وأيد هذا العمل من قبل مركز العلاج التجديدي، وكلية الطب في دريسدن TU، ومركز البحوث التعاونية DFG SFB655 (A20 الفرعي). وأيد من قبل BA زمالة من برنامج الحفريات-BB، دريسدن. نشكر الدكاترة. نوريكو Osumi، نومورا تاداشي، ديتر كذبة Chichung، ورافي Jagasia للحصول على المشورة الثمينة خلال إنشاء الصعق الكهربائي في الرحم والحقن الفيروسية التجسيمي.

ملاحظة أولية يجب إجراء الجراحة من قبل المحققين المدربين بشكل كامل بناء على موافقة من السلطات المحلية لرعاية الحيوان. ويجب اتخاذ جميع الاحتياطات للحد من الألم والإجهاد الذي أصاب الحيوان بما في ذلك التخدير العميق، وإدارة التسكين بعد العملية الجراحية، وبالنسبة لعمليات استمرت أكثر من 10 دقيقة، وتطبيق لزيوت التشحيم لمنع الجفاف العين القرنية وفقدان البصر. يجب أن تبقى الفئران تخدير الدافئة باستمرار عند 37 درجة مئوية حتى الشفاء التام وكل أداة جراحية والحل يجب أن يكون معقم. على الرغم من أن استخدام غطاء البيولوجية ليست ضرورية تماما، يتعين على المشغل اتخاذ جميع الاحتياطات المعقولة لتقليل إمكانية إصابة الحيوان أثناء عملية من خلال ارتداء معطف المختبر، وقناع، وقفازات. وبالمثل، يجب أن يؤذن في كل خطوة بشأن توليد واستخدام الفيروسات ويجب إجراء في المناطق S2 وفقا للوائح السلطات المحلية.وأخيرا، لا بد من إجراء إزالة التلوث شامل لجميع الأدوات والأسطح التي كان يمكن أن تكون على اتصال مع فيروسات وفقا لممارسات التطهير وافق مرفق (لفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق محو مع 70٪ ET-OH و / أو التعقيم). الجزء 1: توسيع مجلس الأمن القومي الجنينية 1. في الرحم الصعق الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استنساخ جينات منقولة (أي cdk4/cyclinD1) في PCMS-EGFP (Clontech) أو pDSV-mRFPnls ناقلات 16، تنقية البلازميدات باستخدام عدة EndoFree و resuspend في برنامج تلفزيوني العقيمة إلى تركيز من 3-5 ميكروغرام / ميكرولتر. قريبا قبل الجراحة، مزج البلازميدات مع FastGreen 0.05٪ في برنامج تلفزيوني في نسبة النهائي من كاليفورنيا. وأجهزة الطرد المركزي 04:04:01 الخليط لمدة 2 دقيقة في 16000 XG لإزالة رواسب جميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خليط الحمض النووي في الزجاج البورسليكات سحبت سابقا الشعرية. سحب المعلمات باستخدام P-97 ماصة مجتذب هي: سحب: 200؛ VEL: 140؛ الوقت: 140. وتعطى الحرارة عن طريق اختبار منحدر ويعتمد على المواصفاتتستخدم الكثير من الشعيرات الدموية IFIC. تحميل الشعرية على فوهة من PicoPump التي تقع بالقرب من منصة الصعق الكهربائي في الرحم (الشكل 1A)، وتحت stereomicroscope، ينحني طرفها ونيك أنه عند نقطة انعطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات جراحة التعقيم في الزجاج حبة الجافة وتخدير عميق ماوس الحوامل في يوم 12-15 من الحمل باستخدام المرذاذ isoflurane. وضع الحيوان في موقف ضعيف على منصة وضعت في التدفئة 37 ° C ويبقي قيد الإدارة isoflurane مستمرة من خلال مخروط الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق جلد البطن، مع تطهير مرات Betaisodona متعددة، في نهاية المطاف في القضاء بين مع الايثانول 70٪، وحقن البوبرينورفين (مخففة في PBS) تحت الجلد عند 0.1 ملغم / كغم من التركيز ومسكن وقائي. باستخدام مقص غرامة، وجعل قطع طولية 2 سم من الجلد، وبالتالي، من الجدار العضلي الكامنة للوصول إلى التجويف البريتوني. الاستغناء في كاليفورنيا التجويف البريتوني. 2prewarmed مل من محلول IUE (D-PBS تحتوي على 100 U / مل من القلم / بكتيريا) في 37 ° C والحفاظ على الحل على كتلة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الفأر مع drap معقمة تحتوي على الشق الذي سيتم إزالة الرحم. التراجع عن شق باستخدام مبعاد التنغستن، وتحديد الرحم وتخلعها عقده مع ملقط بين الأجنة المجاورة (1B الشكل؛ يسار) ووضع عليه أخيرا على drap العقيمة. خلال العملية برمتها، وشطف الرحم بمحلول IUE لترطيب تجويف الجسم والاعضاء ومنع الجفاف من الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الرحم بعناية عقد بين الإبهام والسبابة وجنين واحد حتى تتحول رأسه مرئيا وموجهة نحو المشغل. تحديد نصفي الكرة الدماغ الانتهائي وحقن واحد منهم من الجانب ظهراني الجانبية. الإفراج 1-2 ميكرولتر من محلول الحمض النووي باستخدام footswitch من PicoPump حتى يرد البطين بواسطة FastGreen (1B الشكل، والحق). </li><lأنا عملت&gt; وضع القطب الموجب من الأقطاب الكهربائية على موقع الحقن والقطب السالب على الجانب المقابل (الشكل 1C) وتقديم 6 البقول من 30 V لمدة 50 مللي مللي مع فاصل بين كل نبضة 950 باستخدام electroporator توليد مربعة الشكل المجالات الكهربائية من خلال footswitch. تجنب وضع الأقطاب على مقربة من المشيمة لأن هذا قد يسبب نزيف وتلف الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم حقن جميع الأجنة وelectroporated، ضع الرحم مرة أخرى إلى تجويف البطن وإغلاق الجدران العضلات مع سلسلة خياطة خياطة كل مم 3-4. يجب أن تكون عقدة دافئ إلى العضلات ولكن ليس ضيقا جدا للسماح تورم قليلا من الأنسجة. وأخيرا، أغلق الجلد المغطي باستخدام مقاطع معدنية. تطهير الجلد مع Betaisodona، إزالة الماوس من قناع isoflurane وتحويلها في قفص الإسكان عندما مستيقظا تماما. رصد الانتعاش من الماوس حتى السلوك الحركي أمر طبيعي. </li></ol> 2. تجهيز سامPLE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد أو أكثر يوما بعد الصعق الكهربائي والتضحية الماوس، وجمع الأجنة وتحديد تلك electroporated بشكل صحيح باستخدام stereomicroscope الفلورسنت (1D الشكل). تشريح أدمغة على الجليد الباردة PBS، بين عشية وضحاها واصلاحها في PFA 4٪ (الرقم الهيدروجيني في بارافورمالدهيد العازلة الفوسفات 7.4). في نهاية المطاف، ويمكن أن تدار BrdU قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق حركية دورة الخلية وانتشار الخلايا 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم معالجة أدمغة لتقطيع والمناعية للعلامات عدة من الخلايا الدبقية شعاعي، أسلاف الخلايا العصبية القاعدية و(Pax6، Nestin، Tbr2، Tbr1، Tuj1 الخ) لتقييم تأثير الجينات المحورة وظيفية على NSC المستهدفة والتي هي ذرية التي حددها التعبير عن الجينات مراسل شارك في electroporated. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1.الصعق الكهربائي في الرحم. (A) تمثيل تخطيطي لمنصة الصعق الكهربائي في الرحم. (B) رسومات تبين المواقع من خلال عملية جراحية الماوس الحوامل (يمين) وحقن الخليط DNA / FastGreen (الأزرق) في نصف الكرة الدماغ الانتهائي من جنين أحد الفئران (يسار). (C) مخطط يبين وضع الأقطاب على اتصال مع جدران الرحم مع القطب الموجب (+) المجاورة لمكان الحقن (الأزرق). تبين الأسهم هجرة DNA نحو القطب الموجب. (D) صورة لساعة الماوس الجنين بعد 24 الصعق الكهربائي مع البلازميدات GFP في يوم الجنينية 13. خط متقطع ترسم نصف الكرة الدماغ الانتهائي. مخطط في A 17 2004 معدلة من Calegari وآخرون،. الجزء 2: توسيع مجلس الأمن القومي الكبار 1. إنتاج جزيئات فيروسية فيروس نقص المناعة البشرية المستمدة من <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1: لوحة 5 × 10 6 خلايا 293T على 10 سمطبق مع 8 مل من D-MEM تحتوي على 10٪ من مصل الجنين البقري الحرارة المعطل و 100 U / مل من القلم / بكتيريا (مستنبت). استخدام 15 أطباق لمدة إعداد الفيروسية والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2: لكل طبق، تمييع في 1 مل من السهل 5 D-ميكروغرام لكل MEM من 3 البلازميدات ترميز لط) VSVG البروتين المغلف (حويصلي نوع الفيروس التهاب الفم G)، والثاني) هفوة / POL (مجموعة محددة مستضد / البلمرة) ، والثالث) لبناء متعدد المقارين التعبير عن الجينات المحورة وظيفية مراسل (أي cdk4/cyclinD1/GFP) المستنسخة من قبل في نقل فيروس نقص المناعة البشرية ناقل القائم (p6NST90) 9. خلط هذا الحل مع 1 مل من D-MEM تحتوي على 45 ميكرولتر من polyethylenimine الذي تم حله قبل في PBS في 1 ملغ / مل محلول المخزون، واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، إزالة وسائل الإعلام من الخلايا وإضافة 4 مل لكل طبق من جديد D-MEM تحتوي على 15٪ من مصل بقري جنيني الحرارة المعطل و 100 U / مل من القلم / بكتيريا. إضافة م 2لتر من خليط ترنسفكأيشن وبين عشية وضحاها الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط إضافة 120 ميكرولتر من 500 ملم في طبق لتعزيز التعبير عن الجينات المحورة نا بوتيرات، بلطف والثقافة لمدة 6-8 ساعة بعد ذلك استبدال المتوسطة ترنسفكأيشن مع 5 مل من مستنبت: اليوم 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 4: جمع supernatants (حوالي إجمالي مل 70)، لتمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون ونقل أنابيب الطرد المركزي في 2 polyallomer (35 X 89 ملم). نابذة فائقة السرعة في 110،000 x ج لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ. تجاهل طاف، إضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة. إعادة تعليق بيليه وتحويلها في واحدة polyallomer أنبوب الطرد المركزي (14 × 95 مم). نابذة فائقة السرعة في 110،000 x ج لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ. تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، جعل 5 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -80 درجة مئوية. وسوف يكون عيار الفيروسية في حدود 10 8 وت 9 -10 / مل. (ملاحظة: الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة والتخزين، AVOمعرف إعادة تجميد، والحفاظ على الثلج الجاف أثناء النقل وذوبان الجليد قريبا قبل الاستخدام.) </li></ol> 2. التجسيمي الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس 6-10 أسابيع من العمر مع isoflurane ووضع الحيوان في موقف المعرضة على إطار التجسيمي (الشكل 2A) باستخدام قضبان الأذن والحنك الدعم لإصلاح صحيح الرأس. يتم الاحتفاظ الحيوانات الحارة على وسادة التدفئة وضعت في C ° 37 وتحت إدارة isoflurane ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن تحت الجلد 100 ميكرولتر من محلول البوبرينورفين يعمل وقائية مسكن، يحلق شريط من الجلد على الرأس من الفأرة، وكما هو موضح في desinfect 1.4. باستخدام مشرط، وجعل كاليفورنيا. 1.5 سم طويلة شق طولي على الجلد الرأس كاشفة عن الجمجمة في مستوى خياطة السهمي. سحب الجلد بلطف وتنظيف سطح العظام مع برعم القطن المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصف ملء كوب الشعرية (المواصفات في 1.2) مع زيت البارافين وتركيبها على مضخة حقن إدراجوشعري حتى الدائري الثاني (الشكل 2B). نقل صاحب الشعرية في محور X و Y و Z حتى يتم وضع غيض من شعري على bregma، نقطة بالتزامن بين الغرز السهمي والجانبية (الشكل 2C) (يتم تحديدها مع مساعدة من stereomicroscope)، و إعادة مجموعة X، Y، Z والقيم إلى 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشعرية مم 1.6 ± في محور ميديو الاطراف (X) ومم -1.9 في المحور الأمامي الخلفي (ص) وبمناسبة العظام باستخدام قلم علامة الجراحية. جعل ثقب من كاليفورنيا. 0.5 مم القطر على الجمجمة باستخدام الحفار الكهربائي مع إيلاء اهتمام لا للاساءة الى الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرات 5 ميكرولتر من التعليق الفيروسي (1 قسامة) على قطعة من parafilm توضع على الأذن والحانات immerge غيض من الشعرية في الحبرية. تمتص كاليفورنيا. تعيين 3،5 ميكرولتر من التعليق الفيروسية باستخدام محقن نانولتر في 55 NL / ثانية. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة مع قطرات تتبخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شعري لموقع سحقن و وتحريكه لأسفل حتى يلامس طرف سطح حنوني. إعادة تعيين قيمة محور ظهراني بطني (ض) إلى 0. عند هذه النقطة، اختراق الأنسجة مع الشعرية ل-1،9 ملم والإصدار 1.5 ميكرولتر من التعليق الفيروسية بمعدل من 4 NL / ثانية. الانتظار لمدة 2-3 دقائق لتقليل ارتجاعي من الحوض الصغير التعليق الفيروسية المسار الشعري ومن ثم التراجع عن الشعرية. لا يمكن أن يؤديها A الحقنة الثانية في نصف الكرة controlateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة الجلد، تطهير، والسماح للحيوان للتعافي من التخدير كما هو موضح سابقا في لالصعق الكهربائي الرحم (1.8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الفيروسية حقن التجسيمي. (A و B) تمثيل تخطيطي للمكونات اللازمة لأداء حقن التجسيمي (A) وحامل تفكيكها الشعرية التي تبين الإدراج من كاليفورنياpillary حتى الدائري الثاني (B). (C) قطع صورة لرئيس الماوس يجمد من قضبان الأذن والدعم الحنك مع الجلد لفضح الجمجمة (من اليسار). التكبير من مربع منقط (يمين) ويبين الغرز الأفقي والسهمي، bregma، ومكان الحقن (دائرة). 3. تجهيز العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد لثلاثة أسابيع بعد العدوى، ويروي الماوس مع كاليفورنيا. 100 مل من PFA 4٪، تشريح الدماغ وبعد اصلاحها بين عشية وضحاها في PFA 4٪. في نهاية المطاف، ويمكن أن تدار BrdU و / أو عقار تاموكسيفين قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق حركية دورة الخلية ووقف التعبير عن الجينات المحورة الفيروسية يحيط بها المواقع loxP على التوالي 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن بعد ذلك تتم معالجة الدماغ للالمناعية باستخدام العديد من علامات الجذعية والخلايا والخلايا العصبية الأسلاف (مثل Sox2، GFAP، Nestin، Tbr2، doublecortin، الخ). </li></ol>

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

وقدمت BA FC طلب البراءة تصف التوسع المشروط من الخلايا الجذعية للبالغين الجسدية من قبل cdk4/cyclinD1 الفيروسات (EP 10160288،6).

A خطوة حاسمة لفي الرحم الصعق الكهربائي هو نوعية ونقاء DNA منذ الهجرة في الاتجاه أثناء الولادة من الحقول الكهربائية يعتمد على شحنتها. قد بروتوكولات لتنقية DNA التي لا تتضمن إزالة جزيئات مشحونة إضافية، مثل السموم الداخلية، تؤدي إلى إخفاء من التهم DNA الطبيعية السلبية التي تؤدي إلى تسليم الفقراء. ومن الواضح أن لمس الجدران الرحم مع الأقطاب الكهربائية في أقرب مكان ممكن إلى المنطقة لاستهداف تحسين الكفاءة الصعق الكهربائي. نفس القدر من الأهمية هو نوعية الأقطاب المستخدمة لأن هذا أمر أساسي لإيصال المجالات الكهربائية الأمثل. سوف الخدوش الصغيرة غير مرئية بالعين حتى و / أو مخلفات العضوية، مثل آثار مصل، والدهون، وهكذا دواليك، تتراكم حتما مع مرور الوقت مما يؤدي إلى فقدان أقطاب ممتلكاتهم. electropes القديمة و / أو القذرة هي السبب الأكثر احتمالا لانخفاض مفاجئ في الكفاءة والصعق الكهربائي، وبالتالي، يجب أن تكون صeplaced بمجرد لاحظت هذا. في حين بسيطة نسبيا، في الصعق الكهربائي الرحم وعادة ما يتطلب بضعة أسابيع من التدريب من أجل تحقيق نتائج مرضية واستنساخه. هذه التقنية متعددة جدا حيث يمكن تطبيقه، تقريبا، إلى أي جهاز وأنسجة الجنين النامية. بالتأكيد، أجهزة تحتوي على تجويف، مثل الدماغ وتكون سهلة خصوصا لاستهداف والسماح لنسبة عالية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل نظرا لسهولة حقن كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي. وهناك مشكلة مشتركة تواجه في إعداد حقن الفيروسية التجسيمي هو أن تكون الخلايا المصابة قليل و / أو لاستهداف مناطق غير مرغوب فيها. ويرتبط أساسا المشكلة الأولى مع حقن منخفضة عيار الفيروسات. الخلايا 293T مع انخفاض عدد من الممرات في الثقافة تنمو بشكل أسرع ويؤدي إلى ارتفاع التتر الفيروسية. باستخدام الخلايا أقدم من كاليفورنيا. سوف لا يوصى ب 20 الممرات وسائل ترنسفكأيشن بكفاءة أقل من 80٪ لا ضمان حسنالفيروسية الإنتاج. إعادة تعليق بيليه الفيروسية من الأهمية بمكان أيضا، وتعليق الفيروسية أن تظهر كتل متجانسة والفيروسية التي يمكن أن تسد الشعيرات الدموية يتعين تجنبها. الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة تنخفض والتخزين على المدى الطويل. لهذا الأسباب، مأخوذة تحتاج إلى تخزينها بشكل دائم في C ° -80 ولا يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. حتى في ظل هذه الظروف، يمكن أن يلاحظ انخفاض في الإصابة بعد 6-12 شهرا من التخزين. في مراحل التعلم، فإننا نقترح لاختبار عيار الفيروسية من كل الفيروسية وإعداد للقيام بذلك مرة أخرى بعد التخزين على المدى الطويل. يمكن وجود خلايا المصابة في مناطق غير مرغوب فيها من الدماغ يعتمد على تحديد المواقع دون المستوى الأمثل من رئيس الماوس على الإطار التجسيمي، الأمر الذي يتطلب بعض الممارسة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان عدم الاضرار سطح الدماغ أثناء فتح ثقب في الجمجمة بسبب وإلا فإنه لن يكون من الممكن إعادة تعيين ال 0 بشكل صحيح على سطح حنوني، مما أدى إلى حقن غير دقيقة. الإحداثياتأننا المنصوص عليها في هذا البروتوكول ويشار إلى C57/BL6 الإناث 6-10 أسابيع من العمر ونقترح لهم لتحسين سلالة مختلفة / العمر / الجنس. قد اقتناء هذه التقنية تحتاج إلى مزيد من الوقت من الصعق الكهربائي في الرحم نظرا لأطول مراحل اللازمة لإعداد الفيروسات وتحليل العينات. ونحن نوصي بشدة أن تستخدم فقط بعد الجراحة الماوس الفيروسات وحقن التجسيمي أصبحت موثوقة وقابلة للتكرار. الخطوة الأولى لتحقيق ذلك هي لحقن الأصباغ DNA الخلية نفيذ، مثل هويشت 33342، الموت الرحيم في الفئران وتحليل العقول على الفور. في الصعق الكهربائي والحقن داخل الرحم الفيروسية التجسيمي هما نظم قوية لحاد والأنسجة تحديدا التلاعب التعبير الجيني داخل الجهاز العصبي المركزي خلال التنمية الثدييات والبلوغ. رغم القيد في استهداف جزء من السكان فقط من الخلايا، وهذه النظم توفر سرعة وسهولة غير مسبوقة بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، طن سيما الجيل شاقة وتستغرق وقتا طويلا من الفئران المعدلة وراثيا. لكن على الرغم من هذا التشابه والاختلافات القائمة بين العديد من الطريقتين التي يستحق الذكر. أولا، فيما يتعلق استهداف أنواع مختلفة من الخلايا، في الصعق الكهربائي يؤدي في البداية الرحم إلى ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية السليمة (وتسمى أيضا خلايا الدبقية شعاعي) لأن هذه هي الخلايا الوحيدة ترسيم البطين حيث يتم حقن الحمض النووي. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية، وسوف يتم في وقت لاحق البلازميدات الموروثة من المستهدف، والخلايا الجذعية الأم إلى السلف و / أو الخلايا العصبية مما يؤدي إلى ابنة إعادة توزيع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في جميع أنحاء القشرة بوصفها وظيفة من الزمن. في المقابل، فإن استخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في الدماغ البالغ يؤدي إلى عدوى متزامنة في أي نوع من الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية، الأسلاف، وكذلك الخلايا العصبية الخلايا الدبقية الناضجة. من المذكرة، فيما يتعلق باستخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في مقابل الفيروسات القهقرية أكثر شيوعا هو حقيقةوأن التكامل lentiviral تحدث بشكل مستقل عن الدولة الإنقسامية من الخلايا، مما يسمح للاستهداف أيضا، البالغ الخلايا الجذعية هادئة. الثانية، وثمة فرق آخر هام بين الصعق الكهربائي والعدوى الفيروسية هو أن يتم التوصل إلى عابرة، التعبير episomal من السابق بدلا من دمج لا رجعة فيه DNA في الجينوم من الخلايا المصابة التي حققها هذا الأخير. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية على التوالي، التخفيف من البلازميدات electroporated، وتدهور البروتين cyclinD1 خارج الرحم، سوف تترتب على ذلك في كل دورة الخلية. وهكذا، ظهر توسيع مجلس الأمن القومي أثناء التطور الجنيني إلى الماضي فقط لما يقرب من 15 يوما بينما في الدماغ الكبار وجد هذا التأثير يستمر لعدة أشهر (نتائج غير منشورة). الثالث، حيث ط) cdk4/cyclinD1 له تأثير أقوى على الخلايا مع أطول G1 والثاني) الأسلاف العصبية التي ارتكبت خلال التنمية لديها دورة الخلية تعدمن الخلايا الجذعية في حين أن العكس صحيح تماما خلال مرحلة البلوغ، تم العثور على بلدينا التلاعب لتحريك التوسع، في المقام الأول، من خلال الخلايا العصبية الأسلاف والتنمية الجذعية خلال مرحلة البلوغ. في كلتا الحالتين تم تحقيقه زيادة في الخلايا العصبية من قبل كل من الأساليب. يمكنك بسهولة الرابعة، وحقن الفيروسية أن يؤديها، وبتكاثر موثوق، في مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ببساطة عن طريق تغيير إحداثيات التجسيمي. في المقابل، قد الاستهداف الدقيق لمناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي، مثل جذع الدماغ، وتشكيل قرن آمون، أو الحبل الشوكي، عن طريق الصعق الكهربائي داخل الرحم يكون أكثر صعوبة لتحقيق بتكاثر. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن إجراء الحقن التجسيمي على الفئران في أي عمر، ويقتصر الأداء الأمثل للفي الرحم الصعق الكهربائي من نحو E11 E16 ل. وقبل مراحل E11 يتطلب من استخدام الموجات فوق الصوتية المجهر تشتت ارتدادي 18،19 أو طائفة بأكملها الجنينلدى عودتهم نظام 17،20. في الآونة الأخيرة، وقد تم الترويج اهتماما متزايدا في بيولوجيا الخلية الأساسية للخلايا الجذعية الجسدية بسبب ويعتقد دراستهم والتلاعب الأساسية لتكون الخلية رواية نحو تطوير العلاجات المستندة التجدد. ولا سيما بالنسبة للoverexpression من cdk4/cyclinD1، والبروتوكول يوفر وسيلة لدينا لزيادة transitorily توسيع مجلس الأمن القومي في الجسم الحي (الشكل 3B و 4B وC و C) من أجل زيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الكبار. ونحن نعتقد أن هذه قد تكون مهمة التلاعب في عدد من السياقات المختلفة لفهم أفضل لدور مجلس الأمن القومي في تطور الدماغ والتنمية والتوازن وكذلك مساهمتها في الوظيفة الإدراكية أو الشفاء من الضمور العصبي أو الإصابة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المواد / المعدات </td><td> مزود </td><td> كتالوج # </td><td></td></tr><tr><td> Endofree طقم ماكسي بلازميد </td><td> QIAGEN </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> سيجما </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 المشتعلة / براون ماصة مجتذب </td><td> سوتر الآلات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الشعيرات الدموية مع خيوط </td><td> سوتر الآلات </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> الجدول الحيوانات المختبرية الأعلى التخدير النظام </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> باكستر </td><td> هدغ9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 حبة الزجاج معقم </td><td> SouthPointe الجراحية </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط القزحية </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona الحل </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> مضخة بيكو </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM موجة مربع 830 electroporator </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> أقطاب منتاش الجولة </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> خياطة المواد </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> لا اراديمقطع مطبق لإغلاق الجرح </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic حقن الحل </td><td> إسيكس فارما AG </td></tr><tr><td> DMEM ث / Glutamax I- </td><td> إينفيتروجن </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل بوفين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> زراعة الأنسجة طبق </td><td> صقر </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimine 250 مل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> N-زبدي حمض، ملح الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> B 5887 </td><td></td></tص&gt; <tr><td> أنبوب، thinwall، polyallomer </td><td> بيكمان </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> نموذج 900 التجسيمي الحيوانات الصغيرة الصك </td><td> KOPF الصكوك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI بيكو المجهر </td><td> زايس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 تحكم وحاقن Nanoliter2000 </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> استبدال الزجاج 3،5 نانولتر </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR تطبيق الحفر العام </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td><strong&gt; جسم </td><td> مزود </td><td> كتالوج # </td><td> تخفيف </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> سانتا كروز </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> ميليبور </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> جدول الأجسام المضادة. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعموما، الصعق الكهربائي في الرحم ينتج 60-80٪ من الأجنة electroporated عرض تعبير قوي عن الجين مراسل في منطقة واسعة من القشرة الجانبية (الشكل 3A). ويمكن الكشف عن البروتينات الفلورية بسهولة على الأجنة جبل كامل في أقرب وقت 3-6 ساعات بعد الجراحة مع الإشارة امتدت لأكثر من أسبوع واحد. ضمن المنطقة المستهدفة، حوالي 30-50٪ من الخلايا عادة التعبير عن التحوير (s) مع نسبة من الخلايا المشترك، معربا عن اثنين (أو أكثر) شارك في electroporated الجينات المحورة يجري عادة فوق 90٪ (الشكل 3B، اليسار) 6،8 ، 15. في حين يمكن ملاحظة الحد الأدنى من موت الخلايا المبرمج (حوالي 2،0-2،5٪) بعد حوالي 2 ساعة من الصعق الكهربائي، وهذه القيمة تعود إلى مستويات الفسيولوجية (حوالي 0،5-1،0٪) بعد حوالي 6 ساعات (FC، بيانات غير منشورة). نسبة الأجنة أو الفئران الحوامل يموتون بسبب الجراحة عادة لا يكاد يذكر (&lt;5٪). ثم شارك في الصعق الكهربائي مع cdk4/cyclinD1 في ظل هذه الظروف بنسبة 48 ساعات للتنمية يطلق زيادة في توسيع السلف العصبية بنسبة 30٪ (الشكل 3B، والحق، وC) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. توسيع الأسلاف العصبية من قبل cdk4/cyclinD1 overexpression. (A) الصورة الإسفار من خلال قسم القشرة الجانبية للجنين أحد الفئران بعد 24 ساعة من الصعق الكهربائي مع البلازميدات وGFP RFP الجنينية في اليوم 13. (B) كما في الصور نيون A 48 ساعة بعد الصعق الكهربائي بالتعاون مع البلازميدات cdk4/GFP وcyclinD1/RFP وimmunolabeling للعلامة السلف القاعدية Tbr2. للصحفيين الفلورسنت مع counterstainig دابي (يسار) وTbr2 (يمين) وترد. خطوط يدل على السطح القمي للمنطقة البطين (VZ؛ الخط الأبيض) وحدود المنطقة subventricular (SVZ؛ الصفراء الخطوط المتقطعة). لاحظ زيادة ثيckness من SVZ في الجزء electroporated من القشرة (رؤوس سهام بيضاء) وذلك بسبب زيادة جيل الأسلاف وتوسيع القاعدية بعد overexpression من cdk4/cyclinD1. (C) الكمي لتأثير هو مبين في الحانات B. = SD، P &lt;0.05، ن = 3. يؤخذ الرسم البياني بار في C من لانج وآخرون، 2009 15. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن التجسيمي الفيروسية، كاليفورنيا. 80٪ من الفئران التي تديرها عرض التعبير القوي للجينات منقولة في جميع أنحاء التلفيف المسنن في كلها. ويمكن التعبير GFP التأسيسي للكشف بسهولة على 40 ميكرومتر المقاطع بمجرد 4 أيام بعد الجراحة. على طول محور منقاري إلى الذيلية من التلفيف المسنن، حول 10-30٪ من الخلايا (أي ما يعادل ما مجموعه كاليفورنيا. 10،000-30،000 خلايا) تعبير عن عادة التحوير (ق) (الشكل 4A) 9. نسبة الفئران يموتون بسبب عملية جراحية لا يكاد يذكر (&lt;5٪). ثلاثة overexpression أسبوع من cdk4/cyclinD1 في ظل هذه الظروف العوامل التي تسبب زيادة في NSC بنسبة تزيد على سنتينطيات (الشكل 4B)، بينما تتناقص تكوين الخلايا العصبية بنسبة 70٪ (الشكل 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. آثار العدوى الفيروسية. (A) 3D اعادة اعمار 7 صور مضان اتخذت من 40 ميكرومتر سميكة أقسام الاكليلية مسلسل (1 كل جمع 6) على طول محور منقاري إلى الذيلية من قرن آمون. GFP + وتظهر الخلايا المصابة (الأخضر)، وتلطيخ دابي النووي (الأزرق) من التلفيف المسنن (أعلى). صور مشرقة من ميدان المقاطع الاكليلية مماثلة لتلك المبينة في A (وسط) والتمثيل 3D (أسفل) من نصف الكرة المخية والحصين كله مع أبرز في pseudocolor الخضراء (معدل من أطلس الدماغ ألين؛ <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . الأسهم البيضاء تشير إلى موقع الحقن. الجانبي (L)، منقاري (R)، والدريشار إلى SAL (D) محاور (س، ص، ض وإحداثيات التجسيمي) (الحق). (B و C) نسبة nestin + NSC (B) وDCX + الخلايا العصبية الوليد (C) بين السكان من GFP + الخلايا المصابة 3 أسابيع بعد الحقن التجسيمي من GFP (أبيض) أو cdk4/cyclinD1/GFP الفيروسات (السوداء). قضبان = SD، P &lt;0.005، ن = 3. الرسوم البيانية في B و C مأخوذة من Artegiani وآخرون، 2011.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.7K Views.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ول?...

Video: Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol, we outline the experimental methodology for preparing rats for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E15-E21 rats, however it is most commonly performed at E16 as shown in this video.

في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation الجنين الجرذ E16

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic rat neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Biology

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

في الرحم وحقن داخل البطيني Electroporation من أجنة الفئران E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

كفاءة توصيل الجينات في الجهاز العصبي المركزي متعددة باستخدام الأراضي في الرحم Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

الوليد الصعق الكهربائي المنطقة Subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

حديثي الولادة حنوني التثقيب الكهربائي السطحية

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously largely been restricted to the manipulation of embryonic stages post-neurulation. A protocol was developed to inject the amniotic cavity at embryonic day (E)7.5 and deliver lentivirus, encoding cDNA or shRNA, targeting &gt;95% of the neural plate and neural crest cells, contributing to the future brain, spinal cord, and peripheral nervous system. This protocol describes the steps necessary to achieve successful transduction, including grinding of the glass capillary needles, pregnancy verification, developmental staging using ultrasound imaging, and optimal injection volumes matched to embryonic stages. 
Following this protocol, it is possible to achieve transduction of &gt;95% of the developing brain with high-titer lentivirus and thus perform whole-brain genetic manipulation. In contrast, it is possible to achieve mosaic transduction using lower viral titers, allowing for genetic screening or lineage tracing. Injection at E7.5 also targets ectoderm and neural crest contributing to distinct compartments of the eye, tongue, and peripheral nervous system. This technique thus offers the possibility to manipulate gene expression in mouse neural-plate- and ectoderm-derived tissues from preneurulation stages, with the benefit of reducing the number of mice used in experiments.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection NEPTUNE at Embryonic Day 7.5

In this protocol, we describe how to inject the mouse amniotic cavity at E7.5 with lentivirus, leading to uniform transduction of the entire neural plate, with minimal detrimental effects on survival or embryonic development.

استهداف الصفائح العصبية الفئرانية بواسطة حقن النانو في الرحم (NEPTUNE) في اليوم الجنيني 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

Developmental Biology

Double In Utero Electroporation to Target Temporally and Spatially Separated Cell Populations

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian corticogenesis. This procedure takes advantage of the brain ventricles to allow the introduction of DNA of interest and uses a pair of electrodes to direct the entrance of the genetic material into the cells lining the ventricle, the neural stem cells. This method allows researchers to label the desired cells and/or manipulate the expression of genes of interest in those cells. It has multiple applications, including assays targeting neuronal migration, lineage tracing, and axonal pathfinding. An important feature of this method is its temporal and regional control, allowing circumvention of potential problems related with embryonic lethality or the lack of specific CRE driver mice. Another relevant aspect of this technique is that it helps to considerably reduce the economic and temporal limitations that involve the generation of new mouse lines, which become particularly important in the study of interactions between cell types that originate in distant areas of the brain at different developmental ages. Here we describe a double electroporation strategy that enables targeting of cell populations that are spatially and temporally separated. With this approach we can label different subtypes of cells in different locations with selected fluorescent proteins to visualize them, and/or we can manipulate genes of interest expressed by these different cells at the appropriate times. This strategy enhances the potential of in utero electroporation and provides a powerful tool to study the behavior of temporally and spatially separated cell populations that migrate to establish close contacts, as well as long-range interactions through axonal projections, reducing temporal and economic costs.

Double in utero electroporation allows targeting cell populations that are spatially and temporally separated. This technique is useful to visualize interactions between those cell populations using fluorescent proteins in normal conditions but also after functional experiments to perturb genes of interest.

مضاعفة في Electroporation الرحمية لاستهداف مجموعات الخلايا المنفصلة زمانياً ومكانياً

In utero electroporation is an in vivo DNA transfer technique extensively used to study the molecular and cellular mechanisms underlying mammalian ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

في فيتفو استهداف الخلايا السلف العصبية في النمس نيوكورتكس من قبل في الكهربائية الرحمية

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video