الكتاب أود أن أشكر Emilija Renke وجانيت يو للمساعدة التقنية. ويدعم DCN من المنح المقدمة من وزارة دفاع الولايات المتحدة (DR080205، DM102823، OR09055، وOR090059). ويدعم RDH بمنحة من التجربة ميريلاند محطة الزراعة ومنحة المعاهد الوطنية للصحة في التدريب الخلية والبيولوجيا الجزيئية.

1. تحديد شروط تدفئة الأمثل أولا، لا بد من تحديد تجريبيا على حرارة الحضانة الأمثل والوقت لاستخدام للخطوة التدفئة في الفحص. لنموذجنا PlyC، من المهم أن نلاحظ أن E. وقد تبين القولونية شارك في تحول الجينات ومع plyCA plyCB على البلازميدات التعبير منفصلة لتشكيل عميم الإنزيم تعمل بكامل طاقتها PlyC 6. تم تكييف ال 96 لوحة جيدا عيار مكروي وكذلك إعداد الشروط نمو الخلايا والطلاء طبق تقنية لاحقة من الأمثلة الواردة في أدبيات 12-16. ووقت 30 دقيقة من الحضانة تكون مناسبة لهذا الاختبار عن نتائج التجارب السابقة من تعطيل الحرارية تملي خسارة سريعة في النشاط خلال المدى القصير الحضانة في بيئات تتجاوز درجة الحرارة الفسيولوجية (المراقبة غير منشورة). تم توضيح درجة الحرارة المثلى لحضانة PlyC من الخطوات التالية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترانsform التعبير بناء pBAD24: plyCA (الأمبير ص) في E. المختصة القولونية سلالة DH5α pBAD33: plyCB (سم ص). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة للtransformants على لوحة لوريا Bertani-أجار (LB) تستكمل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (35 ميكروغرام / مل). احتضان لوحات ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيار مكروي وحة بغطاء التي تحتوي على 200 ميكرولتر من LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكول مع مسواك العقيمة، تطعيم مستعمرة الفردية في كل صف من الآبار (الشكل 2A) أن 96 في العقيمة، واضحة، ذات قاع مسطح بشكل جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع آمن ال 96 لوحة جيدا عيار مكروي على 37 درجة مئوية وتنمو تهز حاضنة للبكتيريا بين عشية وضحاها في 300 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد ال 96 لوحة جيدا من عيار مكروي 37 ° C تهز الحاضنة والمقلدة لوحة جديدة لوحة 96 عيار مكروي جيدا على النحو التالي: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة 180 ميكرولتر من LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكولإلى كل بئر من لوحة متماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 20 ميكرولتر من البكتيريا من لوحة أصلية للآبار المقابلة في لوحة متماثلة. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى 600 OD الأولى من ~ 0.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع آمن لوحة طبق على 37 درجة مئوية الحاضنة واحتضان تهز لوحة لمدة 1 ساعة في 300 دورة في الدقيقة، ثم يضاف inductant. في حالة الأنظمة التعبير pBAD، وinductant هو أرابينوز 0.25٪. قد نظم التعبير الأخرى تتطلب inductants مختلفة. وضع لوحة على عودة 37 ° C تهز الحاضنة واهتزاز في 300 دورة في الدقيقة لساعة 4 إضافية للسماح للتعبير البروتين. مستويات التعبير عادة ما تتراوح بين 10-20 ميكروغرام من PlyC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة بروتين تعبير أبرمت واسترجاعها لوحة المقلدة وبيليه البكتيريا عن طريق وضع لوحة ال 96 عيار مكروي بشكل جيد في أجهزة الطرد المركزي المبردة التي تحتوي على الدوار يتأرجح-96 دلو الذي يناسب وحات microtiter أيضا. أجهزة الطرد المركزي في 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وسائل الإعلام من قلب ببطء وحة عيار مكروي والصب بلطف وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من B-PER II الجرثومي بروتين الكاشف لاستخراج كل بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزنة في زيادة حجم كل بئر إلى 120 ميكرولتر من خلال إضافة 70 ميكرولتر من الفوسفات الملحي (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الانقاض غير قابلة للذوبان الخلوية من خلال الدوران في لوحة 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أجهزة الطرد المركزي المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 110 ميكرولتر من الخام القابلة للذوبان المحللة للآبار المقابلة لوحة 96 thermocycler أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 30 دقيقة وفترة حضانة محددة سلفا، تعرض لست] ذوبان يقيم حاليا في لوحة 96 thermocycler جيدا لمجموعة واسعة تمتد الانحدار درجة حرارة 15-20 ° C. ملاحظة، والهدف من ذلك هو تحديد ما في درجة حرارة انزيم معين يفقد&gt; نشاط الحفاز 95٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، احتضان ال 96 جيداthermocycler لوحة في 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ونقل 100 ميكرولتر من ذوبان لست] من لوحة 96 thermocycler جيدا لموقعها جيدا في المقابلة النهائية ال 96 لوحة جيدا عيار مكروي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع multipipettor 12-قناة، إضافة 100 ميكرولتر من سلالة GAS D471 إلى كل بئر. علما، ومجفف بالتجميد في الأصل D471 الخلايا من الثقافات بين عشية وضحاها ومعلق مع الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى PBS الحصول على OD 600 من ~ 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على الفور وحة 96 بشكل جيد في معمل صفيحة ميكروسكوبية ورصد حركية إنزيم عن طريق قياس OD 600 ثانية كل 20 دقيقة 15 ل. يتم تعريف الحضانة الحرارة الصغرى التي تتوافق مع الآبار التي تفتقر إلى تغير في كثافة بصرية (ΔOD ≤ 0.1) ودرجة حرارة غير متساهل. </li></ol> بعد يتم تنفيذ شاشة واسعة لتحديد درجة الحرارة درجة الحرارة غير متساهلة، ويمكن تكرار الخطوات المذكورة أعلاه على نطاق وضيق من درجات الحرارة أكثر (5 ° -10 ° C) لتوضيحوغير متساهلة دقيقة درجة الحرارة للانزيم في المصالح. ملاحظة، قد درجة حرارة غير متساهل المحددة في هذا الاختبار أن تكون مختلفة من درجة حرارة انصهار توضيح بوسائل أخرى بسبب الاختلافات في الحجم، التركيز، الخ. 2. توليد مكتبة المسخ إنشاء مكتبة متحولة ليتم عرضه بشكل عشوائي ينطوي على دمج الطفرات من قبل البلمرة DNA عرضة للخطأ مع الحد الأدنى من التحيز النوكليوتيدات في الجينات باستخدام plyCA II GeneMorph كيت الطفرات عشوائية على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم الاشعال النوكليوتيدات مع درجات حرارة انصهار مماثل (T م) بين 55-72 درجة مئوية مع مواقع تقييد الاختيار في 5 &#39;و 3&#39; نهايات الجين plyCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ الطفرة المرجوة معدل النيوكليوتيدات هي 2-3 في plyCA (1.4 KB)، استخدم عنصر تفاعل PCR تركيزات فضلا عن الظروف thermocycler موصى بها من قبل الشركة المصنعة لو طفرة منخفضةrequencies (0-4،5 في KB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ الجينات mutagenized plyCA في ناقلات التعبير pBAD24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل إلى بنيات DH5α pBAD33: plyCB الخلفية وtransformants على لوحات أجار لوحة LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى ذلك، وتحويل لوحة DH5α pBAD33: plyCB مع ناقلات التعبير pBAD24 التي تحتوي على الجينات plyCA WT. سوف المستعمرات من هذه اللوحة بمثابة الضوابط أثناء الفرز. </li></ol> 3. 96 لوحة عيار مكروي حسنا إعداد وشروط نمو الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة 96 عيار مكروي جيدا مع 200 ميكرولتر من LB تستكمل مع الأمبيسلين والكلورامفينيكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التخطيطي لوحة عيار مكروي (الشكل 2B)، حدد بعناية مستعمرة فردية من لوحات أجار بين عشية وضحاها مع مسواك تعقيم وتطعيم البكتيريا في جيش التحرير الشعبى الصينى المعين جيدا ال 96 عيار مكروي جيداالشركة المصرية للاتصالات. لا بد من ضمان واحد فقط مستعمرة لكل بئر يتم تلقيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز آمن الراسية 96 لوحة جيدا عيار مكروي في 300 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية. </li></ol> 4. تصفيح طبق الاصل، البروتين الحث التعبير وإعداد المحللة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات من 1،5-1،11 من الجزء الموجود بعنوان &quot;تحديد الظروف المثلى التدفئة&quot; مع واحد التعديل. تخزين لوحة أصلية في 4 درجات مئوية بعد خطوة الطلاء طبق الاصل وقد خلص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الخطوة 1.11، نقل 110 ميكرولتر من الخام القابلة للذوبان المحللة للآبار المقابلة لوحة 96 thermocycler جيدا باستثناء لمراقبة الآبار إيجابية A1-D1. وفيما يتعلق لست] مراقبة إيجابية (أي لست] التي لم يتم تسخينها)، ونقل 100 ميكرولتر من الآبار لست] إلى المقابلة في 96 الجديدة لوحة عيار مكروي جيدا أن سيكون بمثابة لوحة الفحص النهائي للتجربة ومتجر على الجليد. </li></ol> 5. المعالجة الحرارية للذوبان المحللة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين السيطرة السلبية وقابل للذوبان متحولة لست] محصورة حاليا في thermocycler وحة 96 بشكل جيد في thermocycler لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الحضانة الأمثل غير متساهل تحديده في الخطوة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة درجة الحرارة غير متساهل، احتضان ال 96 لوحة جيدا في thermocycler C ° 4 لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 100 ميكرولتر من ذوبان لست] من لوحة 96 thermocycler جيدا إلى مواقعها جيدا متطابقة في ال 96 جيدا النهائي عيار مكروي وحة الفحص التي تحتوي بالفعل لست] مراقبة إيجابية للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع multipipettor 12-قناة، إضافة 100 ميكرولتر من سلالة GAS D471 إلى كل بئر. وضع لوحة على الفور في معمل صفيحة ميكروسكوبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد حركية إنزيم عن طريق قياس ال 600 OD كل ثانية 15 ل20 دقيقة. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعريف متغير PlyC مع السلوك الحراري تقدم بوصفها بناء التي يمكن أن تقلل من كثافة الأصلي البصرية بنسبة 50 في المئة في أقل من 900 ثانية فيغير متساهل درجة الحرارة. بالإضافة إلى ذلك، والضوابط الإيجابية (أي غير مدفأ، WT PlyC) تحتاج إلى عرض نشاط الحفاز WT (ر 1/2 ≤ 100 ثانية) والضوابط السلبية (أي تسخين، WT PlyC) يجب أن تكون خالية من النشاط. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في متغير PlyC مع تقدم يتم تعريف السلوك الحراري واسترجاعها لوحة الأصلي المخزنة عند 4 ° C البكتيريا وتطعيم من شخص معين بشكل جيد للمتحولة من الاهتمام إلى وسائل الإعلام LB تستكمل مع الأمبيسلين الطازجة والكلورامفينيكول. نمو اللقاح بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج وتنقية DNA البلازميد من الثقافة و من ثم النقر على التسلسل من أجل تحديد الطفرات النوكليوتيدات أن نستنتج السلوك الحراري لتعزيز PlyCA. بالإضافة إلى ذلك، لتكملة قسامة صغيرة من الجلسرين مع الثقافة بين عشية وضحاها 10٪ وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى. </li></ol>

<ol>
	<li>Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+design+by+directed+evolution.">Protein design by directed evolution.</a> Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).</li><li>Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+orthogonal+nucleoside+analog+kinase+via+fluorescence-activated+cell+sorting.">Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting.</a> Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).</li><li>Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+lysins+as+effective+antibacterials.">Bacteriophage lysins as effective antibacterials.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).</li><li>Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinventing+phage+therapy:+are+the+parts+greater+than+the+sum.">Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum.</a> Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).</li><li>Loessner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+endolysins--current+state+of+research+and+applications.">Bacteriophage endolysins--current state of research and applications.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).</li><li>Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlyC:+A+multimeric+bacteriophage+lysin.">PlyC: A multimeric bacteriophage lysin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).</li><li>Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+elimination+of+upper+respiratory+colonization+of+mice+by+group+A+streptococci+using+a+bacteriophage+lytic+enzyme.">Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).</li><li>Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysK,+the+enzyme+lysing+Staphylococcus+aureus+cells:+specific+kinetic+features+and+approaches+towards+stabilization.">LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization.</a> Biochimie. 92, 507-513 (2010).</li><li>Varea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+thermodynamic+characterization+of+Pal,+a+phage+natural+chimeric+lysin+active+against+pneumococci.">Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci.</a> J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).</li><li>Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+and+cooperative+domains+of+CPL1+lysozyme+and+its+NH2-+and+COOH-terminal+modules.+Dependence+on+choline+binding.">Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding.</a> J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).</li><li>Anderson, G., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+product+shelf+life+and+activation+energy+for+five+drugs+of+abuse.">Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse.</a> Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).</li><li>Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+novel+N-carbamylase/D-hydantoinase+fusion+enzyme+for+functional+expression+with+enhanced+stability.">Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability.</a> Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).</li><li>Koutsioulis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+on+the+cold+adapted+properties+of+TAB5+alkaline+phosphatase.">Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase.</a> Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).</li><li>McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+catalytic+efficiency+and+active+site+modification+of+1,4-beta-D-glucan+glucohydrolase+A+from+Thermotoga+neapolitana+by+directed+evolution.">Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution.</a> J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).</li><li>Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolved+xylose+transporter+from+Zymomonas+mobilis+enhances+sugar+transport+in+Escherichia+coli.">An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli.</a> Microbial cell factories. 8, 66 (2009).</li><li>Tsuzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostable+mutants+of+the+photoprotein+aequorin+obtained+by+in+vitro+evolution.">Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution.</a> J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).</li><li>Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+enzyme+stability.">Directed evolution of enzyme stability.</a> Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).</li><li>Kumar, S., Nussinov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+thermophilic+proteins+deal+with+heat.">How do thermophilic proteins deal with heat.</a> Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).</li><li>Hibbert, E. G., Dalby, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+strategies+for+improved+enzymatic+performance.">Directed evolution strategies for improved enzymatic performance.</a> Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).</li><li>Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+random+mutagenesis+by+error-prone+polymerase+chain+reaction+protocols,+Escherichia+coli+mutator+strain,+and+hydroxylamine+treatment.">Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment.</a> Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).</li><li>Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+random+mutagenesis+methods+used+for+directed+protein+evolution.">A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution.</a> J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).</li><li>Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+adapt:+lessons+from+directed+evolution.">How enzymes adapt: lessons from directed evolution.</a> Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا البروتوكول، المبينة في الشكل 1، ويعرض أن 96 لوحة جيدا عيار مكروي المنهجية التي يسمح احد للاستفادة من التطور الموجه لزيادة صمود للحرارة من أي جراثيم الانزيم. من خلال استخدام الحمض النووي لبوليميراز عرضة للخطأ، يمكن للمرء أن أعرض الطفرات العشوائية التي تزيد من الاستقرار العام الحركية للجزيء للجراثيم مترجمة من الفائدة، وهو عادة بسبب عمليات إعادة التنظيم الجزيئي التي تتكون من زيادة كهرباء، ثاني كبريتيد الجسر والتفاعلات التي تولد مسعور تحسين الجزيئية التعبئة، وتعزيز شبكات التعديلات الشحنة السطحية أو تعزيز حالة ارتفاع oligomerization 17-18. بعد إدخال طفرات النوكليوتيدات، ثم تم استخدام إجراء فحص واسعة النطاق لتحديد الطفرات التي تعود بالفائدة حراريا. واستندت النتائج على ممثل المقدمة هنا جولة واحدة من الطفرات العشوائية. في الواقع، وقد اقترح أنعلى الأقل ثلاث جولات متتالية من الطفرات العشوائية، باستخدام كل متحولة أقوى والانزيم الرصاص، تليها خلط الحمض النووي هو مناسبة لهذه الأنواع من الدراسات الموجهة تطور السلوك الحراري 2. من المهم أن نفهم أنه في حين أن هذا البروتوكول يحدد الطفرات التي تزيد الاستقرار الحركي، لا هذه المتغيرات بالضرورة زادت صمود للحرارة. ويعتبر جزيء بالحرارة عندما يكون لديه القدرة على الاحتفاظ هيكلها عند درجة حرارة عالية. ومع ذلك، في مقايسة المقدمة، لا يعاير النشاط المتبقية لللست] متحولة في نفس درجة الحرارة التي حضنت في البداية أنها في أثناء العلاج الحرارة خطوة وبالتالي يمكن للمرء أن يكون اختيار الطفرات التي لتعزيز صمود للحرارة طوي ثانية بدلا من تعزيز 19. بينما نحن استقراء السلوك الحراري مؤشرا على الاستقرار الحراري، يجب أن تقاس الاستقرار الحراري صحيح تجريبيا بواسطة biophysطرق كال مثل ازدواج اللون دائرية (CD)، الفرق الكالوري المسح الضوئي (DSC) والفرق fluorimetry المسح (DSF). البيانات الأولية من التجارب CD مهرجان دبي للتسوق وتشير إلى أن العديد من المرشحين من تحديد المنهجية المقدمة لا تقدم عرض الواقع صمود للحرارة (لا تظهر البيانات). على الرغم من أن المنهجية المقدمة هنا هي محددة لتنفيذ السلوك الحراري لزيادة PlyC يمكن، بالإضافة إلى ذلك نفس هذه المنهجية أن تستخدم لتعزيز نشاط الانزيمات الحرارية لجراثيم أخرى مع بعض التعديلات الطفيفة على متغيرات مثل المخازن المؤقتة، ومعدلات الطفرات، والظروف أنظمة التدفئة والتعبير. متغير واحد الحرجة المرتبطة بهذا الفحص يتصل معدل الطفرة النوكليوتيدات من البلمرة DNA عرضة للخطأ. اخترنا لاستخدام عرضة للخطأ DNA بوليميراز الثاني Mutazyme في مقايسة لدينا التطور الموجه بسبب الأدلة التجريبية تشير هذا الانزيم خاص يعرض أقل قدر من التحيز معوتدرج بشكل عشوائي يتعلق النيوكليوتيدات التي في الجينات ذات الاهتمام بالمقارنة مع غيرها من تقنيات الطفرات العشوائية مثل استخدام هيدروكسيل، mutator E. سلالات القولونية وغيرها من DNA عرضة للخطأ polyermases 20. بشكل عام، وانخفاض معدلات طفرة تميل إلى أن تكون أكثر من المرغوب فيه لسببين. أولا، صمود للحرارة الهندسية للبروتينات تتكون عادة من عدد قليل نسبيا من بدائل الأحماض الأمينية. يمكن أن يسبب ارتفاع معدلات طفرة هائلة التغييرات الهيكلية لجزيئات معينة التي يمكن أن تؤدي بشكل قاطع في misfolding التناقضات الهيكلية والوظيفية. على سبيل المثال، يمكن دمج جليكاين وبقايا البرولين تعطيل هياكل حلزونية ألفا الثانوية 21. ، وارتفاع معدلات الطفرة النوكليوتيدات الثاني يزيد من فرص دمج المبكرة الكودونات توقف، مما أدى إلى اقتطاع الجزيئات التي هي غير نشطة بيولوجيا. بشكل عام، ويفضل انخفاض أسعار طفرة بسبب انخفاض معدلات نتيجة خطأ في بطاريات لأوجه من الطفرات على التكيف مع ارتفاع معدلات توليد الطفرات طفرة محايدة أو ضارة 22. لكل جولة من الطفرات العشوائية، وآخر متغير الحرجة التي يجب على المرء أن تحسين ينطوي على درجة حرارة الحضانة المستخدمة أثناء عملية الفرز. اختيار درجة الحرارة غير متساهلة نسبيا التجريبية يمثل تحديا. كنا في البداية درجة حرارة الحضانة التي كانت 10 ° C أعلى من درجة حرارة غير متساهل من PlyC، ولكن بعد فحص 3000 المسوخ، لم نتمكن من تحديد أي الطفرات المفيدة. مع الأخذ في الاعتبار منهجيات التطور الموجه تتكون من تحديد بدائل مفيدة بشكل تسلسلي الأحماض الأمينية التي لها آثار المضافة، تقرر أنه ينبغي استخدام درجة حرارة أقل صرامة خلال عملية الفرز حتى لو كان زيادة الفرصة لتوليد ايجابيات كاذبة. على هذا النحو، استخدمنا درجة حرارة الحضانة الذي كان فقط بضع درجات فوق permiss غيرإيف درجة الحرارة والمرشحين المختارين rescreened استبعاد ايجابيات كاذبة. قررنا استخدام درجة حرارة الحضانة لم يكن المعتدلة جدا (≤ 1 ° C أدنى درجة حرارة أعلى من غير متساهل) والعكس ليس قاسيا جدا (≥ 5 ° C أدنى درجة حرارة أعلى من غير متساهل). كانت درجة الحرارة المثالية قررنا استخدامها في هذا الاختبار خاص (أ) 2 ° C معتدل درجة الحرارة أعلى من غير متساهل تحديد تجريبيا. واختيار درجة الحرارة التي هي خفيفة جدا يؤدي إلى معدل أعلى بكثير كاذبة تحديد إيجابية من 20٪ ~ احظنا (الجدول الأول) عند استخدام درجة حرارة معتدلة الحضانة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام درجة حرارة الحضانة التي هي قاسية جدا تؤدي في نهاية المطاف عدم القدرة على تحديد الطفرات مع السلوك الحراري المعزز بشكل ملحوظ. على سبيل المثال، باستخدام درجة حرارة حضانة ≥ 5 ° C قد أدت في عدم القدرة على تحديدوعد متحولة 29C3 فضلا عن غالبية المرشحين الآخرين المحددة أثناء الجولة الأولى من الفرز. في الجمع، ونحن نقدم بروتوكول للجراثيم الانزيمات الهندسة للحصول على الاستقرار الحركية المحسنة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الاختبار نفسه، دون الخطوات التدفئة، للكشف عن الطفرات التي تزيد نشاط الحفاز. زيادة كل من صمود للحرارة ونشاط الحفاز يشكل عقبة هامة التنموية التي تواجه أي انزيم العلاجية. في حين أن تفاصيل هذا البروتوكول هي محددة إلى حالة جوانية PlyC، يمكن تكييف منهجية لأي إنزيم للجراثيم مع بعض التعديلات قليلة فقط. قدمنا ​​النتائج الأولية من الجولة الأولى فقط من الطفرات من صحة هذه الوظيفة من الفحص، مما أدى إلى تنفيذ وتحديد الطفرات التي تولد زيادة في حجم الجزيئي للصمود للحرارة كبيرة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> B-PER II استخراج البروتين البكتيري الكاشف </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> GeneMorph II كيت الطفرات عشوائية </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> مسح 96 حسنا، لوحة مسطحة القاع عيار مكروي مع غطاء </td><td> BD Vacutainer المختبرات الطبية الطبية </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 Nonskirted حسنا لوحات PCR </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> سوينغ دلو الدوار </td><td> إيبندورف </td><td> A-2-برنامج عمل الدوحة </td></tr><tr><td> أمبيسلين الصوديوم ملح </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> الكلورامفينيكول </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP904 </TD&gt; </tr><tr><td> أرابينوز </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> pBAD24 التعبير المتجهات </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> pBAD33 التعبير المتجهات </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

ويعرف التطور الموجه كوسيلة لتسخير الانتقاء الطبيعي من أجل هندسة البروتينات للحصول على خصائص خاصة التي لا ترتبط مع البروتين في الطبيعة. وقد وفرت الأدب أمثلة عديدة فيما يتعلق بتنفيذ التطور الموجه لتغيير بنجاح خصوصية الجزيئية والحفز 1. والميزة الرئيسية لاستخدام التطور الموجه بدلا من اتباع نهج أكثر عقلانية على أساس الهندسة الجزيئية لليتصل حجم وتنوع المتغيرات التي يمكن فحص 2. طلب واحد ممكن من التطور الموجه ينطوي تحسين الاستقرار الهيكلي للجراثيم من الإنزيمات، مثل endolysins. عاثية ترميز والتعبير عن endolysins لهيدروليزي السندات التساهمية الحرجة في ببتيدوغليكان (أي جدار الخلية) من البكتيريا، مما يؤدي إلى تحلل الخلايا المضيفة والتحرر من virions ذرية. والجدير بالذكر أن هذه الانزيمات تمتلك القدرة على إحداث تحلل خارجيا لsusceptوقد تم التحقق من صحة البكتيريا ible في غياب بالعاثية وعلاوة على ذلك سواء في التجارب المختبرية والحية لقدرتها العلاجية 3-5. موضوع دراستنا التطور الموجه ينطوي على حالة جوانية PlyC، التي تتألف من الوحدات الصغرى وPlyCA PlyCB 6. بعد تنقيته وأضاف خارجيا، وعميم الإنزيم PlyC lyses مجموعة العقديات A (GAS) وكذلك الجماعات العقدية الأخرى في غضون ثوان، وعلاوة على ذلك تم التحقق من صحة في الجسم الحي ضد GAS 7. بشكل كبير، ورصد حركية إنزيم المتبقية بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة يقدم دليلا المتميزة التي PlyC يفقد النشاط التحللي فجأة في C ° 45، مما يشير إلى مدة الصلاحية القصيرة العلاجية، والتي قد تحد من التنمية إضافية من هذا الانزيم. مزيد من الدراسات تكشف لوحظ فقط عدم وجود الاستقرار الحراري للالوحيدات PlyCA، في حين أن الوحيدات PlyCB مستقرة تصل إلى ~ 90 ° C (المراقبة غير منشورة). بالإضافة إلى PlyC، وهناك لياليeveral الأمثلة في الأدب التي تصف طبيعة بالحرارة من endolysins. على سبيل المثال، المكورات العنقودية الذهبية حالة جوانية LysK والعقدية الرئوية endolysins العريف-1 ويفقد بال النشاط بصورة عفوية في 42 ° C، 43.5 ° C و 50.2 ° C، على التوالي 8-10. وفقا للمعادلة أرينيوس، والتي تتعلق في سرعة التفاعل الكيميائي حتى الوقت الحاضر درجة الحرارة في نظام معين، وزيادة في صمود للحرارة ترتبط بزيادة في متوسط ​​العمر الافتراضي 11. ولتحقيق هذه الغاية، وقد تبين التطور الموجه ليكون أداة مفيدة لتغيير النشاط الحراري للجزيئات مختلفة في الطبيعة، ولكن لم يحدث قط أن هذه التكنولوجيا قد نجح في استغلال خاصة لدراسة الإنزيمات للجراثيم. وبالمثل، حسابات الناجح لتتقدم على الاستقرار الهيكلي من هذه فئة معينة من مضادات الميكروبات هي تماما غير موجود. في هذا الفيديو، ونحن توظيف منهجية الرواية التي تستخدم خطأ للعلاقات العامة1 البلمرة DNA يليها عملية الفرز الأمثل باستخدام لوحة عيار مكروي أن 96 جيد التنسيق لتحديد الطفرات إلى الوحيدات PlyCA من حالة جوانية العقدية التي ترتبط PlyC إلى زيادة الاستقرار الحركي انزيم (الشكل 1). نتائج الجولة بعد واحد فقط من الطفرات العشوائية تشير إلى منهجية تولد المتغيرات التي تحتفظ PlyC أكثر من ضعف النشاط المتبقية بالمقارنة مع PlyC (WT) من النوع البري بعد العلاج درجة حرارة مرتفعة.

في ختام الجولة الأولى من الطفرات العشوائية، تم فحص أكثر من 6،000 طفرات PlyC وتم تحديد ما مجموعه 35 المسوخ مع احتمال تزايد السلوك الحراري، وتحديد التسلسل. التحليل الجيني، لخصت في الجدول الأول، يشير إلى أن المرشحين 35، 7 من بنيات الواردة WT تسلسل PlyCA على مستوى الترجمة، الموافق ايجابيات كاذبة حددها الفحص. 28 من المرشحين الباقين، وكان نطاق الطفرة 1 حتي 6 الطفرات النوكليوتيدات بمعدل متوسط ​​قدره 2.75 الطفرة النيوكليوتيدات في الجينات plyCA، والذي كان في حدود 2-3 طفرة النوكليوتيدات كنا الاستهداف. على المستوى متعدية، أسفرت هذه الطفرة النوكليوتيدات مجموعة خاصة وتردد على نطاق طفرة الأحماض الأمينية من 1 إلى 5 الأحماض الأمينية، وبمعدل يصل إلى 1.9 طفرة الطفرات الأحماض الأمينية في PlyCA ببتيد. من 28 مرشحا واحد على الأقل mutat الأحماض الأمينيةايون، تم اختيارها عشوائيا أربعة من هذه التركيبات متحولة لتوصيف مزيد من التحقق من أن عملية الفرز واسعة من منهجية التطور الموجه كان يعمل في الواقع بشكل صحيح. وتنقيته من الانزيمات متحولة إلى التجانس PlyC&gt; 95٪ على أساس تحليل SDS-PAGE كما هو موضح سابقا 6-7. وتميزت حركية إنزيم من PlyC WT وكل من المسوخ 4 PlyC بتركيزات متساوية المولي بعد احتضان تنقية الإنزيمات المختلفة في درجات حرارة مرتفعة. تم رصد نشاط بعد إضافة D471 GAS عن طريق قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر كل ثانية 15 ل20 دقيقة. كما تم تعريف النشاط سرعة القصوى المتبقية للانزيم بعد مرور فترة الحضانة الحرارة. من المرشحين الأربعة تم اختيارها عشوائيا لتوصيف أخرى، أظهرت متحولة 29C3 سلوك معظم تعزيز الحرارية. وكان التحقيق في السلوك الحراري للPlyC WT و29C3 عند درجات حرارة مختلفة في حين يحتضنها ويعاير للنشاط في الرقم الهيدروجيني 7،2 في PBS80 نانومتر ونانومتر تركيزات 40، على التوالي. أجريت في 45-50 C ° الحضانة التجارب (الشكل 3) في thermocycler حيث حضنت العينات في رقيقة الجدران 96 لوحة thermocycler بشكل جيد في حجم مجموعه 120 ميكرولتر. و35 ° C، 40 ° C و 45 ° C وأجريت التجارب الحضانة (الشكل 4 و 5) في كتلة الحرارة حيث حضنت العينات في أنبوب مل 1.5 في ميكروسنتريفوج وإجمالي قدره 1.3 مل. أجريت جميع التجارب في ثلاث مكرارت. وأظهرت WT PlyC و29C3 هناك اختلاف كبير في استقرار الحركية في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) كما هو مبين في المجموعة الاولى من الحانات في الشكل 3. ومع ذلك، بعد حضانة قصيرة الأجل لمدة 30 دقيقة من درجات حرارة تتراوح 45 حتي 50 درجة مئوية، وكان نشاط 29C3 أكبر بكثير من نشاط معين لبناء WT في كل نقطة درجة الحرارة. على سبيل المثال، عرض WT PlyC خسارة 44٪ في النشاط عند 45.2وأظهرت ° C بينما 29C3 فقط خسارة 2٪ في النشاط في نفس درجة الحرارة. بالإضافة إلى ذلك أجريت دراسات حضانة طويلة الأجل مقارنة النشاط المتبقية من PlyC WT كل و29C3 في 35 ° C و 40 ° C تنطوي على قياس النشاط المتبقية في 24 و 48 نقطة الوقت ساعة. في 35 ° C، 41٪ 29C3 عرض و. النشاط 176٪ أعلى من PlyC WT في 24 و 48 نقطة الحضانة الوقت ساعة على التوالي (الشكل 4A) في 40 ° C، 28٪ 29C3 عرض و. النشاط 107٪ أعلى من PlyC WT في 24 و 48 نقطة الحضانة الوقت ساعة على التوالي (الشكل 4B) كما تم رصد نشاط المتبقية من PlyC WT و29C3 كل 20 دقيقة ليصبح المجموع 3 ساعة في 45 ° C. كان WT PlyC فقط قادرة على الاحتفاظ النشاط 21٪ بعد ساعة 3 في حضانة درجة الحرارة هذه في حين كان 29C3 قادرة على الاحتفاظ النشاط 46٪. فترة نصف العمر (T 1/2) لPlyC WT وكانت 29C3 67 و دقيقة 147، على التوالي، تشير<html> جي ان لديه 29C3 الثاني بنسبة 2.2 أضعاف في استقرار الحركية في 45 ° C (الشكل 5). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مجموع المرشحين الدور 1 </td><td> 35 </td></tr><tr><td> مع تسلسل المرشحين PlyCA WT </td><td> 7 </td></tr><tr><td> المرشحين مع 1 ≥ الطفرة الأحماض الأمينية </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - متوسط ​​معدل الطفرة النيوكليوتيدات (NT / plyCA) </td><td> 2.75 </td></tr><tr><td> - متوسط ​​الطفرة النيوكليوتيدات (NT) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - متوسط ​​قيم الطفرة الأحماض الأمينية (AA / PlyCA) </td><td> 1.9 </td></tr><tr><td> - حمض أميني متوسط ​​الطفرة (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> طاولة بلياردو المرشح 1. تحليل الجينوم. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. توجه منهجية الفحص التطور. في التطور الموجه، واحد يبدأ مع انزيم الرصاص، والتي ستكون WT PlyC للجولة الأولى. ثم يتم إنشاء مكتبة تحتوي على PlyC من المسوخ عشوائية الطفرات النوكليوتيدات منحازة لهذا الجين plyCA من قبل البلمرة DNA عرضة للخطأ، المستنسخة في ناقلات التعبير pBAD24 وتحويلها إلى E. القولونية سلالة DH5α تحتوي بالفعل pBAD33: يتم تلقيح plyCB transformants فردية محددة في أسهمها لوحة 96 عيار مكروي جيدا. من خلال عملية الفحص واسعة النطاق، وتصنف المسوخ PlyC الفردية التي تنشط حفاز بعد الحضانة في درجة حرارة غير المسموح بها والمسوخ مع استقرار الحركية المحسنة. Theconstruct عرض السلوك الأكثر تقدما سوف يصبح بالتالي الحرارية الانزيم الرصاص للجولة القادمة من الطفرات العشوائية. وعموما، هناك ثلاث جولات كاملة من randoيتبع م الطفرات بواسطة خلط الحمض النووي مما أدى إلى جزيء للجراثيم مع تطور السلوك الحراري. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> الشكل 2. 96 لوحة جيدا عيار مكروي نماذج لفحص التطور الموجه. والتخطيطي لوحة عيار مكروي خلال تحديد شروط التدفئة الأمثل (الشكل 2A) ويتكون من بتلقيح واحد الوالدين استنساخ PlyC WT في كل صف من لوحة عيار مكروي. التخطيطي لوحة عيار مكروي أثناء الفرز متحولة (الشكل 2B) ويتكون من بتلقيح كل بئر في العمود 1 مع نسخة فريدة من نوعها PlyC WT الوالدين وكذلك تحصين كل بئر في الأعمدة 2-12 مع استنساخ متميزة متحولة PlyC. وتتم تسمية آبار A1-D1 لضوابط الوالدين الإيجابية، التي شاركيبني لا يتعرض nsist من PlyC WT لدرجة حرارة الحضانة غير جائز. وتتم تسمية آبار E1-H1 للضوابط الوالدين السلبية، والتي تتكون من بنيات PlyC WT التي تتعرض لدرجة حرارة الحضانة غير جائز. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> الشكل 3. تحليل النشاط الحركي المتبقية مقارنة WT PlyC و29C3. وتنقيته الانزيمات إلى التجانس وحضنت لمدة 30 دقيقة في thermocycler بتركيزات المولي متساوية في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة تتراوح الانحدار 45-50 ° C. النشاط الأنزيمي يرتبط أقصى سرعة عرض بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة معينة. باستثناء C ° 25 ° C و 47.7، والتفاوت في النشاط بين WT و29C3 في كل درجة حرارة ترتبط إلى قيمة ف &lt;0.05. تم الإبلاغ عن جميع البيانات في الوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. </p&gt; <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> الشكل 4. تحليل النشاط الحركي المتبقية مقارنة WT PlyC ل29C3 في 35 ° C حضنت و 40 ° C. تركيزات المولي المساواة في تنقية WT PlyC و29C3 في كتلة الحرارة على 35 ° C (الشكل 4A) أو 40 ° C (الشكل 4B). تم قياس نشاط انزيم المتبقية في 24 و 48 نقطة الوقت ساعة. تم تطبيع النشاط عرض كل بناء إلى أقصى سرعة في عرض نقطة الصفر مرة. الاختلاف في النشاط بين WT و29C3 في كل نقطة درجة الحرارة والوقت ربطها 0.05 &lt;P القيمة. تم الإبلاغ عن جميع البيانات في الوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> الشكل 5. تحليل النشاط الحركي المتبقية مقارنةوحضنت WT PlyC ل29C3 في 45 ° C. تركيزات المولي المساواة في تنقية WT PlyC و29C3 في كتلة الحرارة في C ° 45 و تم قياس نشاط انزيم المتبقية كل 20 دقيقة لمدة 3 ساعة. تم تطبيع النشاط عرض كل بناء إلى أقصى سرعة في عرض نقطة الصفر مرة. مع استثناء من نقاط البيانات في 20 دقيقة، والتباين في النشاط بين WT و29C3 في كل نقطة مرة ربطها 0.05 &lt;P القيمة. تم الإبلاغ عن جميع البيانات في الوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة.

Watch this Scientific Journal Video about A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes at JoVE.com

طريقة فحص جديدة للتطور الموجه للإنزيمات المحللة للبكتيريا القابلة للحرارة | علم المناعة والعدوى | فيديو

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

وقد وضعت رواية الأسلوب التطور الموجه محددة لمجال الهندسة صمود للحرارة وبالتالي التحقق من صحة لالإنزيمات للجراثيم. فقط بعد جولة واحدة من الطفرات العشوائية، وهو الانزيم تطورت للجراثيم، PlyC 29C3، عرض أكبر من النشاط المتبقية مرتين بالمقارنة مع البروتين من النوع البري بعد مرور فترة الحضانة درجة حرارة مرتفعة.

A طريقة الفرز الجديد للمن التطور الموجه للجراثيم الانزيمات بالحرارة

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

a-new-screening-method-for-directed-evolution-thermostable

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Natural Selection

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K Views.  University of Maryland. وقد وضعت رواية الأسلوب التطور الموجه محددة لمجال الهندسة صمود للحرارة وبالتالي التحقق من صحة لالإنزيمات للجراثيم. فقط بعد جولة واحدة من الطفرات العشوائية، وهو الانزيم تطورت للجراثيم، PlyC 29C3، عرض أكبر من النشاط المتبقية مرتين بالمقارنة مع البروتين من النوع البر...

Video: A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

اختيار المتصورة المنجلية الطفيليات لCytoadhesion لخلايا المخ البشري غشائي

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

والثقافة الخلية العصبية الأولية نظام لدراسة فيروس العقبول البسيط الكمون وإعادة تنشيط

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق<em&gt; الدودي Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

الإنزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن لدراسة التفاعلات الوظيفية بين المستقبلات والأنزيمات

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

تحديد وسطاء من خلايا تي مستقبلات الإشارات عن طريق فحص مكتبات المانع الكيميائية

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

البكتيريا الببتيد العرض لاختيار الانزيمات بيوتينيلاتينج رواية

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...