وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعهد الوطني للسرطان، CA131967.

1. BrdU التأسيس (وسم الطرفية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا لوحة لنحو 70٪ التقاء في زراعة الأنسجة 150 مم على مدار 24 ساعة طبق قبل إضافة BrdU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام كاملة جديدة تحتوي على 20 ميكروغرام / مل BrdU (سيغما) في نقاط الوقت المناسب قبل موسم الحصاد. تستزرع من خلايا طول الوقت في وسائل الإعلام مع BrdU سوف تختلف مع نوع من الخلايا والأنواع، وعادة المرحلة G2 تستمر ما بين 2 و 5 ساعة (الشكل 1). </li></ol> 2. حصاد كروموسوم الثقافات خلايا أحادي الطبقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من لوحة الثقافة وجمع 10 مل في أنبوب 15 مل المخروطية الطرد المركزي. تجاهل وسائل الإعلام المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا مرة واحدة مع 10 مل Versine [أو HBSS (سيغما)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل التربسين 0.25٪ في Versine (أو HBSS) لوحة. احتضان في درجة حرارة الغرفة حتى يتم فصل الخلايا من اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق trypsinized الخلية إلى أنبوب يحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 2.1. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة لخلايا بيليه. نضح طاف، وترك 0.5 مل من وسائل الإعلام بالإضافة إلى بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا بشكل دقيق من قبل pipetting مع ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 قطرات من محلول ناقص التوتر (0.075 M بوكل (سيغما) تحسنت إلى 37 ° C)؛ مزيج تعليق الخلية مع ماصة باستور. إضافة 0.5 مل حل ناقص التوتر وتخلط من جديد مع ماصة باستور. تحقيق حجم حل ناقص التوتر إلى 5 مل وتخلط مرة أخرى. احتضان في C ° 37 دقيقة ل20-45، اعتمادا على نوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح طاف، وترك 0.5 مل من وسائل الإعلام بالإضافة إلى بيليه الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه الخلية عبها بلطف الأنبوب. سوف تورم الخلايا osmotically يكون هشا في هذه المرحلة، ولذلك يجب الحرص على عدم تعطيل الأغشية السيتوبلازمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 قطرات من (حمض الخليك الجليدية 01:03: الميثانول) لCarnoy مثبت؛ مزيج من pipetting بلطف مع pipett باستوره. إضافة 0.5 مل مثبت ومزيج من pipetting بلطف ماصة باستور مع. تحقيق حجم 5 مل مثبت لوتخلط مرة أخرى عن طريق pipetting بلطف ماصة باستور مع. ويمكن تخزين الخلايا الثابتة في الظلام في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي ونضح كما في الخطوة 2.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه خلية في مثبت العذبة؛ تقدير حجم بيليه وإضافة 10X ~ حجم مثبت في Carnoy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تعليق الخلية قطرة من الحكمة على الرطب، والشرائح المجهر الجليد الباردة؛ الاستمرار على الشريحة بزاوية ° 45 ~ والسماح للتعليق الخلية في التدفق على سطح الشريحة. وضع شريحة مسطحة على مناشف ورقية والفيضانات الشريحة مع تثبيتي، وتسمح للهواء الجاف. تحقق الشرائح وجود فروق الإنقسامية باستخدام مجهر مقلوب. </li></ol> 3. ريبونوكلياز العلاج والجفاف الإيثانول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 200 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز A (سيغما) في SSC 2X إلى كل شريحة، واحتضان عند 37 ديز؛ مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسيل 3 مرات مع الشرائح SSC 2X، 7.0 درجة الحموضة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الشرائح من خلال سلسلة (سيغما) EtOH (70٪، 90٪ و 100٪) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء الجاف الشرائح في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 4. إعداد الكوكتيلات دقق في BAC زائد كروموسوم معين السنترومير دقق تعداد (CEP) أو للدهانات كروموسوم كامل في الموقع التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتهجين BAC / CEP في وقت واحد، وإعداد 2 الكوكتيلات التحقيق منفصلة عن التهجين مسبقة. لقد وجدنا أن ما قبل التهجين والتحقيقات BAC CEP بشكل منفصل تحت stringencies نتائج مختلفة في أقل الخلفية وشدة أكبر الإشارة. كما وجدنا أنه يمكن أيضا أن تستخدم Fosmids الفردية بدلا من استنساخ BAC. صياغة كوكتيل موضح أدناه يمثل حجم لشريحة واحدة. إذا تجهيز عدة شرائح باستخدام نفس تحقيقات ببساطة زيادة حجم appropr<html> iately. * BAC كوكتيل DNA التحقيق: 11،5 العازلة التهجين ميكرولتر (50٪ الفورماميد (سيغما) / 2X SSC / دكستران كبريتات (سيجما)) 2 ميكرولتر DH 2 O 2،5 ميكرولتر BAC/Cot1 DNA في DH 2 O (انظر أدناه لوصفها بروتوكول) 15 إجمالي حجم ميكرولتر * كوكتيل CEP التحقيق: 7 التهجين العازلة ميكرولتر CEP (65٪ Formamide/2x SSC / دكستران كبريتات) 2 ميكرولتر DH 2 O 1 ميكرولتر الحمض النووي CEP/Cot1 (شراؤها prelabeled مع الطيف الأحمر Orange/Cy3/Texas) 10 إجمالي حجم ميكرولتر * بعد تغيير طبيعة وقبل التهجين (الخطوة 5.1) مزيج BAC التحقيق مع التحقيق CEP في 03:02 نسبة 25 الكوكتيلات التحقيق ميكرولتر / الشرائح والمزيج. OR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 20 ميكرولتر / الشريحة من الجامعة كروموسوم التحقيق الدهانات (Cy3/Texas الأحمر) في أنبوب. انتقل إلى الخطوة تمسخ وقبل التهجين. </li></ol><html> &quot;&gt; 5. الشرائح وتمسخ ودقق في الموقع التهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد التحقيق كوكتيل (ق) في 75 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. في C ° 37 قبل هجن مقابل 30 دقيقة للسماح للDNA Cot1 لهجن لتسلسل المتكررة ومنع التهجين بعد الطورية الكروموسومات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح تفسد في الجرار Coplin في SSC Formamide/2x 70٪، درجة الحموضة 7.0 عند 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى على الفور من خلال سلسلة الشرائح EtOH (70٪، 90٪ و 100٪) في الجرار Coplin عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح للهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة الشرائح إلى 45 ° C على الشريحة الأكثر دفئا ل10 دقيقة الأخيرة من التحقيق قبل hybridzation (الخطوة 5.1). مزيج الكوكتيلات التحقيق قبل المهجنة إذا لزم الأمر وإضافة 25 ماي إلى كل شريحة، وضع بلطف ساترة على كل شريحة وختم على طول الحواف مع الاسمنت والمطاط. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في غرفة مرطب لمنع التبخر. </li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. التهجين آخر يغسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح في الجرار Coplin 3 مرات في SSC formamide/2x 50٪، ودرجة الحموضة 7.0 في C ° 38-40 دقيقة لمدة 3 لكل منهما. قد درجة حرارة تتراوح بين تحقيقات يغسل. إذا كان هناك ارتفاع التهجين الخلفية يمكنك زيادة درجة حرارة يغسل. على العكس، إذا كانت الإشارة ضعيفة وليس هناك خلفية ثم يمكنك تقليل درجة حرارة هذه يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح العازلة 1 مرة في PN في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق، وانتقل إلى الخطوة الكشف BrdU. </li></ol> 7. كشف BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح العازلة مع كتلة PNM لمدة 10 دقيقة (200 ميكرولتر / الشرائح) في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزاف الشرائح عن طريق تشغيل ميزة على منشفة ورقية. إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة BrdU-FITC (50 ميكروغرام / مل أو ميليبور روش) في المخزن المؤقت PNM لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات في الشرائح العازلة PN في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنزافPN الزائدة عازلة على الشرائح في وقت واحد عن طريق تشغيل ميزة على منشفة ورقية. إضافة 20 ميكرولتر دابي / antifade تصاعد الحل (إينفيتروجن). تغطية الشريحة مع منشفة ورقية ثم اضغط لأسفل على ساترة لطرد فقاعات الهواء ويزيد تصاعد الحل. انتقل إلى تحليل الصور. </li></ol> 8. التقاط الصور وقياس BrdU التأسيس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التقاط الصور مع مجهر BX61 أوليمبوس الكاميرا أوليمبوس ونيون CCD، آلية موضوعية 100X عجلة تصفية وCytovision البرمجيات التطبيقية (التصوير). يتم التقاط BrdU باستخدام عامل تصفية FITC؛ الدهانات كروموسوم (تكساس الأحمر، Metasystems أو Cytocell)، يتم التقاطها في BAC (Cy3) وتحقيقات CEP (Vysis الطيف أورانج) باستخدام الأحمر تكساس أو تصفية Cy3؛ يتم التقاط دابي مع تصفية دابي (انظر أرقام 2 و 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تحديد الكروموسومات الفردية في المصالح مع BAC / CEP أو تحقيقات كروموسوم معين الطلاء (أرقام 2B 3B و). استخدامالبرنامج Cytovision، كل كروموسوم من الفائدة هو &quot;خفض التدريجي&quot; من انتشار الطورية ككل، يتم رسم خط من خلال على طول الكروموسوم من الذراع القصير الذراع الطويلة ل(أرقام 2C و 3C). ويستخدم البرنامج Cytovision لقياس كثافة بكسل الملف على طول كل كروموسوم. البرنامج Cytovision بحساب المساحة التي شغلتها بكسل والكمي لشدة البيكسلات ممثلة إشارات BrdU أو دابي على كل كروموسوم معزولة. ثم يتم ضرب كثافة بكسل متوسط ​​يمثله كل كروموسوم من المنطقة التي تحتلها تلك بكسل للحصول على العدد الإجمالي للبكسل (الجدول 1 والشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا البروتوكول لتصور المناطق أحدث تكرار الكروموسومات. وفقا لذلك، فإن نمط النطاقات التأسيس BrdU يسمح للكشف عن مناطق من الكروموسومات تكرار بنشاط، والاختلاف في توقيت النسخ المتماثل بين CHROMOSوينظر أزواج OME عن الاختلافات في هذا النمط النطاقات (أرقام 2 و 3). وأخيرا، يمكن مقارنة هذه الاختلافات في أنماط ملزمة ليعرف خرائط توقيت النسخ المتماثل لكل كروموسوم 6،7، والذي يسمح لتقدير تكرار الفرق بين التوقيت الكروموزومات المتماثلة أو الأسلحة الكروموسوم 4. على سبيل المثال، كروموسوم 2 6 &#39;في الشكل 3A عرض الفرق في النطاقات نمط ساعة 2&gt; بالمقارنة مع توقيت النسخ المتماثل العادي من كروموسوم 6 4. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء مماثل لتلك الموصوفة هنا استخدمت بنجاح لدراسة توقيت متزامن النسخ المتماثل بين الكروموسومات X غير نشط وفعال 8،9. تم التعرف على الكروموسومات X النشطة وغير النشطة باستخدام الدهانات كروموسوم X. تم الحصول عليها باستخدام الصور المزح mFISH البرمجيات (Vysis) وعدد بكسل التي تحتلها الكروموسومات X وعدد وحدات البكسل التي تحتلها لا fluorescentlyثم تم حساب beled BrdU باستخدام صورة NIH ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a> ). </li></ol> 9. نيك ترجمة DNA BAC لوصفها نيون (Vysis) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مزيج التحقيق التالي لبرود أنبوب microfuge: 70 ميكرولتر (4 ميكروغرام DNA) في DH 2 O 0.2 ملي مول 10 ميكرولتر dUTP-البرتقالي أو الأخضر 0.1 ملي مول 20 ميكرولتر dTTP 20 ميكرولتر العازلة 10X ترجمة نيك 40 ميكرولتر NT dNTP ل(ناقص dTTP) 40 ميكرولتر ترجمة نيك انزيم 200 إجمالي حجم ميكرولتر احتضان @ 16 ° CO / N. وقف رد الفعل عن طريق التسخين في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. البرد على الجليد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترسيب DNA مع الإيثانول عن طريق إضافة ما يلي إلى هذا المزيج التحقيق: 200 ميكرولتر حل التحقيق 48 ميكرولتر 3 M NaOAc 160 ميكرولتر Cot1DNA (.25 ميكروغرام / UL) 1200 ميكرولتر EtOH 100٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحل في -80 ° C لمدة 10 دقيقة لO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور طن الباردة في 12000 x ج لمدة 20 دقيقة. صب قبالة EtOH. غسل 1 مرة مع EtOH 70٪. تدور كما كان من قبل. صب قبالة EtOH. الهواء الجاف فقط حتى يتبخر EtOH. resuspend في 40 ميكرولتر O 2 درهم للتركيز النهائي من 100 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي BAC. </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

إعداد ينتشر الكروموسومات هي خطوة حاسمة لفحص النسخ المتماثل توقيت الناجحة الموصوفة هنا. قد إدراج خطوة المعالجة colcemid قبل العلاج ناقص التوتر مساعدة في تواتر ونشر الخلايا التفتلي. علينا أن نفضح عادة الخلايا لcolcemdi للموارد البشرية 1-3 قبل الحصاد، واستخدام colcemid عند تركيز ا?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> مكافحة BrdU-FITC </td><td> روش ميليبور </td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50 ميكروغرام / ميكرولتر </td></tr><tr><td> نيك ترجمة كيت </td><td> ابوت الجزيئية (Vysis) </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td> الطيف أورانج dUTP </td><td> ابوت الجزيئية (Vysis) </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td> ابوت الجزيئية (Vysis) </td><td> يختلف </td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCP التهجين العازلة </td><td> ابوت الجزيئية (Vysis) </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEP التهجين العازلة </td><td> ابوت الجزيئية (Vysis) </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td> كروموسوم باياليلة </td><td> MetaSystems المجموعة </td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td> OLYMPUS BX61 مجهر نيون </td><td> OLYMPUS </td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td> نظام التصوير البرامج المجهر </td><td> التصوير التطبيقية </td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td> كاميرا رقمية </td><td> OLYMPUS </td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> في وصفات الموقع التهجين الفورماميد حلول 70٪ Formamide/2x SSC * 35 مل الفورماميد (سيغما) 10 مل SSC 10X 5 مل د 2 H 2 0 الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك (سيغما) * ومن المهم استخدام الفورماميد التي تم تخزينها في -20 درجة مئوية. سوف المطولة تخزين درجة حرارة الغرفة توليد حمض الفورميك وث الرقم الهيدروجينييكون مريضا منخفض جدا. 50٪ Formamide/2x SSC 25 مل الفورماميد (سيغما) 10 مل SSC 10X 15 مل DH 2 O الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 مع حمض الهيدروكلوريك (سيغما) 20X SSC، 4 L 702 غرام كلوريد الصوديوم (سيغما) 358 ز نا السيترات (سيغما) DH 2 O إلى حجم PN الاحتياطي [0.1 M 4 0.1٪ NaP0 NP_40 (سيغما)] جعل حل 0.1 M كل من فوسفات الصوديوم (تصفية تعقيم وتخزين في مليلتر مأخوذة 500). 0.1 M ناه 2 P0 4، 1 L 13،8 ز ناه 2 P0 4 (سيجما): DH 2 O إلى حجم 0.1 M ناه 2 P0 4 1 L </strاونج&gt; 14،2 ز ناه 2 P0 4 (سيغما) DH 2 O للحجم. PN: ضبط درجة الحموضة من 0.1 M نا 2 HP0 4 إلى الرقم الهيدروجيني 8.0 مع 0.1 M ناه 2 P0 4. تصفية تعقيم وإضافة 1 مل من NP-40. PNM 50 مل 1.25 غرام من الدهون غير الحليب الجاف (سيغما) PN 25 مل العازلة (وصفة أعلاه) مزيج ل15-20 دقيقة مع التحريك المستمر. تدور 2 مرات في 400 x ج لمدة 10 دقيقة. استخدام طاف، وتأكد من عدم الإخلال بروتينات الحليب عجلت. </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

الثدييات تكرار الحمض النووي يبدأ في مواقع متعددة على طول الكروموسومات في أوقات مختلفة خلال المرحلة S، وبعد تكرار برنامج الزمني. ويعتقد مواصفات توقيت النسخ المتماثل لتكون عملية ديناميكية ينظمها العظة الأنسجة الخاصة والتنموية التي تستجيب لتعديلات جينية. ومع ذلك، فإن آليات تنظيم أين ومتى يبدأ على طول تكرار الحمض النووي الكروموسومات لا تزال غير مفهومة تماما. مثلي الكروموسومات تكرار عادة بشكل متزامن، ولكن هناك استثناءات لهذه القاعدة البارزة. على سبيل المثال، في خلايا الثدييات أنثى واحدة من اثنين من الكروموزومات العاشر يصبح تكرار أواخر خلال عملية تعرف باسم تعطيل X 1. جنبا إلى جنب مع هذا التأخير في توقيت النسخ المتماثل، تشير التقديرات إلى أن 2-3 ساعة، تصبح إسكات transcriptionally غالبية الجينات على الكروموسوم X واحد. بالإضافة إلى ذلك، منفصلة رابطة الدول المستقلة موضع المفعول، والمعروفة باسم مركز تعطيل X، ينظم هذه العملية تعطيل X، بما في ذلك الالحث (ه) من توقيت تكرار تأخر على كروموسوم X غير نشط بأكملها. وبالإضافة إلى ذلك، إعادة ترتيب الكروموسومات الموجودة في بعض خلايا السرطان والخلايا في تعرضوا للإشعاع المؤين عرض تأخير كبير في توقيت تكرار&gt; 3 ساعات يؤثر على كروموسوم كامل 2،3. العمل الأخير من المختبر إلى أن تعطل منفصلة رابطة الدول المستقلة المفعول جسمية مواضع نتيجة لتكرار النمط الظاهري في أواخر غاية التي تؤثر على ال 4 كروموسوم كامل. دراسات &#39;الهندسة كروموسوم&#39; إضافية تشير إلى أن إعادة ترتيب الكروموسومات معينة تؤثر على العديد من الكروموسومات نتيجة مختلفة في هذا النمط الظاهري النسخ المتماثل توقيت غير طبيعية، مما يدل على أن جميع الثدييات تحتوي على الكروموسومات منفصلة رابطة الدول المستقلة المفعول مواضع التي تتحكم السليم توقيت تكرار الكروموسومات الفردية 5. هنا، نقدم طريقة لتحليل الكمي للتوقيت تكرار كروموسوم جنبا إلى جنب مع الفلورسنت في الموقع التهجين. هذاالأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة لتوقيت النسخ المتماثل بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية نفسها، وجرى تكييف في الفترة من 6. وبالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا الأسلوب لتحديد لا لبس فيه من إعادة ترتيب الكروموسومات التي ترتبط مع التغيرات في توقيت النسخ المتماثل التي تؤثر على كروموسوم كامل. هذا الأسلوب له مزايا أكثر وضعت مؤخرا مجموعة صغيرة عالية الإنتاجية أو التسلسل البروتوكولات التي لا يمكن التمييز بين الأليلات مثلي على تقديم ترتيبها وإعادة ترتيبها من الامم المتحدة والكروموسومات. وبالإضافة إلى ذلك، لأن الأسلوب هو موضح هنا يقيم الخلايا واحدة، فإنه يمكن الكشف عن التغييرات في توقيت تكرار كروموسوم على إعادة ترتيب الكروموسومات الموجودة في جزء فقط من الخلايا في السكان.

ويرد مثال على تكرار تحليل توقيت الكروموسوم البشري 6 في الشكل 2. تعرضت الخلايا التي تحتوي على الجين حذف ASAR6 4، يقع في 6q16.1، لBrdU لمدة 5 ساعة، تحصد للخلايا الإنقسامية وتجهيزها للأسماك مع الطلاء التحقيق كروموسوم 6 (Vysis) وBrdU التأسيس. نلاحظ أن هناك فرقا كبيرا في ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization at JoVE.com

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

يوصف أسلوب الكمي لتحليل توقيت تكرار كروموسوم. يستخدم الأسلوب BrdU التأسيس بالاشتراك مع الفلورسنت<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH) لتقييم توقيت تكرار الكروموسومات الثدييات. هذا الأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة من الكروموسومات إعادة ترتيب وإعادة ترتيب للامم المتحدة داخل الخلية نفسها.

التوقيت كروموسوم النسخ المتماثل جنبا إلى جنب مع نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K Views.  Oregon Health & Science University. يوصف أسلوب الكمي لتحليل توقيت تكرار كروموسوم. يستخدم الأسلوب BrdU التأسيس بالاشتراك مع الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH) لتقييم توقيت تكرار الكروموسومات الثدييات. هذا الأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة من الكروموسومات إعادة ترتيب وإعادة ترتيب للامم المتحدة دا?...

Video: Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

جبل كله<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من E8.5 لأجنة الفئران E11.5

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

في الموقع التهجين لتوطين دقيقة من النصوص في النباتات

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

الإنتاجية العالية لرسم الخرائط المادية للالكروموسومات باستخدام الآلي<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...