وأيد هذا العمل من قبل مركز العلاج التجديدي، وكلية الطب في دريسدن TU، ومركز البحوث التعاونية DFG SFB655 (A20 الفرعي). وأيد من قبل BA زمالة من برنامج الحفريات-BB، دريسدن. نشكر الدكاترة. نوريكو Osumi، نومورا تاداشي، ديتر كذبة Chichung، ورافي Jagasia للحصول على المشورة الثمينة خلال إنشاء الصعق الكهربائي في الرحم والحقن الفيروسية التجسيمي.

ملاحظة أولية يجب إجراء الجراحة من قبل المحققين المدربين بشكل كامل بناء على موافقة من السلطات المحلية لرعاية الحيوان. ويجب اتخاذ جميع الاحتياطات للحد من الألم والإجهاد الذي أصاب الحيوان بما في ذلك التخدير العميق، وإدارة التسكين بعد العملية الجراحية، وبالنسبة لعمليات استمرت أكثر من 10 دقيقة، وتطبيق لزيوت التشحيم لمنع الجفاف العين القرنية وفقدان البصر. يجب أن تبقى الفئران تخدير الدافئة باستمرار عند 37 درجة مئوية حتى الشفاء التام وكل أداة جراحية والحل يجب أن يكون معقم. على الرغم من أن استخدام غطاء البيولوجية ليست ضرورية تماما، يتعين على المشغل اتخاذ جميع الاحتياطات المعقولة لتقليل إمكانية إصابة الحيوان أثناء عملية من خلال ارتداء معطف المختبر، وقناع، وقفازات. وبالمثل، يجب أن يؤذن في كل خطوة بشأن توليد واستخدام الفيروسات ويجب إجراء في المناطق S2 وفقا للوائح السلطات المحلية.وأخيرا، لا بد من إجراء إزالة التلوث شامل لجميع الأدوات والأسطح التي كان يمكن أن تكون على اتصال مع فيروسات وفقا لممارسات التطهير وافق مرفق (لفيروس نقص المناعة البشرية عن طريق محو مع 70٪ ET-OH و / أو التعقيم). الجزء 1: توسيع مجلس الأمن القومي الجنينية 1. في الرحم الصعق الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد استنساخ جينات منقولة (أي cdk4/cyclinD1) في PCMS-EGFP (Clontech) أو pDSV-mRFPnls ناقلات 16، تنقية البلازميدات باستخدام عدة EndoFree و resuspend في برنامج تلفزيوني العقيمة إلى تركيز من 3-5 ميكروغرام / ميكرولتر. قريبا قبل الجراحة، مزج البلازميدات مع FastGreen 0.05٪ في برنامج تلفزيوني في نسبة النهائي من كاليفورنيا. وأجهزة الطرد المركزي 04:04:01 الخليط لمدة 2 دقيقة في 16000 XG لإزالة رواسب جميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خليط الحمض النووي في الزجاج البورسليكات سحبت سابقا الشعرية. سحب المعلمات باستخدام P-97 ماصة مجتذب هي: سحب: 200؛ VEL: 140؛ الوقت: 140. وتعطى الحرارة عن طريق اختبار منحدر ويعتمد على المواصفاتتستخدم الكثير من الشعيرات الدموية IFIC. تحميل الشعرية على فوهة من PicoPump التي تقع بالقرب من منصة الصعق الكهربائي في الرحم (الشكل 1A)، وتحت stereomicroscope، ينحني طرفها ونيك أنه عند نقطة انعطاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات جراحة التعقيم في الزجاج حبة الجافة وتخدير عميق ماوس الحوامل في يوم 12-15 من الحمل باستخدام المرذاذ isoflurane. وضع الحيوان في موقف ضعيف على منصة وضعت في التدفئة 37 ° C ويبقي قيد الإدارة isoflurane مستمرة من خلال مخروط الأنف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق جلد البطن، مع تطهير مرات Betaisodona متعددة، في نهاية المطاف في القضاء بين مع الايثانول 70٪، وحقن البوبرينورفين (مخففة في PBS) تحت الجلد عند 0.1 ملغم / كغم من التركيز ومسكن وقائي. باستخدام مقص غرامة، وجعل قطع طولية 2 سم من الجلد، وبالتالي، من الجدار العضلي الكامنة للوصول إلى التجويف البريتوني. الاستغناء في كاليفورنيا التجويف البريتوني. 2prewarmed مل من محلول IUE (D-PBS تحتوي على 100 U / مل من القلم / بكتيريا) في 37 ° C والحفاظ على الحل على كتلة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الفأر مع drap معقمة تحتوي على الشق الذي سيتم إزالة الرحم. التراجع عن شق باستخدام مبعاد التنغستن، وتحديد الرحم وتخلعها عقده مع ملقط بين الأجنة المجاورة (1B الشكل؛ يسار) ووضع عليه أخيرا على drap العقيمة. خلال العملية برمتها، وشطف الرحم بمحلول IUE لترطيب تجويف الجسم والاعضاء ومنع الجفاف من الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الرحم بعناية عقد بين الإبهام والسبابة وجنين واحد حتى تتحول رأسه مرئيا وموجهة نحو المشغل. تحديد نصفي الكرة الدماغ الانتهائي وحقن واحد منهم من الجانب ظهراني الجانبية. الإفراج 1-2 ميكرولتر من محلول الحمض النووي باستخدام footswitch من PicoPump حتى يرد البطين بواسطة FastGreen (1B الشكل، والحق). </li><lأنا عملت&gt; وضع القطب الموجب من الأقطاب الكهربائية على موقع الحقن والقطب السالب على الجانب المقابل (الشكل 1C) وتقديم 6 البقول من 30 V لمدة 50 مللي مللي مع فاصل بين كل نبضة 950 باستخدام electroporator توليد مربعة الشكل المجالات الكهربائية من خلال footswitch. تجنب وضع الأقطاب على مقربة من المشيمة لأن هذا قد يسبب نزيف وتلف الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم حقن جميع الأجنة وelectroporated، ضع الرحم مرة أخرى إلى تجويف البطن وإغلاق الجدران العضلات مع سلسلة خياطة خياطة كل مم 3-4. يجب أن تكون عقدة دافئ إلى العضلات ولكن ليس ضيقا جدا للسماح تورم قليلا من الأنسجة. وأخيرا، أغلق الجلد المغطي باستخدام مقاطع معدنية. تطهير الجلد مع Betaisodona، إزالة الماوس من قناع isoflurane وتحويلها في قفص الإسكان عندما مستيقظا تماما. رصد الانتعاش من الماوس حتى السلوك الحركي أمر طبيعي. </li></ol> 2. تجهيز سامPLE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد أو أكثر يوما بعد الصعق الكهربائي والتضحية الماوس، وجمع الأجنة وتحديد تلك electroporated بشكل صحيح باستخدام stereomicroscope الفلورسنت (1D الشكل). تشريح أدمغة على الجليد الباردة PBS، بين عشية وضحاها واصلاحها في PFA 4٪ (الرقم الهيدروجيني في بارافورمالدهيد العازلة الفوسفات 7.4). في نهاية المطاف، ويمكن أن تدار BrdU قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق حركية دورة الخلية وانتشار الخلايا 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم معالجة أدمغة لتقطيع والمناعية للعلامات عدة من الخلايا الدبقية شعاعي، أسلاف الخلايا العصبية القاعدية و(Pax6، Nestin، Tbr2، Tbr1، Tuj1 الخ) لتقييم تأثير الجينات المحورة وظيفية على NSC المستهدفة والتي هي ذرية التي حددها التعبير عن الجينات مراسل شارك في electroporated. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1.الصعق الكهربائي في الرحم. (A) تمثيل تخطيطي لمنصة الصعق الكهربائي في الرحم. (B) رسومات تبين المواقع من خلال عملية جراحية الماوس الحوامل (يمين) وحقن الخليط DNA / FastGreen (الأزرق) في نصف الكرة الدماغ الانتهائي من جنين أحد الفئران (يسار). (C) مخطط يبين وضع الأقطاب على اتصال مع جدران الرحم مع القطب الموجب (+) المجاورة لمكان الحقن (الأزرق). تبين الأسهم هجرة DNA نحو القطب الموجب. (D) صورة لساعة الماوس الجنين بعد 24 الصعق الكهربائي مع البلازميدات GFP في يوم الجنينية 13. خط متقطع ترسم نصف الكرة الدماغ الانتهائي. مخطط في A 17 2004 معدلة من Calegari وآخرون،. الجزء 2: توسيع مجلس الأمن القومي الكبار 1. إنتاج جزيئات فيروسية فيروس نقص المناعة البشرية المستمدة من <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 1: لوحة 5 × 10 6 خلايا 293T على 10 سمطبق مع 8 مل من D-MEM تحتوي على 10٪ من مصل الجنين البقري الحرارة المعطل و 100 U / مل من القلم / بكتيريا (مستنبت). استخدام 15 أطباق لمدة إعداد الفيروسية والثقافة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم 2: لكل طبق، تمييع في 1 مل من السهل 5 D-ميكروغرام لكل MEM من 3 البلازميدات ترميز لط) VSVG البروتين المغلف (حويصلي نوع الفيروس التهاب الفم G)، والثاني) هفوة / POL (مجموعة محددة مستضد / البلمرة) ، والثالث) لبناء متعدد المقارين التعبير عن الجينات المحورة وظيفية مراسل (أي cdk4/cyclinD1/GFP) المستنسخة من قبل في نقل فيروس نقص المناعة البشرية ناقل القائم (p6NST90) 9. خلط هذا الحل مع 1 مل من D-MEM تحتوي على 45 ميكرولتر من polyethylenimine الذي تم حله قبل في PBS في 1 ملغ / مل محلول المخزون، واحتضان لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، إزالة وسائل الإعلام من الخلايا وإضافة 4 مل لكل طبق من جديد D-MEM تحتوي على 15٪ من مصل بقري جنيني الحرارة المعطل و 100 U / مل من القلم / بكتيريا. إضافة م 2لتر من خليط ترنسفكأيشن وبين عشية وضحاها الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط إضافة 120 ميكرولتر من 500 ملم في طبق لتعزيز التعبير عن الجينات المحورة نا بوتيرات، بلطف والثقافة لمدة 6-8 ساعة بعد ذلك استبدال المتوسطة ترنسفكأيشن مع 5 مل من مستنبت: اليوم 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 4: جمع supernatants (حوالي إجمالي مل 70)، لتمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون ونقل أنابيب الطرد المركزي في 2 polyallomer (35 X 89 ملم). نابذة فائقة السرعة في 110،000 x ج لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ. تجاهل طاف، إضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة. إعادة تعليق بيليه وتحويلها في واحدة polyallomer أنبوب الطرد المركزي (14 × 95 مم). نابذة فائقة السرعة في 110،000 x ج لمدة 90 دقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار سوينغ. تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، جعل 5 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -80 درجة مئوية. وسوف يكون عيار الفيروسية في حدود 10 8 وت 9 -10 / مل. (ملاحظة: الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة والتخزين، AVOمعرف إعادة تجميد، والحفاظ على الثلج الجاف أثناء النقل وذوبان الجليد قريبا قبل الاستخدام.) </li></ol> 2. التجسيمي الحقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس 6-10 أسابيع من العمر مع isoflurane ووضع الحيوان في موقف المعرضة على إطار التجسيمي (الشكل 2A) باستخدام قضبان الأذن والحنك الدعم لإصلاح صحيح الرأس. يتم الاحتفاظ الحيوانات الحارة على وسادة التدفئة وضعت في C ° 37 وتحت إدارة isoflurane ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن تحت الجلد 100 ميكرولتر من محلول البوبرينورفين يعمل وقائية مسكن، يحلق شريط من الجلد على الرأس من الفأرة، وكما هو موضح في desinfect 1.4. باستخدام مشرط، وجعل كاليفورنيا. 1.5 سم طويلة شق طولي على الجلد الرأس كاشفة عن الجمجمة في مستوى خياطة السهمي. سحب الجلد بلطف وتنظيف سطح العظام مع برعم القطن المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نصف ملء كوب الشعرية (المواصفات في 1.2) مع زيت البارافين وتركيبها على مضخة حقن إدراجوشعري حتى الدائري الثاني (الشكل 2B). نقل صاحب الشعرية في محور X و Y و Z حتى يتم وضع غيض من شعري على bregma، نقطة بالتزامن بين الغرز السهمي والجانبية (الشكل 2C) (يتم تحديدها مع مساعدة من stereomicroscope)، و إعادة مجموعة X، Y، Z والقيم إلى 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشعرية مم 1.6 ± في محور ميديو الاطراف (X) ومم -1.9 في المحور الأمامي الخلفي (ص) وبمناسبة العظام باستخدام قلم علامة الجراحية. جعل ثقب من كاليفورنيا. 0.5 مم القطر على الجمجمة باستخدام الحفار الكهربائي مع إيلاء اهتمام لا للاساءة الى الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرات 5 ميكرولتر من التعليق الفيروسي (1 قسامة) على قطعة من parafilm توضع على الأذن والحانات immerge غيض من الشعرية في الحبرية. تمتص كاليفورنيا. تعيين 3،5 ميكرولتر من التعليق الفيروسية باستخدام محقن نانولتر في 55 NL / ثانية. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة مع قطرات تتبخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شعري لموقع سحقن و وتحريكه لأسفل حتى يلامس طرف سطح حنوني. إعادة تعيين قيمة محور ظهراني بطني (ض) إلى 0. عند هذه النقطة، اختراق الأنسجة مع الشعرية ل-1،9 ملم والإصدار 1.5 ميكرولتر من التعليق الفيروسية بمعدل من 4 NL / ثانية. الانتظار لمدة 2-3 دقائق لتقليل ارتجاعي من الحوض الصغير التعليق الفيروسية المسار الشعري ومن ثم التراجع عن الشعرية. لا يمكن أن يؤديها A الحقنة الثانية في نصف الكرة controlateral. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة الجلد، تطهير، والسماح للحيوان للتعافي من التخدير كما هو موضح سابقا في لالصعق الكهربائي الرحم (1.8). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الفيروسية حقن التجسيمي. (A و B) تمثيل تخطيطي للمكونات اللازمة لأداء حقن التجسيمي (A) وحامل تفكيكها الشعرية التي تبين الإدراج من كاليفورنياpillary حتى الدائري الثاني (B). (C) قطع صورة لرئيس الماوس يجمد من قضبان الأذن والدعم الحنك مع الجلد لفضح الجمجمة (من اليسار). التكبير من مربع منقط (يمين) ويبين الغرز الأفقي والسهمي، bregma، ومكان الحقن (دائرة). 3. تجهيز العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واحد لثلاثة أسابيع بعد العدوى، ويروي الماوس مع كاليفورنيا. 100 مل من PFA 4٪، تشريح الدماغ وبعد اصلاحها بين عشية وضحاها في PFA 4٪. في نهاية المطاف، ويمكن أن تدار BrdU و / أو عقار تاموكسيفين قبل التضحية وفقا لنماذج مختلفة للتحقيق حركية دورة الخلية ووقف التعبير عن الجينات المحورة الفيروسية يحيط بها المواقع loxP على التوالي 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن بعد ذلك تتم معالجة الدماغ للالمناعية باستخدام العديد من علامات الجذعية والخلايا والخلايا العصبية الأسلاف (مثل Sox2، GFAP، Nestin، Tbr2، doublecortin، الخ). </li></ol>

<ol>
	<li>Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells:+units+of+development,+units+of+regeneration,+and+units+in+evolution.">Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution.</a> Cell. 100, 157-168 (2000).</li><li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+for+the+treatment+of+neurological+disorders.">Stem cells for the treatment of neurological disorders.</a> Nature. 441, 1094-1096 (2006).</li><li>Salomoni, P., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+of+mammalian+neural+stem+cells:+putting+a+speed+limit+on+G1.">Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1.</a> Trends Cell Biol. 5, 332-342 (2010).</li><li>Lange, C., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdks+and+cyclins+link+G(1)+length+and+differentiation+of+embryonic,+neural+and+hematopoietic+stem+cells.">Cdks and cyclins link G(1) length and differentiation of embryonic, neural and hematopoietic stem cells.</a> Cell Cycle. 9, 1893-1900 (2010).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Inoue, T., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+impulse+to+the+brain--using+in+vivo+electroporation.">An impulse to the brain--using in vivo electroporation.</a> Nat. Neurosci. 4, 1156-1158 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 10, 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb. Cortex. , 120-125 (2009).</li><li>Artegiani, B., Lindemann, D., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+cdk4+and+cyclinD1+triggers+greater+expansion+of+neural+stem+cells+in+the+adult+mouse.">Overexpression of cdk4 and cyclinD1 triggers greater expansion of neural stem cells in the adult mouse.</a> J. Exp. Med. 208, 937-948 (2011).</li><li>Dixit, R., Lu, F., Cantrup, R., Gruenig, N., Langevin, L. M., Kurrasch, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation.">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos.">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+Utero+Electroporation:+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection.">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).</li><li>Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+Injection+of+Adeno-associated+Viral+Vectors.">Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors.</a> J. Vis. Exp. (45), e2140 (2010).</li><li>Lepousez, G., Alonso, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Viral+Transduction+of+Adult-born+Olfactory+Neurons+for+Chronic+in+vivo+Optogenetic+Stimulation.">Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (58), e3380 (2011).</li><li>Lange, C., Huttner, W. B., Calegari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk4/cyclinD1+overexpression+in+neural+stem+cells+shortens+G1,+delays+neurogenesis,+and+promotes+the+generation+and+expansion+of+basal+progenitors.">Cdk4/cyclinD1 overexpression in neural stem cells shortens G1, delays neurogenesis, and promotes the generation and expansion of basal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 5, 320-331 (2009).</li><li>De Pietri Tonelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter/sensor+plasmid.">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li><li>Calegari, F., Marzesco, A. M., Kittler, R., Buchholz, F., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+post-implantation+mouse+embryos+using+directional+electroporation+and+whole+embryo+culture.">Tissue-specific RNA interference in post-implantation mouse embryos using directional electroporation and whole embryo culture.</a> Differentiation. 72, 92-102 (2004).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-Guided+Microinjection+into+the+Mouse+Forebrain+In+Utero+at+E9.5.">Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Osumi, N., Inoue, T. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=transfer+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">transfer into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Methods. 24, 35-42 (2001).</li></ol>

وقدمت BA FC طلب البراءة تصف التوسع المشروط من الخلايا الجذعية للبالغين الجسدية من قبل cdk4/cyclinD1 الفيروسات (EP 10160288،6).

A خطوة حاسمة لفي الرحم الصعق الكهربائي هو نوعية ونقاء DNA منذ الهجرة في الاتجاه أثناء الولادة من الحقول الكهربائية يعتمد على شحنتها. قد بروتوكولات لتنقية DNA التي لا تتضمن إزالة جزيئات مشحونة إضافية، مثل السموم الداخلية، تؤدي إلى إخفاء من التهم DNA الطبيعية السلبية التي تؤدي إلى تسليم الفقراء. ومن الواضح أن لمس الجدران الرحم مع الأقطاب الكهربائية في أقرب مكان ممكن إلى المنطقة لاستهداف تحسين الكفاءة الصعق الكهربائي. نفس القدر من الأهمية هو نوعية الأقطاب المستخدمة لأن هذا أمر أساسي لإيصال المجالات الكهربائية الأمثل. سوف الخدوش الصغيرة غير مرئية بالعين حتى و / أو مخلفات العضوية، مثل آثار مصل، والدهون، وهكذا دواليك، تتراكم حتما مع مرور الوقت مما يؤدي إلى فقدان أقطاب ممتلكاتهم. electropes القديمة و / أو القذرة هي السبب الأكثر احتمالا لانخفاض مفاجئ في الكفاءة والصعق الكهربائي، وبالتالي، يجب أن تكون صeplaced بمجرد لاحظت هذا. في حين بسيطة نسبيا، في الصعق الكهربائي الرحم وعادة ما يتطلب بضعة أسابيع من التدريب من أجل تحقيق نتائج مرضية واستنساخه. هذه التقنية متعددة جدا حيث يمكن تطبيقه، تقريبا، إلى أي جهاز وأنسجة الجنين النامية. بالتأكيد، أجهزة تحتوي على تجويف، مثل الدماغ وتكون سهلة خصوصا لاستهداف والسماح لنسبة عالية من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل نظرا لسهولة حقن كمية كبيرة نسبيا من الحمض النووي. وهناك مشكلة مشتركة تواجه في إعداد حقن الفيروسية التجسيمي هو أن تكون الخلايا المصابة قليل و / أو لاستهداف مناطق غير مرغوب فيها. ويرتبط أساسا المشكلة الأولى مع حقن منخفضة عيار الفيروسات. الخلايا 293T مع انخفاض عدد من الممرات في الثقافة تنمو بشكل أسرع ويؤدي إلى ارتفاع التتر الفيروسية. باستخدام الخلايا أقدم من كاليفورنيا. سوف لا يوصى ب 20 الممرات وسائل ترنسفكأيشن بكفاءة أقل من 80٪ لا ضمان حسنالفيروسية الإنتاج. إعادة تعليق بيليه الفيروسية من الأهمية بمكان أيضا، وتعليق الفيروسية أن تظهر كتل متجانسة والفيروسية التي يمكن أن تسد الشعيرات الدموية يتعين تجنبها. الفيروسات هي حساسة جدا لدرجة الحرارة تنخفض والتخزين على المدى الطويل. لهذا الأسباب، مأخوذة تحتاج إلى تخزينها بشكل دائم في C ° -80 ولا يمكن أن يكون أعيد تجميدها مرة. حتى في ظل هذه الظروف، يمكن أن يلاحظ انخفاض في الإصابة بعد 6-12 شهرا من التخزين. في مراحل التعلم، فإننا نقترح لاختبار عيار الفيروسية من كل الفيروسية وإعداد للقيام بذلك مرة أخرى بعد التخزين على المدى الطويل. يمكن وجود خلايا المصابة في مناطق غير مرغوب فيها من الدماغ يعتمد على تحديد المواقع دون المستوى الأمثل من رئيس الماوس على الإطار التجسيمي، الأمر الذي يتطلب بعض الممارسة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان عدم الاضرار سطح الدماغ أثناء فتح ثقب في الجمجمة بسبب وإلا فإنه لن يكون من الممكن إعادة تعيين ال 0 بشكل صحيح على سطح حنوني، مما أدى إلى حقن غير دقيقة. الإحداثياتأننا المنصوص عليها في هذا البروتوكول ويشار إلى C57/BL6 الإناث 6-10 أسابيع من العمر ونقترح لهم لتحسين سلالة مختلفة / العمر / الجنس. قد اقتناء هذه التقنية تحتاج إلى مزيد من الوقت من الصعق الكهربائي في الرحم نظرا لأطول مراحل اللازمة لإعداد الفيروسات وتحليل العينات. ونحن نوصي بشدة أن تستخدم فقط بعد الجراحة الماوس الفيروسات وحقن التجسيمي أصبحت موثوقة وقابلة للتكرار. الخطوة الأولى لتحقيق ذلك هي لحقن الأصباغ DNA الخلية نفيذ، مثل هويشت 33342، الموت الرحيم في الفئران وتحليل العقول على الفور. في الصعق الكهربائي والحقن داخل الرحم الفيروسية التجسيمي هما نظم قوية لحاد والأنسجة تحديدا التلاعب التعبير الجيني داخل الجهاز العصبي المركزي خلال التنمية الثدييات والبلوغ. رغم القيد في استهداف جزء من السكان فقط من الخلايا، وهذه النظم توفر سرعة وسهولة غير مسبوقة بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، طن سيما الجيل شاقة وتستغرق وقتا طويلا من الفئران المعدلة وراثيا. لكن على الرغم من هذا التشابه والاختلافات القائمة بين العديد من الطريقتين التي يستحق الذكر. أولا، فيما يتعلق استهداف أنواع مختلفة من الخلايا، في الصعق الكهربائي يؤدي في البداية الرحم إلى ترنسفكأيشن من الخلايا الجذعية السليمة (وتسمى أيضا خلايا الدبقية شعاعي) لأن هذه هي الخلايا الوحيدة ترسيم البطين حيث يتم حقن الحمض النووي. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية، وسوف يتم في وقت لاحق البلازميدات الموروثة من المستهدف، والخلايا الجذعية الأم إلى السلف و / أو الخلايا العصبية مما يؤدي إلى ابنة إعادة توزيع الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في جميع أنحاء القشرة بوصفها وظيفة من الزمن. في المقابل، فإن استخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في الدماغ البالغ يؤدي إلى عدوى متزامنة في أي نوع من الخلايا بما في ذلك الخلايا الجذعية، الأسلاف، وكذلك الخلايا العصبية الخلايا الدبقية الناضجة. من المذكرة، فيما يتعلق باستخدام lentiviruses فيروس نقص المناعة البشرية في مقابل الفيروسات القهقرية أكثر شيوعا هو حقيقةوأن التكامل lentiviral تحدث بشكل مستقل عن الدولة الإنقسامية من الخلايا، مما يسمح للاستهداف أيضا، البالغ الخلايا الجذعية هادئة. الثانية، وثمة فرق آخر هام بين الصعق الكهربائي والعدوى الفيروسية هو أن يتم التوصل إلى عابرة، التعبير episomal من السابق بدلا من دمج لا رجعة فيه DNA في الجينوم من الخلايا المصابة التي حققها هذا الأخير. ونتيجة لذلك من انقسامات الخلية على التوالي، التخفيف من البلازميدات electroporated، وتدهور البروتين cyclinD1 خارج الرحم، سوف تترتب على ذلك في كل دورة الخلية. وهكذا، ظهر توسيع مجلس الأمن القومي أثناء التطور الجنيني إلى الماضي فقط لما يقرب من 15 يوما بينما في الدماغ الكبار وجد هذا التأثير يستمر لعدة أشهر (نتائج غير منشورة). الثالث، حيث ط) cdk4/cyclinD1 له تأثير أقوى على الخلايا مع أطول G1 والثاني) الأسلاف العصبية التي ارتكبت خلال التنمية لديها دورة الخلية تعدمن الخلايا الجذعية في حين أن العكس صحيح تماما خلال مرحلة البلوغ، تم العثور على بلدينا التلاعب لتحريك التوسع، في المقام الأول، من خلال الخلايا العصبية الأسلاف والتنمية الجذعية خلال مرحلة البلوغ. في كلتا الحالتين تم تحقيقه زيادة في الخلايا العصبية من قبل كل من الأساليب. يمكنك بسهولة الرابعة، وحقن الفيروسية أن يؤديها، وبتكاثر موثوق، في مناطق مختلفة من الدماغ الكبار ببساطة عن طريق تغيير إحداثيات التجسيمي. في المقابل، قد الاستهداف الدقيق لمناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي، مثل جذع الدماغ، وتشكيل قرن آمون، أو الحبل الشوكي، عن طريق الصعق الكهربائي داخل الرحم يكون أكثر صعوبة لتحقيق بتكاثر. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن إجراء الحقن التجسيمي على الفئران في أي عمر، ويقتصر الأداء الأمثل للفي الرحم الصعق الكهربائي من نحو E11 E16 ل. وقبل مراحل E11 يتطلب من استخدام الموجات فوق الصوتية المجهر تشتت ارتدادي 18،19 أو طائفة بأكملها الجنينلدى عودتهم نظام 17،20. في الآونة الأخيرة، وقد تم الترويج اهتماما متزايدا في بيولوجيا الخلية الأساسية للخلايا الجذعية الجسدية بسبب ويعتقد دراستهم والتلاعب الأساسية لتكون الخلية رواية نحو تطوير العلاجات المستندة التجدد. ولا سيما بالنسبة للoverexpression من cdk4/cyclinD1، والبروتوكول يوفر وسيلة لدينا لزيادة transitorily توسيع مجلس الأمن القومي في الجسم الحي (الشكل 3B و 4B وC و C) من أجل زيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الكبار. ونحن نعتقد أن هذه قد تكون مهمة التلاعب في عدد من السياقات المختلفة لفهم أفضل لدور مجلس الأمن القومي في تطور الدماغ والتنمية والتوازن وكذلك مساهمتها في الوظيفة الإدراكية أو الشفاء من الضمور العصبي أو الإصابة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> المواد / المعدات </td><td> مزود </td><td> كتالوج # </td><td></td></tr><tr><td> Endofree طقم ماكسي بلازميد </td><td> QIAGEN </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> FastGreen </td><td> سيجما </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> P-97 المشتعلة / براون ماصة مجتذب </td><td> سوتر الآلات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الشعيرات الدموية مع خيوط </td><td> سوتر الآلات </td><td> BF120-69-10 </td><td></td></tr><tr><td> الجدول الحيوانات المختبرية الأعلى التخدير النظام </td><td> VetEquip </td><td> 901806 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> باكستر </td><td> هدغ9623 </td><td></td></tr><tr><td> Germinator 500 حبة الزجاج معقم </td><td> SouthPointe الجراحية </td><td> GRM5-1460 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط القزحية </td><td> WPI </td><td> 15917 </td><td></td></tr><tr><td> Betaisodona الحل </td><td> Mundipharma </td><td> 1931491 </td><td></td></tr><tr><td> مضخة بيكو </td><td> WPI </td><td> PV820 </td><td></td></tr><tr><td> ECM موجة مربع 830 electroporator </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 450052 </td><td></td></tr><tr><td> أقطاب منتاش الجولة </td><td> NEPAGENE </td><td> CUY650P1 </td><td></td></tr><tr><td> خياطة المواد </td><td> Ethicon </td><td> V493H </td><td></td></tr><tr><td> لا اراديمقطع مطبق لإغلاق الجرح </td><td> WPI </td><td> 500345 </td><td></td></tr><tr><td> Temgesic حقن الحل </td><td> إسيكس فارما AG </td></tr><tr><td> DMEM ث / Glutamax I- </td><td> إينفيتروجن </td><td> 31966021 </td><td></td></tr><tr><td> الجنين مصل بوفين </td><td> إينفيتروجن </td><td> 1027016 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين / Streptomicin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> زراعة الأنسجة طبق </td><td> صقر </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Polyethylenimine 250 مل </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 40872-7 </td><td></td></tr><tr><td> N-زبدي حمض، ملح الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> B 5887 </td><td></td></tص&gt; <tr><td> أنبوب، thinwall، polyallomer </td><td> بيكمان </td><td> 326823/331374 </td><td></td></tr><tr><td> نموذج 900 التجسيمي الحيوانات الصغيرة الصك </td><td> KOPF الصكوك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> OPMI بيكو المجهر </td><td> زايس </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYS-Micro4 تحكم وحاقن Nanoliter2000 </td><td> WPI </td><td> B203MC4 </td><td></td></tr><tr><td> استبدال الزجاج 3،5 نانولتر </td><td> WPI </td><td> 4878 </td><td></td></tr><tr><td> SR تطبيق الحفر العام </td><td> Foredam </td><td> K2272 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td><strong&gt; جسم </td><td> مزود </td><td> كتالوج # </td><td> تخفيف </td></tr><tr><td> Doublecortin </td><td> سانتا كروز </td><td> SC8066 </td><td> 1:100 </td></tr><tr><td> GFAP </td><td> Chemicon </td><td> MAB3404 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Nestin </td><td> BD العلوم البيولوجية </td><td> 556309 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> S100β </td><td> Abcam </td><td> Ab868 </td><td> 1:1000 </td></tr><tr><td> Sox2 </td><td> ميليبور </td><td> AB-5603 </td><td> 1:500 </td></tr><tr><td> Tbr2 </td><td> Abcam </td><td> Ab23345 </td><td> 1:400 </td></tr><tr><td colspan="4"> جدول الأجسام المضادة. </td></tr></tbody>
 </table>
 </td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

expansion of embryonic and adult neural stem cells by in utero electroporation or viral stereotaxic injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعموما، الصعق الكهربائي في الرحم ينتج 60-80٪ من الأجنة electroporated عرض تعبير قوي عن الجين مراسل في منطقة واسعة من القشرة الجانبية (الشكل 3A). ويمكن الكشف عن البروتينات الفلورية بسهولة على الأجنة جبل كامل في أقرب وقت 3-6 ساعات بعد الجراحة مع الإشارة امتدت لأكثر من أسبوع واحد. ضمن المنطقة المستهدفة، حوالي 30-50٪ من الخلايا عادة التعبير عن التحوير (s) مع نسبة من الخلايا المشترك، معربا عن اثنين (أو أكثر) شارك في electroporated الجينات المحورة يجري عادة فوق 90٪ (الشكل 3B، اليسار) 6،8 ، 15. في حين يمكن ملاحظة الحد الأدنى من موت الخلايا المبرمج (حوالي 2،0-2،5٪) بعد حوالي 2 ساعة من الصعق الكهربائي، وهذه القيمة تعود إلى مستويات الفسيولوجية (حوالي 0،5-1،0٪) بعد حوالي 6 ساعات (FC، بيانات غير منشورة). نسبة الأجنة أو الفئران الحوامل يموتون بسبب الجراحة عادة لا يكاد يذكر (&lt;5٪). ثم شارك في الصعق الكهربائي مع cdk4/cyclinD1 في ظل هذه الظروف بنسبة 48 ساعات للتنمية يطلق زيادة في توسيع السلف العصبية بنسبة 30٪ (الشكل 3B، والحق، وC) 15. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. توسيع الأسلاف العصبية من قبل cdk4/cyclinD1 overexpression. (A) الصورة الإسفار من خلال قسم القشرة الجانبية للجنين أحد الفئران بعد 24 ساعة من الصعق الكهربائي مع البلازميدات وGFP RFP الجنينية في اليوم 13. (B) كما في الصور نيون A 48 ساعة بعد الصعق الكهربائي بالتعاون مع البلازميدات cdk4/GFP وcyclinD1/RFP وimmunolabeling للعلامة السلف القاعدية Tbr2. للصحفيين الفلورسنت مع counterstainig دابي (يسار) وTbr2 (يمين) وترد. خطوط يدل على السطح القمي للمنطقة البطين (VZ؛ الخط الأبيض) وحدود المنطقة subventricular (SVZ؛ الصفراء الخطوط المتقطعة). لاحظ زيادة ثيckness من SVZ في الجزء electroporated من القشرة (رؤوس سهام بيضاء) وذلك بسبب زيادة جيل الأسلاف وتوسيع القاعدية بعد overexpression من cdk4/cyclinD1. (C) الكمي لتأثير هو مبين في الحانات B. = SD، P &lt;0.05، ن = 3. يؤخذ الرسم البياني بار في C من لانج وآخرون، 2009 15. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن التجسيمي الفيروسية، كاليفورنيا. 80٪ من الفئران التي تديرها عرض التعبير القوي للجينات منقولة في جميع أنحاء التلفيف المسنن في كلها. ويمكن التعبير GFP التأسيسي للكشف بسهولة على 40 ميكرومتر المقاطع بمجرد 4 أيام بعد الجراحة. على طول محور منقاري إلى الذيلية من التلفيف المسنن، حول 10-30٪ من الخلايا (أي ما يعادل ما مجموعه كاليفورنيا. 10،000-30،000 خلايا) تعبير عن عادة التحوير (ق) (الشكل 4A) 9. نسبة الفئران يموتون بسبب عملية جراحية لا يكاد يذكر (&lt;5٪). ثلاثة overexpression أسبوع من cdk4/cyclinD1 في ظل هذه الظروف العوامل التي تسبب زيادة في NSC بنسبة تزيد على سنتينطيات (الشكل 4B)، بينما تتناقص تكوين الخلايا العصبية بنسبة 70٪ (الشكل 4C) 9. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4093/4093fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. آثار العدوى الفيروسية. (A) 3D اعادة اعمار 7 صور مضان اتخذت من 40 ميكرومتر سميكة أقسام الاكليلية مسلسل (1 كل جمع 6) على طول محور منقاري إلى الذيلية من قرن آمون. GFP + وتظهر الخلايا المصابة (الأخضر)، وتلطيخ دابي النووي (الأزرق) من التلفيف المسنن (أعلى). صور مشرقة من ميدان المقاطع الاكليلية مماثلة لتلك المبينة في A (وسط) والتمثيل 3D (أسفل) من نصف الكرة المخية والحصين كله مع أبرز في pseudocolor الخضراء (معدل من أطلس الدماغ ألين؛ <a href="http://www.brain-map.org" target="_blank">www.brain-map.org</a> ) . الأسهم البيضاء تشير إلى موقع الحقن. الجانبي (L)، منقاري (R)، والدريشار إلى SAL (D) محاور (س، ص، ض وإحداثيات التجسيمي) (الحق). (B و C) نسبة nestin + NSC (B) وDCX + الخلايا العصبية الوليد (C) بين السكان من GFP + الخلايا المصابة 3 أسابيع بعد الحقن التجسيمي من GFP (أبيض) أو cdk4/cyclinD1/GFP الفيروسات (السوداء). قضبان = SD، P &lt;0.005، ن = 3. الرسوم البيانية في B و C مأخوذة من Artegiani وآخرون، 2011.

Watch this Scientific Journal Video about Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection at JoVE.com

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ولدت الماوس.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

expansion-embryonic-adult-neural-stem-cells-utero-electroporation-or

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

16.6K Views.  DFG - Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies Dresden, Germany. السيطرة على التوسع في الخلايا الجذعية الجسدية هو أحد العوامل الرئيسية التي تعوق دراستهم واستخدامها في العلاج. نحن هنا وصف نظام للسيطرة على التوسع زمنيا العصبية خلال الخلايا الجذعية التنمية والبلوغ، والتي يمكن استخدامها لزيادة عدد الخلايا العصبية في الدماغ ول?...

Video: Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من قبل موضعيا<em&gt; في الرحم</em&gt; التثقيب الكهربائي و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; ضوء بارد الفرز

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the stem cell community. Many current expansion methods are laborious and costly, and those involving complete dissociation may cause several stem and progenitor cell types to undergo differentiation or early senescence. To overcome these problems, we have developed an automated mechanical passaging method referred to as &#8220;chopping&#8221; that is simple and inexpensive. This technique avoids chemical or enzymatic dissociation into single cells and instead allows for the large-scale expansion of suspended, spheroid cultures that maintain constant cell/cell contact. The chopping method has primarily been used for fetal brain-derived neural progenitor cells or neurospheres, and has recently been published for use with neural stem cells derived from embryonic and induced pluripotent stem cells. The procedure involves seeding neurospheres onto a tissue culture Petri dish and subsequently passing a sharp, sterile blade through the cells effectively automating the tedious process of manually mechanically dissociating each sphere. Suspending cells in culture provides a favorable surface area-to-volume ratio; as over 500,000 cells can be grown within a single neurosphere of less than 0.5 mm in diameter. In one T175 flask, over 50 million cells can grow in suspension cultures compared to only 15 million in adherent cultures. Importantly, the chopping procedure has been used under current good manufacturing practice (cGMP), permitting mass quantity production of clinical-grade cell products.

This protocol describes a novel mechanical chopping method that allows the expansion of spherical neural stem and progenitor cell aggregates without dissociation to a single cell suspension.&#160; Maintaining cell/cell contact allows rapid and stable growth for over 40 passages.

وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

في فيفو إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الغلية المقيمة في الخلايا العصبية المشتركة عن طريق الحقن داخل الدماغ من ناقلات الفيروسية

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian development. In utero electroporation is a key technique for the manipulation of gene expression in the embryonic mammalian brain in vivo. A protocol for in utero electroporation of the embryonic neocortex of ferrets, a small carnivore, is presented here. The ferret is increasingly being used as a model for neocortex development, because its neocortex exhibits a series of anatomical, histological, cellular, and molecular features that are also present in human and nonhuman primates, but absent in rodent models, such as mouse or rat. In utero electroporation was performed at embryonic day (E) 33, a midneurogenesis stage in ferret. In utero electroporation targets neural progenitor cells lining the lateral ventricles of the brain. During neurogenesis, these progenitor cells give rise to all other neural cell types. This work shows representative results and analyses at E37, postnatal day (P) 1, and P16, corresponding to 4, 9, and 24 days after in utero electroporation, respectively. At earlier stages, the progeny of targeted cells consists mainly of various neural progenitor subtypes, whereas at later stages most labeled cells are postmitotic neurons. Thus, in utero electroporation enables the study of the effect of genetic manipulation on the cellular and molecular features of various types of neural cells. Through its effect on various cell populations, in utero electroporation can also be used for the manipulation of histological and anatomical features of the ferret neocortex. Importantly, all these effects are acute and are performed with a spatiotemporal specificity determined by the user.

Presented here is a protocol to perform genetic manipulation in the embryonic ferret brain using in utero electroporation. This method allows for targeting of neural progenitor cells in the neocortex in vivo.

في فيتفو استهداف الخلايا السلف العصبية في النمس نيوكورتكس من قبل في الكهربائية الرحمية

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

الحقن الفيروسي المجسم، وزرع عدسة مؤشر التدرج لتصوير الكالسيوم العميق للدماغ في الجسم الحي

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the lack of proper animal models that fully mimic human diseases and the poor availability of post-mortem human brain tissue. Adult human nervous tissue culture offers the possibility to study different aspects of neurological disorders. Molecular, cellular, and biochemical mechanisms could be easily addressed in this system, as well as testing and validating drugs or different treatments, such as cell-based therapies. This method combines long-term organotypic cultures of the adult human cortex, obtained from epileptic patients undergoing resective surgery, and ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors. This method will allow the study of cell survival, neuronal differentiation, the formation of synaptic inputs and outputs, and the electrophysiological properties of human-derived cells after transplantation into intact adult human cortical tissue. This approach is an important step prior to the development of a 3D human disease modeling platform that will bring basic research closer to the clinical translation of stem cell-based therapies for patients with different neurological disorders and allow the development of new tools for reconstructing damaged neural circuits.

Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation

This protocol describes long-term organotypic cultures of adult human cortex combined with ex vivo intracortical transplantation of induced pluripotent stem cell-derived cortical progenitors, which present a novel methodology to further test stem cell-based therapies for human neurodegenerative disorders.

الثقافات العضوية للقشرة البشرية البالغة كنموذج خارج الجسم الحي لزراعة الخلايا الجذعية البشرية والتحقق من صحتها

Neurodegenerative disorders are common and heterogeneous in terms of their symptoms and cellular affectation, making their study complicated due to the ...