فإن الكتاب أود أن أنوه بدعم من جائزة صموئيل Oschin الشامل منتدى معهد أبحاث السرطان السرطان فضلا عن أموال من معهد الطب التجديدي في سيناي، وغيران الأسرة. وأيد المشروع هو موضح في شكل كور قسيمة CTSI بتمويل من المركز الوطني للبحوث الموارد، منحة UL1RR033176، والآن في المركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم، منحة UL1TR000124. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية من المعاهد الوطنية للصحة.

هذا الإجراء هو وفقا لمتطلبات سيناي IACUC. يجب أن المحققين ضمان الامتثال IACUC المؤسسية قبل المتابعة. ويجب تعقيم جميع الأدوات والكواشف قبل استخدامها. 1. إعداد أدوات، حلول، وخليط الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج 100 ملم البورسليكات النار مصقول أنابيب زجاجية الشعرية في مجتذب micropipette. تعيين التدفئة للسماح للسحب المرجح القياسية لتشكيل غيض من ماصة ما يقرب من 17.5 ملم. قطع نصائح مع مقص جراحي حادة على مسافة حوالي 8-9 ملم من بداية تلميح لإنشاء ما يقرب من 100 ميكرون قطرها الافتتاح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الأسهم 1٪ ث / ت حل سريع الخضراء عن طريق خلط تصفية nuclease خالية من المياه (باستخدام فلتر حقنة 20 ميكرون) مع الأخضر سريع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل النقاء خالية من الذيفان الداخلي الحمض النووي البلازميد الذي يتركز إلى حد كبير (أي&gt; 3 ميكروغرام / ميكرولتر)، مخففة في تريس، EDTA (TE) العازلة. إضافة كميات المطلوب من البلازميدإلى خليط المخفف في TE العازلة وإضافة نسبة من 1٪ 01:10 الحل الأخضر سريع (صنع 0.1٪ ث / ت تركيز النهائي من اللون الأخضر سريع). استخدام تركيز النهائي 0.5-2.0 ميكروغرام / ميكرولتر من البلازميد للتعبير قوية من الجينات المحورة. </li></ol> 2. تخدير الحيوان، ماصة جاري التحميل، وحنوني السطح البلازميد حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث التخدير انخفاض حرارة الجسم على 1-2 يوم الفئران بعد الولادة عن طريق وضعها على طبق بيتري التي يتم وضعها على الجليد لمدة 5-8 دقائق (الوقت يعتمد على عمر الجرو / الوزن). بمجرد تأكيد انخفاض حرارة الجسم بسبب نقص الحركة من و / أو معسر أخمص القدمين الذيل المنعكس، والفئران جاهزة للحقن. وضع الحيوانات على الجليد مرة أخرى إذا ألم وردود الفعل واضحة. إجراء الحقن و electroporation يستغرق أقل من دقيقة 2-3 في مجموع ذلك الوقت انخفاض حرارة الجسم، والحقن، والإجراءات التثقيب الكهربائي وفقا لذلك للحفاظ على التخدير المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء التخدير، وذلك باستخدام ماصة القياسية، ماصة بعناية المطلوب مبلغ plasmiد المزيج ليتم حقنه (0.5-2 ميكرولتر) على قطعة من الفيلم شمع البارافين لتكون مرجعا. هنا، يتم حقن إجمالي حجم 0.5 ميكرولتر من مزيج البلازميد. المقبل، وذلك باستخدام محقن الصغيرة، إدراج بعناية تجميعها ماصة الزجاج الشعرية في أنبوب يحتوي على خليط البلازميد. اتخاذ الاحتياطات إضافية لمنع غيض من كسر عن طريق التأكد من أنها لا تلمس حواف أنبوب. نضح الحل في ماصة عن طريق الاتصال برقم ببطء مرة أخرى الاتصال الهاتفي نقل. مرة واحدة تم تحميل حجم كاف في ماصة، والاتصال الهاتفي إلى الأمام حتى يعود الضغط إلى موقف محايد من 0 HPA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 300-450 HPA الضغط للحقن لضمان الضغط المناسب لملء حتى سطح / الفضاء سحائي حنوني، ضع طرف بالقرب من pipetted حقن شمع البارافين المرجعية فيلم (من 2.2) واستخدام دواسة القدم من حاقن الصغرى لإخراج واحد حجم الفيلم على شمع البارافين. ضبط الضغط وفقا لذلك حتى مبلغ يساوي طرد الاشارة pipetted سابقاحجم البريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم معايرتها غيض، وقد أكدت التخدير، الجراء جاهزة للحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهدف من التجربة هو لحقن مزيج البلازميد تحت الجمجمة وفوق سطح حنوني للسماح ل electroporation الحمض النووي نزولا إلى الأسلاف سطح حنوني (الشكل 1A). لحقن القشرة، مع الاستمرار على الجرو أسفل باستخدام الإبهام والسبابة من اليد أقل هيمنة. نصفي الكرة الأرضية القشرية وهياكل سطحية أخرى مثل أكيمات متفوقة واضحة بين P0 و P2، والسماح لاستهداف السهل من هذه الهياكل (الشكل 1B). باستخدام اليد والهدف المهيمنة في المنطقة المرجوة من القشرة (أي الحركية، الحسية الجسدية، الخ)، وإدراج ماصة الماضية الجلد والجمجمة مع الحرص على تجنب الشرايين الدماغية. تأكد لمنع أي اختراق مزيد من غيض الماضي الجمجمة (التي دلت على عدم وجود مزيد من المقاومة بعد ثقب الجمجمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن البلازماحل معرف باستخدام دواسة القدم لحاقن الصغرى وتأكد من أنه يشتت بالتساوي على (2A الشكل) الأنسجة. ملاحظة: من المهم جدا لتحديد تجريبيا النهج الذي يعظم تسليم البلازميد مع تجنب الورم الدموي بسبب ضغط السائل. ويمكن أن يتم هذا من خلال تعديل مدة الحقن، زاوية، وحجم، وموقع الهدف بدقة لتجنب اضطراب في الأوعية الدموية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من محاولة الحفاظ على غيض من الجفاف في بين الحقن عن طريق وضع قطرات طرف في اختبار من الحقن التي سبق على ورق الشمع أو البارافين فيلم البلاستيك. هذا مطلوب لمنع تراكم رأس تبخرت وتبلور حل الحمض النووي، والتي يمكن أن تؤدي إلى انسداد من طرف وحدات التخزين والتسليم غير متناسقة. </li></ol> 3. التثقيب الكهربائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين Electroporator إلى 135-150 V لمدة خمس البقول ودائم 50 ميللي ثانية، مع 950 ميللي ثانية في فترات بين كل نبضة. من أجل زيادة تصرف ومنع حرق الجلد، وتغطي 3 ملم tweezertrodes البلاتين مع جل التثقيب الكهربائي. تحقق من وجود ردود الافعال-معسر أخمص القدمين والذيل في هذه المرحلة لضمان التخدير. إذا استجابة، ضع على الجليد لعدة دقائق لتخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقشرة (وأكيمة متفوقة) الحقن، توظيف 3 ملم القطب (الشكل 2B) لزيادة قابلية الجراء (بالمقارنة مع 7 - وأقطاب 10 ملم، والتي تستخدم ل electroporation منطقة البطين). وضع مسبار سالبة الشحنة من القطب فوق المنطقة المحقونة والتحقيق المشحونة إيجابيا في جميع أنحاء المنطقة المقابل تحت العين بحيث توجه القطب هو في 45-60 درجة زاوية بالنسبة إلى خط الوسط (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دواسة القدم من electroporator لتحريك الحالية وعقد tweezertrodes في المكان لمدة 3-5 البقول، اعتمادا على العمر والوزن الجرو، واستهداف الحمض النووي على نحو فعال إلى خلايا سطح حنوني الأساسية عند المحاسبة عن انحناءمن نصفي الكرة الأرضية. ملاحظة: يمكن اجتاحت القطب السالب فوق منطقة الحقن في بين النبضات أو يمكن استخدام القطب أكبر لزيادة مساحة electroporated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التثقيب الكهربائي، وتنظيف بعناية قبالة هلام من الجراء ووضعها تحت مصباح الحرارة لمدة 5 دقائق تقريبا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجراء سوف تفقد تماما الوردي المحمر هوى الطبيعية في دقائق بعد التثقيب الكهربائي بسبب زرقة. مراقبة الجراء لاستعادة اللون الطبيعي وبدء الحركة الطبيعية قبل إعادتها إلى أقفاصها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان إعادة التنشئة الاجتماعية مع الأم من خلال مراقبة ما اذا كانت يجلب الجراء العودة إلى العش ويبدأ الاستمالة لهم. إذا كانت تصبح عدوانية، وجعل الجراء متأكد لم يكن لديك بقايا جل واحتضان لهم مع بعض من الفراش لنقل رائحة لالجراء. </li></ol> 4. تعديلات لاستهداف أكيمات متفوقة الاستهداف: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Injeط أكيمة متفوقة في نفس منوال القشرة لكن لاحظ أن المنطقة المستهدفة تقع على بعد الخلفية والجانبية لامدا وتقريبا في خط الوسط (أرقام 3A 3B و). مع حقن ناجحة، هذا المزيج البلازميد بشكل طبيعي يملأ ملامح أكيمة متفوقة. مرة واحدة تم إجراء الحقن بنجاح، الحيوانات مستعدون ل electroporation. </li></ol> التثقيب الكهربائي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بطريقة مشابهة جدا، لحقن أكيمة متفوقة، ووضع مسبار سالبة الشحنة من القطب فوق المنطقة المحقونة والتحقيق موجبة حول العين، خطم أو الذقن، والقيادة الحمض النووي في المناطق السطحية للأكيمة متفوقة (الشكل 3C) . في هذه الحالة، فإن التوجه هو القطب في 25-40 درجة زاوية بالنسبة إلى خط الوسط. </li></ol>

<ol>
	<li>Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+historical+perspective+and+future+prospects.">Neural stem cells: historical perspective and future prospects.</a> Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), (2000).</li><li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells.">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li><li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Everything+that+glitters+isn't+gold:+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses.">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li><li>Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+marginal+zone/layer+I+as+a+novel+niche+for+neurogenesis+and+gliogenesis+in+developing+cerebral+cortex.">The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).</li><li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+genetic+targeting+of+pial+surface+neural+progenitors+and+immature+neurons+by+neonatal+electroporation.">Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation.</a> Neural Dev. 7, (2012).</li><li>Ohira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischemia-induced+neurogenesis+of+neocortical+layer+1+progenitor+cells.">Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells.</a> Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).</li><li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+human+cerebral+cortex:+Boulder+Committee+revisited.">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).</li><li>Schmechel, D. E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Golgi+study+of+radial+glial+cells+in+developing+monkey+telencephalon:+morphogenesis+and+transformation+into+astrocytes.">A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes.</a> Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).</li><li>Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+function+of+the+pial+basement+membrane+in+cortical+histogenesis.">A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis.</a> J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).</li><li>Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+neurons+of+the+human+cerebral+cortex.">The first neurons of the human cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).</li><li>Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidirectional+and+multizonal+tangential+migration+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex.">Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).</li><li>Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+migratory+coordinates+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+mouse+cortex.">Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex.</a> J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).</li><li>Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+route+of+tangentially+migrating+neurons+in+the+developing+neocortical+intermediate+zone.">Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone.</a> J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).</li><li>Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yin+and+yang+of+cortical+layer+1.">The yin and yang of cortical layer 1.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).</li><li>Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+two+new+cortical+interneuronal+circuits.">The organization of two new cortical interneuronal circuits.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).</li><li>Endo, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+different+AMPA-type+glutamate+receptors+in+morphologically+identified+neurons+in+rat+superficial+superior+colliculus.">Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus.</a> Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).</li><li>Schmidt, M., Ozen Boller, M., G, W. C., Hall, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disinhibition+in+rat+superior+colliculus+mediated+by+GABAc+receptors.">Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors.</a> J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).</li><li>Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+waves+coordinate+patterned+activity+throughout+the+developing+visual+system.">Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system.</a> Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).</li><li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes.">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li><li>Boller, M., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+maturation+of+GABA(A)+and+GABA(C)+receptor+function+in+the+mammalian+superior+colliculus.">Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus.</a> Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system:+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery.">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li><li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex.">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).</li><li>De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+circuit+connectivity+in+postmitotic+neocortical+neurons.">In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), (2008).</li><li>Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis.">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat Commun. 3, (2012).</li><li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system.">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li><li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition.">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li><li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+subventricular+zone+electroporation.">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins.">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li><li>Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+monomeric+blue+fluorescent+protein+with+the+high+chemical+stability+of+the+chromophore.">An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الجانب الأكثر أهمية ل electroporation ناجحة من الأسلاف سطح حنوني هي: 1) استهداف مزيج البلازميد إلى سطح حنوني؛ 2) تجنب توليد القيلة في موقع الحقن؛ و 3) تجنب الوفيات المرتبطة التثقيب الكهربائي الدماغ المتوسط. تستهدف بشكل مناسب سطح حنوني يتم ?...

الخلايا الجذعية والسلف العصبية موجودة في جميع أنحاء الثدييات CNS 1، 2. طبيعة وخصائص في مناطق جرثومي الجنينية والكبار المحيطة المناطق البطين من الدماغ والحبل الشوكي التي تم توثيقها على نطاق واسع في العقد الماضي 1-3. في جزء كبير منه، وكان هذا نتيجة لتطور أدوات الجينية على نحو متزايد دقيقة، مثل الجهاز العصبي محددة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية الأليلات floxed أو النسب فيروسات تتبع 4. ومع ذلك، المنطقة سلف واحد الفحص الشامل لديه منطقة حنوني السلف السطح فقط في الآونة الأخيرة وصفها بأي قدر من التفصيل 5-7 وينتظر. يتم تعريف سطح حنوني من الدماغ كواجهة بين سطح الدماغ والسحايا المحيطة 8. خلال التنمية، الظهارية العصبية و، في وقت لاحق، قدم نهاية شعاعي الدبقية نعلق على هذا السطح 9،10. بعض التنوبويلاحظ الخلايا العصبية في الدماغ الواحد والإنسان والعديد من mitoses الخلايا العصبية في هذه المنطقة 11. في وقت لاحق، خلال تكوين الخلايا العصبية الجنينية، ومن المعروف interneurons القشرية لاجتياز المنطقة حنوني، بالإضافة إلى طرق الهجرة في منطقة المتوسط ​​ومنطقة subventricular 12-14. خلال هذه الفترة، والخلايا الجذعية يمكن تربيتها من هذه المنطقة، ويبدو أن يكون موقع نشط من العصبية وgliogenesis 5. في الدماغ الكبار، فقد أفيد أن interneurons يمكن أن يولد من الأسلاف سطح حنوني التالية التحدي ميتة 7. ومع ذلك، فقد ظلت مساهمة هذه المنطقة إلى بلده لgenensis أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة غامضا ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة تحديدا التحقيق في هذه المنطقة 6. في أكيمة متفوقة وفي القشرة الدماغية، قد interneurons سطحية (أو طبقة أنا في القشرة) تعدل دائرة الانتاج من السكان الكامنة الخلايا العصبية مثير، وبالتالي المساهمة significantly إلى وظيفة هذه الهياكل. على وجه الخصوص، طبقة 1 interneurons في موقف رئيس لتنظيم إطلاق الخلايا العصبية في جميع أنحاء الطبقات العليا من القشرة المخية نظرا التواصل فيما بينها واسعة إلى الطبقات السطحية والعميقة من الأعمدة القشرية 15،16. بطريقة مماثلة، وتلقي interneurons الأفقي المدخلات مثير من الألياف القشرية وشبكية العين، مشروع على مساحة واسعة نسبيا ويتم المضاربة للتوسط تثبيط السكان العصبية الاستجابة للمحفزات البصرية البعيدة 17،18. أيضا، مورفولوجيا بهم هو مناسبة تماما للعب دور محتمل في النشاط موجة منقوشة في النظام البصري النامية 19. ومن المثير للاهتمام، والتنمية عصبون والنضج يحدث إلى حد كبير بعد الولادة. علاوة على ذلك، تم العثور على هذه العملية النضج إلى أن ينظم نشاط الخلايا العصبية وبالتالي فهي ركيزة من اللدونة التنموية مع عواقب مدى الحياة على حلبة ظيفة 20،21. والجدير بالذكر أن نموصوفة س المروجين والتي يمكن أن تستهدف بشكل خاص هذه الخلايا transgenically. يمكن أن تستهدف تقسيم الأسلاف مع الارتجاعي 7 ولكن الإنتاج الفيروس هو مضيعة للوقت وتتطلب مهارة لانتاج التتر عالية اللازمة لتنبيغ الخلية. وقد أدى التثقيب الكهربائي إلى نهضة في دراسة النمو العصبي لأنه يسمح للاستجواب الوراثية السريع والفعال للمسارات الإشارات العصبية في الأسلاف 4، 22، 23. التثقيب الكهربائي ينطوي على حقن الحمض النووي البلازميد، تليها إيصال النبضات الكهربائية إلى الخارج من الرأس، لدفع unidirectionally الحمض النووي في الأسلاف المتكاثرة المحيطة البطينين 4، 22، 23. يبدو التثقيب الكهربائي يتطلب العبور من الخلايا من خلال المرحلة M من دورة الخلية للتعبير عن الجينات المحورة البلازميد 24. على وجه التحديد، وقد وجد أن فقطوالخلايا التي تمر عبر مرحلة M في غضون 8 ساعة من التثقيب الكهربائي من البلازميدات التعبير عن الجينات المحورة على الرغم من التنفيذ الفعال لجميع الخلايا داخل ~ 160 ميكرون من جدار البطين 24. وتكهن بأن هذا يرجع إلى الحاجة إلى المغلف النووية انهيار في السماح للوصول النووية من البلازميدات episomal، والمواد الكيميائية التي تسبب permeabilization النووية يمكن أن تحفز التعبير عن البلازميدات في خلايا آخر الإنقسامية 25. يعملون أصلا في الجنين 22، تم تكييفها للاستخدام التثقيب الكهربائي في الدماغ ما بعد الولادة في وقت لاحق من ذلك بكثير 26، 27. في الآونة الأخيرة، ونحن تكيفت التثقيب الكهربائي لاستخدامها في التلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني 6. علاوة على ذلك، باستخدام هذا النهج أظهرنا أن هناك على ما يبدو اثنين الأنساب متميزة من الأسلاف في هذه المنطقة interneuronal ونجمي 6. تفاصيل هذا البروتوكول طريقة بسيطة وسريعة، وقوية لاستهداف هذه الخلايا للاستجوابتطوير آليات تنظيم هذه الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:695px;" width="694">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:248px;">Item Name</td>
			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

على مدى السنوات العديدة الماضية تم التعرف على سطح حنوني كما محراب جرثومي من أهمية خلال الجنينية، ما حول الولادة والكبار العصبية وgliogenesis، بما في ذلك بعد الاصابة. ومع ذلك، وأساليب للاستجواب وراثيا هؤلاء السكان السلف وتتبع الأنساب الخاصة بهم كان محدودا نظرا لعدم وجود خصوصية أو تستغرق وقتا طويلا إنتاج الفيروسات. وبالتالي، فقد كان التقدم في هذه المنطقة بطيئة نسبيا مع عدد قليل من التحقيقات في هذا الموقع. وقد استخدم التثقيب الكهربائي لأكثر من عقد لدراسة خصائص الخلايا الجذعية العصبية في الأجنة، ومؤخرا في الدماغ بعد الولادة. نحن هنا وصف تقنية فعالة وسريعة، وبسيطة للتلاعب الجيني للأسلاف سطح حنوني استنادا إلى نهج التثقيب الكهربائي تكييفها. حنوني التثقيب الكهربائي سطح يسمح لوضع العلامات الوراثية السطحية والتلاعب من هذه الأسلاف، وبالتالي تمثل منهجا لتوفير الوقت واقتصادية لدراسة هذه الخلايا.

حنوني السطح نتائج التثقيب الكهربائي في التعبير من الحمض النووي البلازميد في الخلايا معظمهم من الأسلاف، عند أو بالقرب من سطح حنوني 6. وبشكل أكثر تحديدا، واتجاه الأقطاب أمر بالغ الأهمية في فرض اتجاه حركة البلازميد والتعبير اللاحقة. وهكذا، في تكوينات القطب المزد?...

Watch this Scientific Journal Video about Neonatal Pial Surface Electroporation at JoVE.com

Neonatal Pial Surface Electroporation

سطح حنوني هي منطقة فريدة من نوعها السلف في الجهاز العصبي المركزي الذي يتلقى اهتماما متزايدا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة للتلاعب الجيني السريع في هذه المنطقة السلف باستخدام أسلوب التثقيب الكهربائي تعديلها. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيقات الخلوية والجزيئية الأنساب الخلية ومسارات الإشارات المشاركة في تمايز الخلايا واستجلاء مصير وخصائص الخلايا الوليدة.

حديثي الولادة حنوني التثقيب الكهربائي السطحية

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  Cedars-Sinai Medical Center.  سطح حنوني هي منطقة فريدة من نوعها السلف في الجهاز العصبي المركزي الذي يتلقى اهتماما متزايدا. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة للتلاعب الجيني السريع في هذه المنطقة السلف باستخدام أسلوب التثقيب الكهربائي تعديلها. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيقا?...

Video: Neonatal Pial Surface Electroporation

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

فأر في الرحم Electroporation : الشواهد ترنسفكأيشن جين Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

الوليد الصعق الكهربائي المنطقة Subventricular

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

-النوع الفرعي انتقائية Electroporation للمن القشرية Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

الحبل الشوكي العصبونات العزلة والثقافة من الفئران حديثي الولادة

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying neonatal seizures and hypoxia ischemia. This manuscript describes a method for continuous video electroencephalogram (EEG) monitoring in neonatal mice to detect seizures and analyze EEG background during hypoxia ischemia. Use of video and EEG in conjunction allows description of seizure semiology and confirmation of seizures. This method also allows analysis of power spectrograms and EEG background pattern trends over the experimental time period. In this hypoxia ischemia model, the method allows EEG recording prior to injury to obtain a normative baseline and during injury and recovery. Total monitoring time is limited by the inability to separate pups from the mother for longer than four hours. Although, we have used a model of hypoxic-ischemic seizures in this manuscript, this method for neonatal video EEG monitoring could be applied to diverse disease and seizure models in rodents.

This manuscript describes a method for continuous video EEG recordings using multiple depth electrodes in neonatal mice undergoing hypoxia-ischemia.

تصوير كهربية الدماغ بالفيديو المستمر أثناء نقص الأكسيجة -الإقفارية في فئران حديثي الولادة

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and lifelong neurological deficits. While PHH can be treated by temporary and permanent cerebrospinal fluid (CSF) diversion procedures (ventricular reservoir and ventriculoperitoneal shunt, respectively), there are no pharmacological strategies to prevent or treat IVH-induced brain injury and hydrocephalus. Animal models are needed to better understand the pathophysiology of IVH and test pharmacological treatments. While there are existing models of neonatal IVH, those that reliably result in hydrocephalus are often limited by the necessity for large-volume injections, which may complicate modeling of the pathology or introduce variability in the clinical phenotype observed.
Recent clinical studies have implicated hemoglobin and ferritin in causing ventricular enlargement after IVH. Here, we develop a straightforward animal model that mimics the clinical phenotype of PHH utilizing small-volume intraventricular injections of the blood breakdown product hemoglobin. In addition to reliably inducing ventricular enlargement and hydrocephalus, this model results in white matter injury, inflammation, and immune cell infiltration in periventricular and white matter regions. This paper describes this clinically relevant, simple method for modeling IVH-PHH in neonatal rats using intraventricular injection and presents methods for quantifying ventricle size post injection.

We present a model of neonatal intraventricular hemorrhage using rat pups that mimics the pathology seen in humans.

نمذجة النزف داخل البطيني الوليدي من خلال الحقن داخل البطيني للهيموغلوبين

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

مسح الدماغ الوليدي الدقيق للدماغ ومعالجة الصور

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

تسليط الضوء على المؤلف: تصوير عالي الدقة لأدمغة حديثي الولادة في الفأر - بروتوكول التصوير المقطعي المحوسب الدقيق مع عامل تباين محلول Lugol

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

التصوير المقطعي المحوسب الدقيق والتحليل المورفومتري لأدمغة حديثي الولادة في الفئران

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...