتين مع 10 مل من 37 ° C الحارة RBC غسل وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 50 ميكرولتر من البروتين Dynabead A مرتين مع التعليق RBC غسل وسائل الإعلام باستخدام DynaMaq-15 المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق على Dynabeads في 300 RBC وسائل الإعلام غسل ميكرولتر وإضافتها إلى IE وقت متأخر من مرحلة غسلها. احتضان لمدة 30 دقيقة في C ° 37 مع الإثارة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أنبوب إلى المغناطيس DynaMaq-15. ترك لمدة 1-2 دقيقة، وإزالة جميع السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق على Dynabeads في مل 4-5 من RBC غسل وسائل الإعلام. نقل مرة أخرى إلى أنبوب المغناطيس وترك الأمر لمدة 1-2 دقائق قبل إزالة كل السائل. كرر الخطوة غسل مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخرز غسلها إلى 25 سم 2 F الثقافة عقيمةاسك تحتوي على 200 ميكرولتر معبأة طازجة خلايا الدم الحمراء. إضافة 5-6 مل من وسائل الإعلام Albumax في الثقافة. بين عشية وضحاها في تخزين 5٪ CO 2 في 37 ° C. </li></ol> يوم 2 <ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة Dynabeads من الثقافة عندما IE اختيار واعادة احتلالهما في خلايا الدم الحمراء الطازجة عن طريق نقل كل ثقافة لأنبوب العقيمة 14 مل. وضع أنبوب على المغناطيس-15 DynaMaq وترك لمدة 1-2 دقيقة. ثم، من أجل عودة جميع السائل إلى قارورة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة ودورات أقل عدد ممكن حتى تطفلن الدم من 5-10٪ والطفيليات هي في ringstage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي تحليل IE من FACS للتأكد من أن النمط الظاهري سطح الصحيح، لقد تم الحصول على البروتين من أي تعبير إما and/orPF11_0008 PFD1235w 1. </li></ol> 2. إعداد مجسات تم إنشاء RNA تحقيقات العقاقير من أكثر المناطق متغير من PFD1235w وفار PF11_0008 &lt;/ م&gt; من الجينات P. المنجلية DNA 3D7 الجيني. تم تضخيم الحمض النووي عن طريق PCR والمستنسخة في ناقلات أو 19 لpSPT18 النسخ، على التوالي وفقا لوصف الشركة المصنعة (شركة روش). وصفت تحقيقات (أزواج قاعدة 580 (بي بي) و 590 BP في الطول) مع Digoxigenin (DIG) أو البيوتين باستخدام RNA DIG وضع العلامات كيت أو مزيج البيوتين وضع العلامات RNA، على التوالي. اكدنا على خصوصية كل من تحليلات تحقيقات طخة الشمالية وحيد التسمية تحليل FISH 1. 3. رقيقة مسحة من الطفيليات وتثبيت قبل في التهجين الموضعي يوم 1 يتم تنفيذ جميع الخطوات في بيئة خالية من ريبونوكلياز وجميع الكواشف ريبونوكلياز خالية أو ما قبل المعالجة مع pyrocarbonate اثيل (DEPC) أو ريبونوكلياز زاب (إينفيتروجن). يجب تنظيف الشرائح وتغطية زلات مع الكحول لإزالة الشحوم المتبقية التصنيع. من المهم لأداء بروتوكول دون أي توقف في الخطوات بينمن أجل تقليل مخاطر التلوث نوكلياز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم فيلم رقيقة الدم بواسطة الطريقة المعيارية نشر 3. باستخدام عدسة 100X من النفط الهدف المجهر، عد IE وحساب النسبة المئوية من IE في الثقافة. تأكد من أن الطفيلي في مراحل التزامن التقريبي، في حلقة ومراحل مبكرة من أتروفة دورة IE. هذه هي مرحلة ما قبل النسخ المتماثل، مراحل أحادي nucleate، معربا عن الجينات مرنا فار واحد ومناسبة لفحوصات الخلية النسخ FISH من هذا النوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 50 ميكرولتر من ثقافة الطفيلي، في تطفلن الدم من 5-10٪، إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف ريبونوكلياز خالية. الطرد المركزي ل1 دقيقة في 2،000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام وإضافة 50 ميكرولتر PBS درجة الحموضة 7.2 في DEPC المعالجة المائية. تستنهض الهمم الأنبوب بلطف. كرر الخطوة الترسيب الطرد المركزي مرتين لغسل خلايا خالية من وسائل الإعلام والحطام الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم أربعة جيدة مسحات رقيقة الجودة. لكل التشويه، تشويه جعل واحدة على1 قطرها 11 ملم جيدا من الشريحة 4 جيدا، والشرائح الزجاجية أي أربعة في المجموع، في هود ريبونوكلياز خالية (خطوة حاسمة). موجة الشرائح لفترة وجيزة في الهواء لتجف. جعل ثلاث شرائح إضافية لشريحة السلبية الضوابط واحد لتلطيخ واحد لتحقيق الجينات أي صلة أخرى باستخدام مسبار محددة، شريحة أخرى لتلقي العلاج وريبونوكلياز شريحة ثالث يتضمن IE لا يعبر عن الجينات في المصالح. ترك الشرائح لتجف على مقاعد البدلاء لمدة 10-20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأغشية الرقيقة من يضيف 60 ميكرولتر من محلول يحتوي على تثبيت بارافورمالدهيد 4٪ و 5٪ حمض الخليك الجليدية في الآبار. يترك لمدة 10 دقيقة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 2X الشرائح في SSPE العازلة لمدة 5 دقائق بواسطة التحريض في درجة حرارة الغرفة لطيف. إزالة السائل الزائد لفترة وجيزة عن طريق لمس الآبار التي تحتوي على الخلايا بلطف بمنديل ورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الشرائح مع البيبسين 0.01٪ في حمض الهيدروكلوريك M 0.01 عن 2 دقيقة عند 37 ° C (خطوة حرجة للغاية). غسل 2X الشرائح في SSPE لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الحل ريبونوكلياز إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل. تغطية مسحات المراقبة السلبية مع 60 ميكرولتر من محلول ريبونوكلياز. احتضان لمدة 30 دقيقة في C ° 37 وتغسل ثم الشرائح في SSPE 2X لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشروع فورا في الخطوة التهجين. </li></ol> 4. التهجين تحقيقات RNA على الشرائح الثابتة يوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة التهجين، مثل ThermoStar 100 HC4 أو تلميح ماصة فارغة مربع وضعت في فرن نظيفة، عن طريق الرش مع زاب ريبونوكلياز ومسحه بمنديل تنظيف الورق. ملء قنوات للغرفة التهجين أو الجزء السفلي من مربع مع DEPC المياه المعالجة للتأكد من أن الشرائح لن تجف خلال التهجين. إغلاق الغرفة وسخن إلى 48 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من تحقيقات في حل التهجين إلى تركيز النهائي من 12 نانوغرام / ميكرولتر. تفسد الحل التحقيق في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة التدفئة. البرد على الفور على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف لفترة وجيزة الشرائح بعد غسل 2X SSPE. إزالة السائل الزائد بعناية حول الآبار بمنديل ورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح غرفة التهجين ووضع الشرائح في الغرفة. تطبيق أحد أو كلا تحقيقات في وحدة تخزين ما مجموعه 60 ميكرولتر لكل بئر. تغطية بعناية قطرة السائل مع زلة غطاء ريبونوكلياز خالية باستخدام ملقط معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الغرفة وهجن الشرائح في C ° 48 للا يقل عن 16 ساعة خلال الليل. </li></ol> 5. اقتران الأجسام المضادة والتضخيم الإسفار يوم 2 وتستند الخطوات التالية على نظام TSA زائد الإسفار لوح من إلمر بيركن. تتم جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح 3 مرات في المخزن المؤقت TNT لمدة 5 دقائق مع التقليب لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الآبار في 150 ميكرولتر من العازلة TNB لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع HRP، مترافق α-DIG الأجسام المضادة في المخزن المؤقت TNB في نسبة 1:100 وHRP، مترافق الضد α-البيوتين في المخزن المؤقت TNB، بنسبة 1:500 من. إزالة أي العازلة TNB الزائدة من الشرائح بمنديل ورق. عندما كشف في وقت واحد 2 النصوص، يمكن كل من الأجسام المضادة تذهب في آن واحد. تطبيق بمبلغ إجمالي قدره 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في TNB جيدا وبعناية مع تغطية زلة غطاء. احتضان لمدة 2 ساعة الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تغطية زلات بعناية. غسل العازلة TNT الشرائح في 3 مرات لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع FITC-fluorophore في التضخيم كاشف tyramide في نسبة 1:500 وتطبيق 100 ميكرولتر من حل كل بئر. تغطية الآبار مع تغطية زلات واحتضان لمدة 12 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء ينزلق بعناية وغسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت بواسطة TNT التحريض لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع Cyan3-fluorophore في التضخيم كاشف tyramide في نسبة 1:500. إضافة 100 ميكرولتر فيكذلك من هذا الحل. تغطية الآبار مع تغطية زلات واحتضان لمدة 12 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء ينزلق بعناية وثم شطف الشرائح بسرعة عن طريق الغمر في المخزن المؤقت TNT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح 3 مرات مع العازلة TNT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج الشرائح بسرعة في DEPC المعالجة المائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الشرائح للهواء الجاف. تحميل الشرائح مع مكافحة تتلاشى كاشف تحتوي على دابي. ختم زوايا تغطية زلات بطلاء الأظافر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح جاهزة الآن للفحص المجهري. الحفاظ على الشرائح مغطاة رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية إذا كان التجربة هي ان تنجز في اليوم التالي. يمكن أن يتم الختم A كاملة من الجانبين من الشرائح يعمل 24 ساعة بعد تطبيق كاشف مكافحة تتلاشى. وهذا سوف يسمح ليمكن تصوير الشرائح لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد الانتهاء من البروتوكول. </li></ol> 6. التصور من مجسات تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على المجهر. A المجهر القياسية المناعي هو sufficient لهذا النوع من التجربة، ولكن إذا كان لديك الوصول إلى المجهر متحد البؤر يمكنك أيضا استخدام هذه الصور ل3D أو للحصول على مقاطع الفيديو الخاصة بك من الخلايا الملون. تسمح المجهر في عملية الاحماء ل15-30 دقيقة. التبديل على جهاز الكمبيوتر والبرمجيات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من جودة تلطيخ على المجهر المناعي. اختيار بقعة تحتوي على طفيليات قليلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الربح من كل الليزر يدويا. ضبط بكسل يسكن إلى 4-6 م -1 ق -1 و الخطوات إلى 512 بكسل 512 ×. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة لامدا الاختبار باستخدام الإطار. إعادة ضبط كسب الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ الحد الادنى من 20 صورة جيدة واحدة من الخلايا الفلورسنت. وهناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2-5 صور حقل يحتوي 5-20 الطفيليات من أجل الحصول على لمحة العادلة لنسبة الطفيليات إيجابية. </li></ol>

<ol>
	<li>Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+co-expression+of+two+different+PfEMP1+antigens+on+single+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+facilitates+binding+to+ICAM1+and+PECAM1.">Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1.</a> PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).</li><li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization.">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li><li>Cheeseborough, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> District Laboratory Practice in Tropical Countries. , (2006).</li><li>Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+transcription+of+duplicated+var2csa+gene+copies+in+individual+Plasmodium+falciparum+parasites.">Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites.</a> Genome Biol. 10, R117 (2009).</li><li>Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+associated+sense+and+antisense+noncoding+RNAs+are+transcribed+from+the+var+gene+family+of+virulence+genes+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum.">Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> RNA. 15, 116-127 (2009).</li><li>Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+heterochromatin+propagation+and+histone+acetylation+control+mutually+exclusive+expression+of+antigenic+variation+genes+in+malaria+parasites.">Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites.</a> Cell. 121, 25-36 (2005).</li><li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections.">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).</li><li>Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+non-coding+RNA+are+transcribed+from+the+centromeres+of+Plasmodium+falciparum+and+are+associated+with+centromeric+chromatin.">Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin.</a> J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).</li><li>Thompson, J., Sinden, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+Pbs21+mRNA+during+sexual+development+of+Plasmodium+berghei.">In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).</li><li>Thompson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+detection+of+RNA+in+blood-+and+mosquito-stage+malaria+parasites.">In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites.</a> Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).</li><li>Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progression+of+the+intra-erythrocytic+cell+cycle+of+Plasmodium+falciparum+and+the+role+of+the+centriolar+plaques+in+asynchronous+mitotic+division+during+schizogony.">The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony.</a> Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).</li><li>Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription.">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تحليل FISH RNA، وعلى النقيض من الأساليب مثل النشاف الشمالية وRT PCR-، يسمح التمييز النصوص مرنا محددة على المستوى خلية واحدة. هذا يجعل من الممكن التمييز بين الخلايا النشطة وغير النشطة transcriptionally، في هذا المثال، P. البروتوزوا الطفيلية المنجلية داخل خلايا الدم الحمرا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> حمض الخليك </td><td> سيغما / الدريتش </td><td> 338826-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Albumax وسائل الإعلام: RPMI حل الجلوتامين 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 مل RPMI 1640 محلول 5 مل الجلوتامين </td></tr><tr><td> Albumax وسائل الإعلام: جنتاميسين سلفات Albumax-الحل </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> جنتاميسين سلفات 2.5 مل 50 مل Albumax-الحل </td></tr><tr><td> Albumax-الحل: الهيبوزانتين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> H9377 </td><td> 0،8 ز الهيبوزانتين </td></tr><tr><td> Albumax-الحل: AlbuMAX II </td><td> أناnvitrogen </td><td> 11021-037 </td><td> 200 غ Albumax </td></tr><tr><td> Albumax-الحل: RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 4 لتر RPMI 1640 حل مع المغناطيس في حد أقصى. 50 ° C. تصفية تعقيم وتخزين في -20 درجة مئوية في مأخوذة. </td></tr><tr><td> Amberlite </td><td> سيجما </td><td> A5710-110G </td><td> الراتنج لdeionize الفورماميد. </td></tr><tr><td> مكافحة البيوتين البيروكسيداز PAB الماعز المتقارنة </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للحفر الأجسام المضادة </td><td> نوفوس البيولوجية </td><td> NB100-41330 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة تتلاشى مع كاشف دابي </td><td> إينفيتروجن </td><td> P36931 </td><td> وسائل الإعلام لديها تركيب لعلاج لمدة 24 ساعة قبل أن ينتزع الشريحة تماما. </td></tr><tr><td> البيوتين RNA وصفها ميكس </td><td&gt; روش </td><td> 11685597910 </td><td></td></tr><tr><td> كاميرا رقمية </td><td> نيكون الرقمية DC-F11 البصر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> منزل-جلاسر </td><td> 631-1570 </td><td></td></tr><tr><td> ثقافة قارورة 25 سم سطح Nunclon 2 </td><td> نونك </td><td> 156340 </td><td></td></tr><tr><td> DEPC </td><td> Fluka / سيجما </td><td> 32490-100ML </td><td> 1 مل DEPC في الماء 1000 مل deinonized. إضافة شريط ضجة ويحرك المزيج لمدة 12 ساعة. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. </td></tr><tr><td> كاميرا رقمية </td><td> نيكون الرقمية DC-F11 البصر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads البروتين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 10002D </td><td></td></tr><tr><td> DynaMaq-15 المغناطيس </td><td> إينفيتروجن </td><td> 123-01D </td><td></td></tr><tr><td> الفورماميد bioultra 99٪ </td><td> Fluka/ سيجما </td><td> 47671-1L-F </td><td> منزوع الأيونات الفورماميد: 5 غ من راتنج التبادل الأيوني لكل 100 مل من الفورماميد. يحرك المزيج 30 دقيقة. من خلال ورقة ترشيح WHATMAN. </td></tr><tr><td> . الجيلاتين 0 حل 75٪: الجيلاتين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G2500 </td><td> 3،75 ز الجيلاتين في 500 مل من RPMI 1640. الحرارة إلى 56 ° C إلى حل. تصفية تعقيم 56 ° C. عندما المحل في -20 درجة مئوية في مأخوذة. </td></tr><tr><td> . الجيلاتين 0 حل 75٪: 1640 RPMI </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 3،75 ز الجيلاتين في 500 مل من RPMI 1640. الحرارة إلى 56 ° C إلى حل. تصفية تعقيم 56 ° C. عندما المحل في -20 درجة مئوية في مأخوذة. </td></tr><tr><td> الجلوتامين الحل: L-glutamin </td><td> سيغما الدريخ </td><td> G3126 </td><td> الجلوتامين L 14،6 غرام في 500 مل من كلوريد الصوديوم 0،9٪. حل وتصفية قterilize وتخزينها في -20 درجة مئوية في مأخوذة. </td></tr><tr><td> الجلوتامين الحل: حمض الهيدروكلوريك </td><td> سيجما </td><td> H1758 </td><td> الجلوتامين L 14،6 غرام في 500 مل من كلوريد الصوديوم 0،9٪. حل، تصفية تعقيم وتخزينها في -20 درجة مئوية في مأخوذة. </td></tr><tr><td> حل التهجين: الفورماميد بيو جدا 99٪ SSC 20X </td><td> Fluka / سيجما </td><td> 47671-1L-F </td><td> المجموع 20 مل، والحفاظ على تجميد في -20 ° C مأخوذة في 10 مل الفورماميد منزوع الأيونات </td></tr><tr><td> حل التهجين: التركيز على Denhardt 50X </td><td> سيجما </td><td> D2532 </td><td> 5ml 20xSSC </td></tr><tr><td> حل التهجين: كاشف الخميرة حجب tRNARoche </td><td> سيجما </td><td> R-6750 </td><td> 2 مل 50X Denhardt في 250 ميكرولتر 20 ملغ لكل مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال </td></tr><tr><td><sترونج&gt; حل التهجين: سمك السلمون الحيوانات المنوية DNA </td><td> Fluka / سيجما </td><td> 31149-106GF </td><td> 0.4g روش حظر كاشف 1 مل من 10 ملغ في سمك السلمون مل DNA الحيوانات المنوية (الحرج: تفسد spermDNA السلمون في 96 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل إضافة إلى حل التهجين) </td></tr><tr><td> Hybridizer ThermoStar 100 HC4 </td><td> Quantifoil الآلات محدودة </td><td> 1004-0011 </td><td> ويمكن الاستعاضة عن الفرن التهجين التهجين وغرف ريبونوكلياز مجانا مبطن بالماء DEPC. </td></tr><tr><td> الغمر النفط UV شفافة مضان مجانا </td><td> سيجما </td><td> 10976-1EA </td><td></td></tr><tr><td> المناعي أو مبائر المجهر </td><td> نيكون D-الكسوف TE2000C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nailpolish </td><td> متوفرة في أي صيدلية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PBS 20X: كلوريد الصوديوم بوكل نا 2 HPO 4 × 2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC منزوع الأيونات H 2 O </td><td></td><td></td><td> Ajust درجة الحموضة إلى 7.4 160 غ 4 غرام 23 ز 4 غرام 1 لتر </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد 4٪ </td><td> Fluka / chemika </td><td> 76240 </td><td> PFA 4 غرام في PBS مل 80 / DEPC. الحرارة إلى 65 درجة مئوية حتى يذوب PFA. إضافة 20 مل PBS، تسمح الحل لتبرد. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تصفيتها. متجر في مأخوذة في -20 ° C. </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد 4٪ / حامض الخليك 5٪ </td><td></td><td></td><td> 950 + 50 ميكرولتر paraformaldhyde حمض الخليك ميكرولتر </td></tr><tr><td> البيبسين </td><td> سيغما / الدريتش </td><td> P7000 </td><td></td></tr><tr><td> البيروكسيديز، مترافق المضادة للالبيوتين </td><td> Calbiochem </td><td> 203206 </td><td></td></tr><tr><td> RBC غسل وسائل الإعلام: RPMI حل الجلوتامين 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-115F </td><td> 500 مل RPMI 1640 الجلوتامين 5 مل الحل </td></tr><tr><td> RBC غسل وسائل الإعلام: جنتاميسين سلفات </td><td> Lonza </td><td> BE02-012E </td><td> جنتاميسين سلفات 2.5 مل </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز </td><td> سيغما / الدريتش </td><td></td><td> جعل 10 ملغ / مل محلول المخزون. </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز الحرة أنبوب 1.5 مل </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز زاب </td><td> Ambion </td><td> AM9780 </td><td></td></tr><tr><td> الشرائح 4 آبار 11MM </td><td> الحرارية العلمية </td><td> MENZXER306W </td><td></td></tr><tr><td> SSC 20X: كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما / شركةdrich </td><td> S9625 </td><td> 3 M كلوريد الصوديوم (175 غرام / لتر) 0.3M 3 سترات الصوديوم X H 2 O (88 غرام / لتر) ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك 1M </td></tr><tr><td> SSC 20X: الصوديوم سترات يذوى </td><td> سيغما / الدريتش </td><td> W302600 </td><td> 3 M كلوريد الصوديوم (175 غرام / لتر) 0.3M 3 سترات الصوديوم X H 2 O (88 غرام / لتر) ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك 1M </td></tr><tr><td> SSPE 20X: كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما / الدريتش </td><td> S9625 </td><td> 175،3 ز كلوريد الصوديوم </td></tr><tr><td> SSPE 20X: ناه 2 ص 4 </td><td> سيغما / الدريتش </td><td> S0751 </td><td> 27،6 ز ناه 2 PO 4. </td></tr><tr><td> SSPE 20X: 4 EDTA مسحوق </td><td></td><td></td><td> 9،4 ز EDTA مسحوق إضافة الماء DEPC، وضبط درجة الحموضة 7.4. السياراتالعصا لمدة 20 دقيقة </td></tr><tr><td> TNB العازلة: العازلة TNT </td><td></td><td></td><td> 10 مل العازلة TNT </td></tr><tr><td> TNB العازلة: كاشف الحظر </td><td></td><td></td><td> 0.05g كاشف الحظر حل كاشف حظر، تسخين حل لC ° 60 لمدة ساعة مع التحريك. مخزن في -20 ° C. (مشتقة من إلمر بيركن TSA-البروتوكول.) </td></tr><tr><td> TNT العازلة: تريس / حمض الهيدروكلوريك </td><td> سيجما </td><td> T1503 </td><td> 1M تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0 </td></tr><tr><td> TNT العازلة: كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما الدريتش </td><td> S9625 </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> TNT العازلة: Tween20 </td><td> سيجما </td><td> 93773 </td><td> 5 M كلوريد الصوديوم 30 مل 1 مل DEPC DH 2 O869 مل ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.5 في درجة حرارة الغرفة. (مشتقة من إلمر بيركن TSA-البروتوكول.) </td></tr><tr><td> بالإضافة إلى TSA Cyanine3 / فلوريسئين النظام </td><td> بيركن إلمر </td><td> NEL753000IKT </td><td> قراءة البروتوكول من نظام TSA زائد الإسفار لوح بعناية قبل بدء التجربة. </td></tr><tr><td> 14 مل أنابيب معقمة </td><td> Almeco - CM LAB نقاط و </td><td> 91016 </td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of single-cell gene transcription by rna fluorescent in situ hybridization (fish)

وتوسطت التصاق الكريات الحمراء المنجلية من المصابين (IE) لمستقبلات البطانية الإنسان خلال الإصابة بمرض الملاريا بنسبة التعبير عن المتغيرات البروتين المشفرة بواسطة PfEMP1 الجينات فار. وفرداني P. المنجلية الجينوم تؤوي ما يقرب من 60 جينات مختلفة من فار الذي يعتقد الشخص الوحيد الذي كتب في الخلية في وقت الدم خلال المرحلة العدوى. كيف يتم تحقيق مثل هذه اللائحة يستبعد بعضها بعضا من النسخ الجيني فار غير واضح، كما هو تحديد الجينات الفردية أو فار مجموعات فرعية من الجينات المرتبطة فار المستقبلات المختلفة، وذلك من الربط الفرق على نتائج السريرية لP. المنجلية العدوى. مؤخرا، تم استدعاء النموذج النسخ يستبعد بعضها بعضا في شك من المقايسات النسخ يعتمد على الفردية P. تحديد نص في المنجلية واحد INFخلايا الدم الحمراء ected باستخدام RNA الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) تحليل النسخ الجيني فار من الطفيل في نوى الفردية P. IE المنجلية 1. هنا، نقدم بروتوكول مفصلة لتنفيذ منهجية RNA-FISH لتحليل النسخ الجيني فار في نوى وحيد من P. المنجلية المصابة الكريات الحمراء الإنسان. وتستند هذه الطريقة على استخدام digoxigenin والبيوتين التي تحمل علامات مضاد تحقيقات RNA باستخدام TSA زائد الإسفار لوح النظام 2 (بيركن إلمر)، P. التحليلات المجهرية وتحديد طازجة IE المنجلية. يمكن استخدام أسلوب التهجين في الموقع لمراقبة النسخ وتنظيم مجموعة متنوعة من الجينات التي أعرب عنها خلال مراحل مختلفة من P. المنجلية دورة الحياة، وقابلة للتكيف مع الأنواع الأخرى طفيل الملاريا وغيرها من الكائنات وأنواع الخلايا.

الشكل 1 يوضح المخطط الانسيابي من الخطوات الرئيسية والمدة الزمنية للمنهجية FISH RNA. هذه سلسلة من الصور ممثل بشكل جيد والحفاظ سيئة الملون التجارب FISH مرنا باستخدام واحد P. وتظهر المنجلية IE في الشكل 2. هذه الخ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH at JoVE.com

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

فلوري<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتحديد النصوص مرنا في الخلايا الفردية يسمح تحليل النشاط جينائي مثل النسخ في وقت واحد من أكثر من عضو واحد في<em&gt; فار</em&gt; الأسرة متعددة الجينات في<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; الكريات الحمراء المصابة<sup&gt; 1</sup&gt;. أسلوب قابل للتكيف ويمكن استخدامها على أنواع مختلفة من الخلايا والجينات والكائنات الحية.

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

analysis-single-cell-gene-transcription-rna-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

15.3K Views.  University of Copenhagen. فلوري في الموقع التهجين (FISH) لتحديد النصوص مرنا في الخلايا الفردية يسمح تحليل النشاط جينائي مثل النسخ في وقت واحد من أكثر من عضو واحد في فار الأسرة متعددة الجينات في المتصورة المنجلية الكريات الحمراء المصابة 1. أسلوب قابل للتكيف ...

Video: Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

في المختبر، والسد النسخ من مرنا luciferase المراسل Gaussia تلاه ترنسفكأيشن الخلية هيلا

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين في الأجنة جبل الجامعة وعلم الأنسجة الخلية مقتبس عن Elasmobranchs البحرية

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...