המחברים מבקשים להודות לEmilija Renke וג&#39;נט יו לקבלת סיוע טכני. DcN נתמך על ידי מענקים מארצות הברית מחלקת הביטחון (DR080205, DM102823, OR09055, וOR090059). RDH נתמך על ידי מענק מתחנת מרילנד חקלאות הניסוי וגרנט הדרכת NIH בתא וביולוגיה מולקולרית.

1. קביעת תנאים אופטימליים הסקה ראשית, יש לקבוע באופן ניסיוני את טמפרטורת הדגירה האופטימלית וזמן לשימוש עבור שלב החימום בבדיקה. עבור דגם PlyC, חשוב לציין כי ה coli שיתוף שינה-עם גני plyCB plyCA ועל פלסמידים ביטוי נפרדים הוכח בצורת holoenzyme PlyC מתפקד במלואה 6. הכנת 96 גם microtiter הצלחת כמו גם בתנאי צמיחת תא וטכניקת ציפוי ההעתק לאחר הותאמה מדוגמאות הניתנות בספרות 12-16. זמן דגירה של 30 דקות יהיה מתאים לבדיקה זו כתוצאות מניסויים קודמים איון תרמיים להכתיב אובדן מהיר בפעילות במהלך דגירה קצרת טווח בסביבות עולות טמפרטורה פיזיולוגית (תצפית לא פורסם). הטמפרטורה האופטימלית לדגירת PlyC הובהרה על ידי השלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טראןsform ביטוי מבנה pBAD24: plyCA (Amp r) לתוך ה המוסמכת coli להתאמץ DH5α pBAD33: plyCB (CM r). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט את transformants על צלחת וריא-Bertani (LB) אגר השלימה עם אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ&quot;ל) וchloramphenicol (35 מיקרוגרם / מ&quot;ל). דגירת צלחות הלילה בשעת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קיסם סטרילי, לחסן מושבת פרט לכל שורה של בארות (איור 2a) ב96 סטרילי, ברור, עם תחתית שטוחה היטב, התנסחויות צלחת microtiter המכילה 200 μl של LB בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מאובטח לוחית microtiter 96 גם על 37 מעלות צלזיוס רועדת חממה ולגדל את חיידקי לילה ב300 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזר את צלחת microtiter 96 גם מ37 מעלות צלזיוס חממה רועדת וצלחת העתק לצלחת microtiter חדשה 96 גם באופן בא: <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 180 μl של LB בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicolלכל אחד גם מצלחת ההעתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר 20 μl של חיידקים מהצלחת המקורית לבארות המתאימות בצלחת ההעתק. זה אמור לגרום OD 600 ראשוניים של ~ 0.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מאובטח לוחית ההעתק על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת ודגירת הצלחת לשעה 1 ב300 סל&quot;ד, ואז מוסיף את inductant. במקרה של מערכות ביטוי pBAD, inductant הוא arabinose 0.25%. מערכות ביטוי אחרות עשויות לדרוש inductants שונה. הנח את הצלחת אל 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת ורעידות ב 300 סל&quot;ד עבור 4 שעות נוספות כדי לאפשר לביטוי חלבון. רמות ביטוי בדרך כלל בטווח שבין 10-20 מיקרוגרם של PlyC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שביטוי החלבון הגיע למסקנה, לשלוף את צלחת ההעתק וגלול את החיידקים על ידי צבת צלחת microtiter 96 גם בצנטריפוגה בקירור שמכילה הרוטור נדנוד דלי שמתאים 96 צלחות microtiter כן. צנטריפוגה בסל&quot;ד 3000 למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant התקשורת על ידי לאט היפוך צלחת microtiter ועדינות decanting התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse התאים על ידי הוספת 50 μl של B-PER מגיב הפקת חלבון בקטריאלי השני לכל באר. דגירה את הצלחת בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את עוצמת קול בכל באר עד 120 μl ידי הוספת 70 μl של פוספט נאגר המלוח (PBS) pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת הפסולת התאית המסיסה ידי ספינינג את הצלחת ב3000 סל&quot;ד למשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה בקירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 110 μl של lysate הגולמי המסיס לבארות המקבילות של צלחת thermocycler 96 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 30 דקות כזמן דגירה הקבועה מראש, לחשוף את lysates המסיס חיים כיום בצלחת גם thermocycler 96 לטווח טמפרטורה רחב המשתרע שיפוע 15-20 ° C. שים לב, המטרה היא לקבוע באיזה טמפרטורת אנזים מסוים מאבד&gt; 95% פעילות קטליטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, דגירה 96 גםצלחת thermocycler ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולהעביר 100 μl של lysates המסיס מצלחת thermocycler 96 גם למיקום הטוב המתאים להם ב96 הסופיים גם צלחת microtiter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם multipipettor 12-ערוץ, להוסיף 100 μl של מתח גז D471 לכל באר. שים לב, D471 תאי lyophilized מקור מתרבויות הלילה וresuspended עם PBS pH 7.2 להשיג OD 600 של ~ 2.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקם את הצלחת גם 96 בספקטרופוטומטר microplate ולנטר את הקינטיקה האנזים על ידי מדידת OD 600 בכל 15 שניות במשך 20 דקות. דגירת הטמפרטורה הנמוכה ביותר שתואמות את הבארות שחסרו שינוי בצפיפות אופטית (ΔOD ≤ 0.1) מוגדרת כטמפרטורה שאינה מתירנית. </li></ol> לאחר מסך רחב טמפרטורה מבוצע כדי לזהות את טמפרטורת אוסרני, ניתן לחזור על השלבים שלעיל בטווח צר יותר של טמפרטורות (5 ° -10 ° C) להבהירטמפרטורת אוסרני המדויקת לאנזים של עניין. שימו לב, את טמפרטורת אוסרני זוהתה בבדיקה זו עשויה להיות שונה מטמפרטורת ההתכה הובהרה באמצעים אחרים בשל הבדלים בנפח, ריכוז, וכו &#39; 2. יצירת ספריית Mutant יצירת ספריית המוטציה שיוקרה באופן אקראי כרוכה בשילוב מוטציות ידי DNA פולימראז נוטה לטעות עם הטית נוקלאוטיד מינימאלית בגן plyCA באמצעות ערכת mutagenesis האקראית GeneMorph השנייה כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב פריימרים נוקלאוטיד עם טמפרטורות דומות נמסות (T מ &#39;) בין 55-72 המעלות צלזיוס עם אתרי ההגבלה של בחירה ב5&#39; ו 3 &#39;קצוות של גן plyCA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הואיל ושיעור המוטציה הרצויה הוא 2-3 נוקלאוטידים לplyCA (1.4 ק&quot;ג), השתמש בריכוזי PCR תגובת הרכיב, כמו גם את תנאי thermocycler המומלצים על ידי היצרן לו מוטציה נמוכהrequencies (0-4.5 לKB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבט את גני plyCA mutagenized לתוך וקטור הביטוי pBAD24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את המבנים לDH5α pBAD33: רקע plyCB וtransformants צלחת על צלחות אגרו LB עם אמפיצילין ותוספת chloramphenicol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנוסף, ולהפוך את הצלחת DH5α pBAD33: plyCB עם וקטור הביטוי pBAD24 המכיל את גן plyCA WT. מושבות מצלחת זה תשמשנה את הבקרות במהלך הקרנה. </li></ol> 3. הכנת 96 ובכן Microtiter פלייט ותנאי צמיחת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא כל היטב של צלחת microtiter 96 גם עם 200 μl של LB בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הצלחת סכמטי microtiter (האיור 2b), בחר בזהירות מושבת פרט מהצלחות אגרו הלילה עם קיסם לעקר ולחסן את החיידקים במיועדים גם של 96 גם microtiter PLAטה. זה חיוני כדי להבטיח רק אחד למושבה גם היא מחוסנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער את צלחת microtiter גם המעוגנת היטב 96 ב 300 סל&quot;ד הלילה בשעת 37 ° C. </li></ol> 4. ציפוי Replica, אינדוקצית ביטוי חלבון והכנת lysate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים 1.5-1.11 מהסעיף שכותרתו &quot;קביעת תנאי החימום האופטימליים&quot; עם שינוי אחד. אחסן את הצלחת המקורית ב 4 ° C לאחר שלב ציפוי ההעתק הגיע למסקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלב 1.11, 110 μl העברת lysate הגולמי המסיס לבארות המקבילות של צלחת thermocycler 96 גם למעט השליטה החיובית הבארות A1-D1. אשר להתפתחות החיובית lysates הבקרה (lysates כלומר שאינם מחוממים), 100 μl העברת lysates לבארות המקבילות בצלחת חדשה 96 גם microtiter שתשמש כצלחת assay הסופית לניסוי והחנות על קרח. </li></ol> 5. טיפול בחום lysate מסיס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את השליטה השלילית וlysates המסיס מוטציה מוגבלת כיום בצלחת thermocycler גם 96 בthermocycler למשך 30 דקות בטמפרטורת אוסרני הדגירה האופטימלית קבעה בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה בטמפרטורה שאינה מתירנית, דגירת צלחת thermocycler 96 גם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של lysates המסיס מצלחת thermocycler 96 גם כן למקומות שלהם, הזהים בצלחת הסופית 96 גם microtiter assay כבר מכילה את lysates מסיס הבקרה החיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם multipipettor 12-ערוץ, להוסיף 100 μl של מתח גז D471 לכל באר. מייד למקם את הצלחת בספקטרופוטומטר microplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פקח את הקינטיקה האנזים על ידי מדידת OD 600 בכל 15 שניות במשך 20 דקות. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרסת PlyC עם התנהגות תרמית התקדמה מוגדרת כמבנה שיכול להקטין את הצפיפות האופטית המקורית של 50 אחוזים בפחות מ 900 שניות בטמפרטורת אוסרני. בנוסף, הפקדים החיוביים (כלומר שאינם מחומם, WT PlyC) צריכים להציג את הפעילות הקטליטית של WT (t 1/2 ≤ 100 שניות) והפקדים השליליים (כלומר מחומם, WT PlyC) צריכים להיות נטולי פעילות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שגרסת PlyC עם התקדמה התנהגות תרמית מזוהית, לשלוף את הצלחת המקורית מאוחסנת ב 4 ° C וחיידקים לחסן מהפרט היטב הספציפי למוטציה של עניין לתקשורת LB הטריה בתוספת עם אמפיצילין וchloramphenicol. לגדול בידוד לילה בשעת 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ ולטהר DNA פלסמיד מהתרבות ולאחר מכן להגיש עבור סידור על מנת לזהות את מוטציות שנוקלאוטיד להסיק התנהגות תרמית משופרת לPlyCA. בנוסף, להשלים aliquot קטן מתרבות הלילה עם גליצרול 10% ולאחסן ב -80 ° C לשימוש נוסף. </li></ol>

<ol>
	<li>Jackel, C., Kast, P., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+design+by+directed+evolution.">Protein design by directed evolution.</a> Annual review of biophysics. 37, 153-173 (2008).</li><li>Liu, L., Li, Y., Liotta, D., Lutz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+orthogonal+nucleoside+analog+kinase+via+fluorescence-activated+cell+sorting.">Directed evolution of an orthogonal nucleoside analog kinase via fluorescence-activated cell sorting.</a> Nucleic acids research. 37, 4472-4481 (2009).</li><li>Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+lysins+as+effective+antibacterials.">Bacteriophage lysins as effective antibacterials.</a> Curr. Opin. Microbiol. 11, 393-400 (2008).</li><li>Fischetti, V. A., Nelson, D., Schuch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinventing+phage+therapy:+are+the+parts+greater+than+the+sum.">Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum.</a> Nat. Biotechnol. 24, 1508-1511 (2006).</li><li>Loessner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+endolysins--current+state+of+research+and+applications.">Bacteriophage endolysins--current state of research and applications.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 480-487 (2005).</li><li>Nelson, D., Schuch, R., Chahales, P., Zhu, S., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlyC:+A+multimeric+bacteriophage+lysin.">PlyC: A multimeric bacteriophage lysin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 10765-10770 (2006).</li><li>Nelson, D., Loomis, L., Fischetti, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+elimination+of+upper+respiratory+colonization+of+mice+by+group+A+streptococci+using+a+bacteriophage+lytic+enzyme.">Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci using a bacteriophage lytic enzyme.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4107-4112 (2001).</li><li>Filatova, L. Y., Becker, S. C., Donovan, D. M., Gladilin, A. K., Klyachko, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LysK,+the+enzyme+lysing+Staphylococcus+aureus+cells:+specific+kinetic+features+and+approaches+towards+stabilization.">LysK, the enzyme lysing Staphylococcus aureus cells: specific kinetic features and approaches towards stabilization.</a> Biochimie. 92, 507-513 (2010).</li><li>Varea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+thermodynamic+characterization+of+Pal,+a+phage+natural+chimeric+lysin+active+against+pneumococci.">Structural and thermodynamic characterization of Pal, a phage natural chimeric lysin active against pneumococci.</a> J. Biol. Chem. 279, 43697-43707 (2004).</li><li>Sanz, J. M., Garcia, J. L., Laynez, J., Usobiaga, P., Menendez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+and+cooperative+domains+of+CPL1+lysozyme+and+its+NH2-+and+COOH-terminal+modules.+Dependence+on+choline+binding.">Thermal stability and cooperative domains of CPL1 lysozyme and its NH2- and COOH-terminal modules. Dependence on choline binding.</a> J. Biol. Chem. 268, 6125-6130 (1993).</li><li>Anderson, G., Scott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+product+shelf+life+and+activation+energy+for+five+drugs+of+abuse.">Determination of product shelf life and activation energy for five drugs of abuse.</a> Clin. Chem. 37, 398-402 (1991).</li><li>Kim, G. J., Cheon, Y. H., Kim, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+a+novel+N-carbamylase/D-hydantoinase+fusion+enzyme+for+functional+expression+with+enhanced+stability.">Directed evolution of a novel N-carbamylase/D-hydantoinase fusion enzyme for functional expression with enhanced stability.</a> Biotechnol. Bioeng. 68, 211-217 (2000).</li><li>Koutsioulis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+on+the+cold+adapted+properties+of+TAB5+alkaline+phosphatase.">Directed evolution on the cold adapted properties of TAB5 alkaline phosphatase.</a> Protein Eng. Des. Sel. 21, 319-327 (2008).</li><li>McCarthy, J. K., Uzelac, A., Davis, D. F., Eveleigh, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+catalytic+efficiency+and+active+site+modification+of+1,4-beta-D-glucan+glucohydrolase+A+from+Thermotoga+neapolitana+by+directed+evolution.">Improved catalytic efficiency and active site modification of 1,4-beta-D-glucan glucohydrolase A from Thermotoga neapolitana by directed evolution.</a> J. Biol. Chem. 279, 11495-11502 (2004).</li><li>Ren, C., Chen, T., Zhang, J., Liang, L., Lin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolved+xylose+transporter+from+Zymomonas+mobilis+enhances+sugar+transport+in+Escherichia+coli.">An evolved xylose transporter from Zymomonas mobilis enhances sugar transport in Escherichia coli.</a> Microbial cell factories. 8, 66 (2009).</li><li>Tsuzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostable+mutants+of+the+photoprotein+aequorin+obtained+by+in+vitro+evolution.">Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution.</a> J. Biol. Chem. 280, 34324-34331 (2005).</li><li>Eijsink, V. G., Gaseidnes, S., Borchert, T. V., vanden Burg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+enzyme+stability.">Directed evolution of enzyme stability.</a> Biomolecular engineering. 22, 21-30 (2005).</li><li>Kumar, S., Nussinov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+thermophilic+proteins+deal+with+heat.">How do thermophilic proteins deal with heat.</a> Cell. Mol. Life Sci. 58, 1216-1233 (2001).</li><li>Hibbert, E. G., Dalby, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+strategies+for+improved+enzymatic+performance.">Directed evolution strategies for improved enzymatic performance.</a> Microb. Cell Fact. 4, 1475-2859 (2005).</li><li>Rasila, T. S., Pajunen, M. I., Savilahti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+random+mutagenesis+by+error-prone+polymerase+chain+reaction+protocols,+Escherichia+coli+mutator+strain,+and+hydroxylamine+treatment.">Critical evaluation of random mutagenesis by error-prone polymerase chain reaction protocols, Escherichia coli mutator strain, and hydroxylamine treatment.</a> Anal. Biochem. 388, 71-80 (2009).</li><li>Wong, T. S., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+statistical+analysis+of+random+mutagenesis+methods+used+for+directed+protein+evolution.">A statistical analysis of random mutagenesis methods used for directed protein evolution.</a> J. Mol. Biol. 355, 858-871 (2006).</li><li>Arnold, F. H., Wintrode, P. L., Miyazaki, K., Gershenson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+enzymes+adapt:+lessons+from+directed+evolution.">How enzymes adapt: lessons from directed evolution.</a> Trends in biochemical sciences. 26, 100-106 (2001).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה, שמתואר באיור 1, מציג מתודולוגיה 96 גם microtiter צלחת שמאפשרת לנצל את האבולוציה מכוונת כדי להגדיל את thermostability של כל אנזים bacteriolytic. באמצעות השימוש בDNA פולימראז נוטה לטעות, אפשר להציג מוטציות אקראיות המגבירות את היציבות הקינטית הכוללת של המולקולה תורגמה bacteriolytic של עניין, שהוא בדרך כלל עקב ארגון מחדש מולקולרי המורכבים של הגדלה אלקטרוסטטית, גשר disulphide והידרופובי אינטראקציות שיוצרות השתפר אריזה מולקולרית, שינויים משופרים של רשתות או חיזוקה של מדינת oligomerization גבוהה 17-18 מטען על פני שטח. לאחר המבוא של מוטציות נוקליאוטידים, הליך מיון נרחב היה אז בשימוש לזיהוי מוטציות התרמית מועילות. התוצאות המייצגות מובאות בפרק זה מבוסס על אחד מסיבובי mutagenesis האקראי. במציאות, זה הוצע כילפחות שלושה סיבובים רצופים של mutagenesis האקראי, כל אחד באמצעות מוטציה החזקה ביותר כאנזים עופרת, ואחריו ה-DNA הדשדוש מתאים לסוגים אלה של מחקרי התנהגות תרמית מכוונת אבולוציה 2. חשוב להבין כי בעוד פרוטוקול זה מזהה מוטציות שלהגדיל יציבות קינטית, גרסות אלו אינן בהכרח הגדילו thermostability. מולקולה נחשבת thermostable כאשר יש לו את היכולת לשמור על המבנה שלו בטמפרטורה גבוהה. עם זאת, בבדיקה שהוצגה, הפעילות שיורית של lysates המוטציה אינה assayed באותה הטמפרטורה שהודגרו בתחילה בבמהלך שלב הטיפול בחום ובכך ניתן תהיה בחירה למוטציות שמקדמות refolding במקום thermostability המשופר 19. בעוד אנו חיוץ התנהגות תרמית כאינדיקציה ליציבות תרמית, יציבות תרמית אמיתית יש למדוד באופן אמפירי על ידי biophysשיטות פורמאליות, כגון החוזר dichroism (CD), calorimetry סריקת ההפרש (DSC) וfluorimetry סריקת ההפרש (DSF). נתונים ראשוניים מניסויי CD וDSF מראים כי מספר מועמדים שזוהו מהמתודולוגיה שהוצגה אכן להציג thermostability התקדם (מידע לא מוצג). למרות שהמתודולוגיה הוצגה כאן היא ספציפית ליישום התנהגות תרמית עלתה ל PlyC, אותה מתודולוגיה זו יכולה בנוסף להיות מועסקת על מנת לשפר את פעילות תרמית לאנזימי bacteriolytic אחרים עם כמה שינויים קלים למשתנים כגון מאגרים, שיעורי מוטציה, תנאי חימום ומערכות ביטוי. משתנה קריטי אחת קשור assay זה מתייחס לשיעור מוטציות נוקלאוטיד של DNA פולימראז המועדת לטעויות. אנחנו בחרנו להשתמש DNA פולימראז נוטה לטעות Mutazyme השני בassay האבולוציה המכוונת בשל ראיות ניסיוניות מציעות אנזים המסוים הזה מציג את הכמות המינימאלית של הטיה עםלגבי שנוקלאוטידים משולבים באופן אקראי לגן של עניין בהשוואה לטכניקות mutagenesis אקראיות אחרות, כגון שימוש בhydroxylamine, המוטטורי E. זני coli ו-DNA לשגיאות אחרות polyermases 20. באופן כללי, שיעורי מוטציה נוטים להיות נמוכים רצוי יותר משתי סיבות. ראשית, thermostability הנדסה לחלבונים בדרך כלל מורכב ממספר קטנות יחסית של חומצת אמינו החלפות. שיעורי מוטציה גבוהות עלולים לגרום לשינויים מבניים דרמטיים למולקולות מסוימות שיכול בודאות לגרום misfolding המבני ופערים פונקציונליים. לדוגמה, שילוב של גליצין ושאריות פרולין יכול לשבש את מבנים משניים אלפא סליל 21. שנית, שיעורים גבוהים נוקלאוטיד מוטציה להגדיל את הסיכוי של שילוב פגי קודונים ההפסקה, וכתוצאה מכך מולקולות חתוכות שפעילים מבחינה ביולוגית. באופן כללי, שיעורי מוטציה נמוכות עדיפים בגלל תוצאה נמוכה בשיעורי שגיאות accumulation של מוטציות מסתגלות תוך שיעורי מוטציה גבוהות יותר לייצר מוטציות ניטראליות או מזיקות 22. לכל סיבוב של mutagenesis האקראי, אחר משתנה קריטי שצריך לייעל כרוך טמפרטורת הדגירה המשמשת בתהליך המיון. בחירת הטמפרטורה הניסיונית אוסרני יחסית מאתגרת. בתחילה השתמשתי בטמפרטורת דגירה שהייתה 10 מעלות צלזיוס גבוהה יותר מאשר הטמפרטורה שאינה מתירנית של PlyC, אולם לאחר הקרנת 3000 מוטציות, לא הצליח לזהות את כל מוטציות יתרון. תזכור מתודולוגיות אבולוציה מכוונת מורכבות מזיהוי החלפות של חומצות אמיניות מועילות שיש השפעות תוסף ברצף, בו נקבע כי טמפרטורה פחות מחמירה צריכה לשמש במהלך תהליך המיון גם אם זה גדל סיכוי ליצירה מדומה חיוביים. ככזה, הייתי טמפרטורת דגירה שהייתה רק כמה מעלות מעל אינן permissטמפרטורת ive ומועמדים נבחרים rescreened כדי לשלול את השקר-החיובית. אנחנו החלטנו לנצל טמפרטורת דגירה שלא הייתה ממוזג מדי (≤ 1 ° C גבוה מהטמפרטורה הנמוכה ביותר שאינן מתירנית) ולהפך לא קשה מדי (≥ 5 ° C גבוה מטמפרטורה הנמוכה ביותר שאינן מתירנית). הטמפרטורה האידיאלית החלטנו להשתמש בבדיקה מסוימת זה הייתה 2 מתונים ° C הגבוה יותר מאשר טמפרטורת אוסרני קבע בניסוי. בחירת טמפרטורה כי הוא קל מדי תגרום לשיעור גבוה בהרבה מזיהוי חיובי כוזב ~ 20% שנצפינו (טבלת I) בעת שימוש בטמפרטורת דגירה מתונה. יתר על כן, שימוש בטמפרטורת דגירה שהיא חריף מדי יכול סופו של דבר לגרום לחוסר היכולת לזהות מוטציות עם התנהגות תרמית משופרת באופן משמעותי. לדוגמה, שימוש בטמפרטורת דגירה של ≥ 5 ° C היה מביא לחוסר היכולת לזהות אתמבטיח מוטצית 29C3 כמו גם רוב המועמדים האחרים שנבחרו בסיבוב הראשון של הקרנה. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול לאנזימי bacteriolytic הנדסיים לרכישת יציבות הקינטית משופרת. יתר על כן, אותו assay זה, בלי צעדי החימום, יכול לשמש מסך למוטציות שמגבירות את הפעילות הקטליטית. משלים גם פעילות וthermostability הקטליטי היא משוכה ההתפתחותי חשובה מול כל אנזים טיפולי. אמנם את הפרטים של פרוטוקול זה הם ספציפיים לendolysin PlyC, המתודולוגיה יכולה להיות מותאמת לכל אנזים bacteriolytic עם רק כמה שינויים. הצגנו תוצאות ראשוניות מרק הסיבוב הראשון של mutagenesis שמאמת את הפונקציונליות של assay, וכתוצאה מהיישום וזיהוי של מוטציות שיוצרות גידול בthermostability המולקולרי בסדר גודל משמעותי.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td></tr><tr><td> מגיב B-PER השני בקטריאלי חלבון חילוץ </td><td> Thermo Scientific </td><td> 78260 </td></tr><tr><td> ערכת mutagenesis אקראית GeneMorph השנייה </td><td> טכנולוגיות Agilent </td><td> 200500 </td></tr><tr><td> נקה 96 פלייט Microtiter ובכן, שטוח בעל תחתית עם מכסה </td><td> BD Vacutainer labware רפואי </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> 96 צלחות PCR ובכן Nonskirted </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 14-230-232 </td></tr><tr><td> רוטור סווינג דלי </td><td> אפנדורף </td><td> -2-מחלקת מים וחשמל </td></tr><tr><td> מלח נתרן אמפיצילין </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP1760 </td></tr><tr><td> Chloramphenicol </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP904 </td&gt; </tr><tr><td> Arabinose </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BP2504 </td></tr><tr><td> וקטור הביטוי pBAD24 </td><td> ATCC </td><td> 87399 </td></tr><tr><td> וקטור הביטוי pBAD33 </td><td> ATCC </td><td> 87402 </td></tr></tbody></table>

a new screening method for the directed evolution of thermostable bacteriolytic enzymes

אבולוציה מכוונת מוגדרת כשיטה לרתום ברירה טבעית כדי להנדס חלבונים לרכישת נכסים מסוימים שאינם משויכים לחלבון בטבע. ספרות ספקה דוגמאות רבות לעניין ביצוע האבולוציה מכוונת לשנות הסגולי וקטליזה 1 מולקולרי בהצלחה. היתרון העיקרי של ניצול אבולוציה מכוונת במקום גישות רציונאליות מבוססות יותר להנדסה מולקולרית מתייחס להיקף והמגוון של זנים שונים שיכול להיות מוקרן 2. יישום אפשרי אחת של אבולוציה מכוונת כרוך בשיפור יציבות מבנית של אנזימי bacteriolytic, כגון endolysins. Bacteriophage לקודד ולהביע endolysins לhydrolyze קשר קוולנטי קריטי בpeptidoglycan (כלומר תא קיר) של חיידקים, וכתוצאה מתמוגה מארח תא ושחרור נגיפי צאצאים. יש לציין, אנזימים אלה בעלי היכולת extrinsically כדי לגרום לתמס susceptחיידקים ניכרו בו כלל בהעדר phage ויתר על כן אומתו היא במבחנת in vivo לפוטנציאל הטיפולי שלהם 3-5. נושא לימוד האבולוציה המכוונת כרוך endolysin PlyC, אשר מורכב מיחידות משנת PlyCA וPlyCB 6. כאשר מטוהר והוסיף extrinsically, holoenzyme PlyC lyses קבוצה סטרפטוקוקוס (גז), כמו גם קבוצות אחרות סטרפטוקוקלי בעניין של שניות ויתר על כן אומת in vivo נגד 7 גז. באופן משמעותי, ניטור קינטיקה אנזים שיורית לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה מספק ראיות ברורות שPlyC מאבד פעילות מס בפתאומיות ב 45 מעלות צלזיוס, מה שמרמז חיים קצרים טיפוליים מדף, שעשוי להגביל את פיתוח נוסף של אנזים זה. מחקרים נוספים מגלים חוסר יציבות תרמית נצפה רק למקטע PlyCA, ואילו מקטע PlyCB יציב עד ~ 90 ° C (תצפית לא פורסם). בנוסף לPlyC, יש יםדוגמאות everal בספרות המתארות את האופי של thermolabile endolysins. לדוגמה, Staphylococcus aureus endolysin LysK וStreptococcus pneumoniae endolysins רב&quot;ט-1 ופאל מאבדים פעילות ספונטנית בגיל 42 מעלות צלזיוס, 43.5 מעלות צלזיוס ו50.2 ° C, בהתאמה 8-10. לפי משוואת ארהניוס, המספר את קצב תגובה כימית להווה הטמפרטורה במערכת המסוימת, עלייה בthermostability תהיה לתאם עם עלייה בתוחלת חיי מדף 11. לשם כך, אבולוציה מכוונת הוכחה להיות כלי שימושי לשינוי פעילות התרמית של מולקולות שונות בטבע, אך מעולם לא בטכנולוגיה המסוימת הזה נוצלה בהצלחה לחקר אנזימי bacteriolytic. כמו כן, חשבונות המוצלחים של התקדמות היציבות המבנית של הסוג המסוים הזה של antimicrobials לחלוטין אינם קיימים. בסרטון הזה, אנו מעסיקים מתודולוגיה חדשנית המשתמשת שגיאות יחסי ציבורDNA פולימראז אחד ואחרי תהליך סינון אופטימיזציה באמצעות פורמט צלחת microtiter גם 96 לזיהוי מוטציות למקטע PlyCA של endolysin סטרפטוקוקלי PlyC שתואמים לעלייה ביציבות הקינטית אנזים (איור 1). תוצאות לאחר רק סיבוב אחד של mutagenesis האקראי מציעות מתודולוגיה היא יצירת גרסות PlyC ששומרות יותר מפעמי פעילות שיורית בהשוואה לפרא מסוג (WT) PlyC לאחר טיפול טמפרטורה גבוהה.

בסיומו של הסיבוב הראשון של mutagenesis האקראי, למעלה מ -6,000 מוטציות PlyC הוקרנו וסך של 35 מוטנטים עם התנהגות תרמית גדלה פוטנציאל זוהו, נבחר ורוצף. ניתוח גנומי, המסוכם בטבלה אני, עולה כי מתוך 35 מועמדים, 7 מהמבנים הכלולים רצפי WT PlyCA ברמת תרגום, מקביל לחיוביים שגויות שזוהה על ידי השמאי. מתוך 28 מועמדים שנותרו, מגוון המוטציה היה 1-6 מוטציות נוקלאוטיד עם שיעור מוטציות ממוצעת של 2.75 נוקלאוטידים לplyCA גן, שהיה בטווח המוטציה נוקלאוטיד 2-3 היינו מיקוד. ברמת translational, טווח זה בפרט נוקלאוטיד מוטציה ותדירות הניבו מגוון מוטצית חומצת אמינו של 1 עד 5 חומצות אמינו, בשיעור ממוצע של 1.9 מוטצית מוטציות חומצת אמינו לPlyCA פוליפפטיד. מתוך 28 מועמדים בעלי mutat חומצה אמינית אחת לפחותיון, ארבעת מבנים מוטנטים אלה נבחרו באופן אקראי לאפיון נוסף כדי לאמת שתהליך המיון הנרחב של מתודולוגיה האבולוציה המכוונת אכן מתפקד כראוי. אנזימי PlyC המוטציה טוהרו ל&gt; הומוגניות 95% המבוססת על ניתוח SDS-PAGE כפי שתואר לעיל 6-7. קינטיקה של אנזימי WT PlyC וכל אחד מארבעת מוטנטים PlyC התאפיינו בריכוזים טוחנים שווים לאחר דגירת האנזימים המטוהרים בטמפרטורות גבוהות שונות. פעילות הייתה פיקוח לאחר התוספת של D471 גז על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כל 15 שניות במשך 20 דקות. פעילות הוגדרה כמהירות המרבית השייר של האנזים לאחר דגירת חום. מתוך ארבעה מועמדים שנבחרו באקראי לאפיון נוסף, המוטציה 29C3 הראה התנהגות התרמית המשופרת ביותר. התנהגות התרמית של WT PlyC ו29C3 נחקרה בטמפרטורות שונות תוך דוגרת וassaying לפעילות ב PBS pH 7.2 ב80 ננומטר ו40 ריכוזים ננומטר, בהתאמה. את 45-50 מעלות ניסויי דגירת C (איור 3) בוצעו בthermocycler בי הדגימות הודגרו בצלחת דקת דופן גם 96 thermocycler בהיקף כולל של 120 μl. 35 ° C, 40 ° C ו 45 ° C ניסויי דגירה (איור 4 ו 5) בוצעו בגוש חום שבו הדגימות הודגרו בצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 בנפח כולל של 1.3 מ&quot;ל. כל הניסויים בוצעו בtriplicates. WT PlyC ו29C3 לא הראו הבדל משמעותי ביציבות הקינטית בטמפרטורת חדר (25 מעלות צלזיוס) כפי שהוא מתואר במערכה הראשונה של ברים באיור 3. עם זאת, לאחר דגירה קצרת טווח למשך 30 דקות מטמפרטורות הנעות 45-50 ° C, פעילות 29C3 הייתה משמעותי יותר מהפעילות הספציפית לWT לבנות בכל נקודת טמפרטורה. לדוגמה, WT PlyC מוצג אובדן 44% בפעילות ב45.2מעלות צלזיוס ואילו 29C3 הראה רק ירידה של 2% בפעילות באותה הטמפרטורה. מחקרי דגירה ארוך טווח המשווים את הפעילות שיורית של שניהם WT PlyC ו29C3 בוצעו בנוסף על 35 ° C ו 40 ° C מעורב המדידה של פעילות שיורית לאחר 24 ו 48 נקודתי זמן hr. בגיל 35 מעלות צלזיוס, 29C3 מוצג 41% ופעילות 176% יותר מאשר WT PlyC ב24 ו 48 נקודתי hr דגירת זמן, בהתאמה (איור 4 א). בגיל 40 מעלות צלזיוס, 29C3 מוצג 28% ופעילות 107% גבוהה יותר מאשר WT PlyC ב24 ו 48 נקודתי hr דגירת זמן, בהתאמה (איור 4 ב). פעילות השייר של WT PlyC ו29C3 גם השגיחה על כל 20 דקות עבור סכום כולל של 3 שעות ב 45 ° C. WT PlyC, הצליח לשמור על פעילות 21% לאחר דגירת 3 שעות בטמפרטורה זו ואילו 29C3, הצליח לשמור על פעילות 46% בלבד. זמן מחצית החיים (t 1/2) לWT PlyC ו29C3 היו 67 ו147 דקות, בהתאמה, מציע<html> ing ש29C3 יש גידול של פי 2.2 ביציבות הקינטית ב45 ° C (איור 5). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1 מועמדים עגולים סך </td><td> 35 </td></tr><tr><td> מועמדים בעלי רצף PlyCA WT </td><td> 7 </td></tr><tr><td> מועמדים בעלי ≥ מוטצית חומצת אמינו 1 </td><td> 28 </td></tr><tr><td> - ריבית ממוצעת מוטצית נוקלאוטיד (NT / plyCA) </td><td> 2.75 </td></tr><tr><td> - טווח מוטצית נוקלאוטיד (NT) </td><td> 1-6 </td></tr><tr><td> - ריבית הממוצעת מוטצית חומצת אמינו (AA / PlyCA) </td><td> 1.9 </td></tr><tr><td> - טווח מוטצית חומצת אמינו (AA) </td><td> 1-5 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. ניתוח הגנום מאגר מועמדים. pload/4216/4216fig1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1. המתודולוגיה assay אבולוציה מכוונת. באבולוציה מכוונת, אחד מתחילה עם אנזים העופרת, שיהיה PlyC WT לסיבוב הראשון. ספרייה של מוטציות המכילות מוטציות PlyC נוקלאוטיד משוחדות אקראיות לגן plyCA אז נבנה על ידי DNA פולימראז נוטה לטעות, משובטת לתוך וקטור הביטוי pBAD24 והפכה לE. coli להתאמץ DH5α כבר מכיל pBAD33:. plyCB transformants הבודד מחוסן לתוך ספציפי שלהם גם מצלחת microtiter 96 כן. דרך תהליך מיון מקיף, מוטנטים PlyC בודדים שcatalytically פעילים לאחר דגירה בטמפרטורה שאינה מותרת מסווגים כמוטנטים עם יציבות הקינטית משופרת. Theconstruct מציג התנהגות התרמית התקדמה ביותר וכתוצאה מכך הופכת את האנזים להוביל לסיבוב הבא של mutagenesis האקראי. בסך הכל, יש שלושה סיבובים מלאים של randoמ &#39;mutagenesis אחרי דשדוש DNA וכתוצאה ממולקולת bacteriolytic עם התנהגות תרמית התפתחה. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4216/4216fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig2.jpg" /> איור 2. 96 תבניות גם microtiter צלחת assay אבולוציה מכוונת. סכמטי צלחת microtiter במהלך קביעת תנאי החימום האופטימליים (איור 2a) מורכבת מinoculating שיבוט PlyC אחד הורי WT לכל שורה של צלחת microtiter. סכמטי צלחת microtiter במהלך הקרנת מוטציה (האיור 2b) מורכב מכל inoculating גם בעמודה 1 עם שיבוט WT הורי ייחודי PlyC כמו גם inoculating כל באר בעמודות 2-12 עם שיבוט מוטצית PlyC מובהק. הוולס A1-D1 מיועד לבקרה ההורית החיובית, אשר שיתוףnsist של WT PlyC בונה אינה חשוף לדגירת טמפרטורה שאינה מותרת. ולס E1-H1 מיועד לבקרה ההורית השלילית, שמורכבת ממבני WT PlyC כי הם חשופים לטמפרטורת דגירה שאינה מותרת. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח שיורי פעילות הקינטית השוואת WT PlyC ו29C3. אנזימים טוהרו להומוגניות ודגר למשך 30 דקות בthermocycler בריכוזים טוחנים שווים בשתי טמפרטורת חדר או בשיפוע טמפרטורה הנע 45-50 ° C. פעילות האנזימטית בקורלציה עם המהירות המרבית מוצגת לאחר דגירת טמפרטורה מסוימת. למעט 25 מעלות צלזיוס ו47.7 מעלות צלזיוס, השינוי בפעילות בין WT ו29C3 בכל טמפרטורה המתואמת p-value &lt;0.05. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. </p&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig4.jpg" /> איור 4. ניתוח הקינטית פעילות שיורי השוואת WT PlyC ל29C3 ב 35 ° C ו 40 ° ריכוזים טוחנים שוויון ג המטוהרים WT PlyC ו29C3 הודגרו בחום בבלוק 35 ° C (איור 4 א) או 40 ° C (איור 4 ב). פעילות אנזים השיורים נמדדה ב 24 ו 48 נקודתי זמן hr. הפעילות מוצגת על ידי כל מבנה הייתה מנורמלת למהירות המרבית מוצגת בנקודת אפס זמן. הווריאציה בפעילות בין WT ו29C3 בכל נקודת זמן וטמפרטורה מתואמת p-value &lt;0.05. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4216/4216fig5.jpg" /> איור 5. ניתוח הקינטית פעילות שיורי השוואהWT PlyC ל29C3 ב 45 ° ריכוזים טוחנים שוויון ג המטוהרים WT PlyC ו29C3 הודגרו בחום בבלוק 45 ° C ופעילות אנזים השיורים נמדדה כל 20 דקות במשך 3 שעות. הפעילות מוצגת על ידי כל מבנה הייתה מנורמלת למהירות המרבית מוצגת בנקודת אפס זמן. למעט נקודתי הנתונים ב20 דקות, הווריאציה בפעילות בין WT ו29C3 בכל נקודת זמן בקורלציה לp-value &lt;0.05. כל הנתונים מדווחים כממוצע ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים.

Watch this Scientific Journal Video about A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes at JoVE.com

שיטת סינון חדשה לאבולוציה מכוונת של אנזימים בקטריאוליטיים עמידים בחום | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.

שיטת הקרנה חדשה לאבולוציה המכוונת של אנזימי Bacteriolytic Thermostable

Directed evolution is defined as a method to harness natural selection in order to engineer proteins to acquire particular properties that are not ...

a-new-screening-method-for-directed-evolution-thermostable

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Evolution

Natural Selection

SCIENTISTS IN ACTION

17.8K Views.  University of Maryland. שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.

Video: A New Screening Method for the Directed Evolution of Thermostable Bacteriolytic Enzymes

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

שיטה חדשה לניתוח איכותי רב היקף של Biofilms חיידקית על פילמנטיות פטרייתיים המושבות Confocal שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Peptide Display for the Selection of Novel Biotinylating Enzymes

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic biotinylation by the E. coli biotin-protein ligase BirA is highly specific and allows for the biotinylation of target proteins in their native environment; however, the current usage of BirA mediated biotinylation requires the presence of a synthetic acceptor peptide (AP) in the target protein. Therefore, its application is limited to proteins that have been engineered to contain the AP. The purpose of the present protocol is to use the bacterial display of a peptide derived from an unmodified target protein to select for BirA variants that biotinylates the peptide. The system is based on a single plasmid that allows for the co-expression of BirA variants along with a scaffold for the peptide display on the bacterial surface. The protocol describes a detailed procedure for the incorporation of the target peptide into the display scaffold, creation of the BirA library, selection of active BirA variants and initial characterization of the isolated BirA variants. The method provides a highly effective selection system for the isolation of novel BirA variants that can be used for the further directed evolution of biotin-protein ligases that biotinylate a native protein in complex solutions.

Here we present a method to select for novel variants of the E. coli biotin-protein ligase BirA that biotinylates a specific target peptide. The protocol describes the construction of a plasmid for the bacterial display of the target peptide, generation of a BirA library, selection and characterization of BirA variants.

התצוגה פפטיד בקטריאלי לבחירת הרומן הביוטילדירוג אנזימים

Biotin is an attractive post-translational modification of proteins that provides a powerful tag for the isolation and detection of protein. Enzymatic ...