وقدم هذا العمل ممكن عن طريق تمويل من ويلكوم ترست. JM (080964) والمجلس الأعلى للمرأة (080948) وبدعم من ويلكوم ترست والزمالات DT من قبل مالاوي-ليفربول-يلكوم ترست دراسية ل.

1. جمع العينات الصفائح الدموية يمكن تفعيلها بسهولة من خلال درجة الحرارة، والإثارة أو التخزين، وبالتالي ينبغي التعامل معها بحذر. استخدام vacutainers لجمع الدم لإعداد الصفائح الدموية أمر لا مفر منه في معظم الحالات السريرية، ولكن ينبغي النظر بعناية كما الشفط يمكن أن يسبب نشاط الصفائح الدموية. ونظرا لبروتوكول السريرية المستخدمة في المستشفى أبحاثنا، يتم جمع عينات لدينا بعناية في vacutainers سيترات الصوديوم. ونحن لم تشهد أي مشاكل مع سابق لأوانه نشاط الصفائح الدموية في هذا أو لدينا 12 دراسة سابقة. نحن جمع الدم لإعداد الصفائح الدموية من الدم O + مجموعة الأفراد للحد من فصيلة الدم غير محدد تجميع مستضد. وأيضا لم تتخذ الجهات المانحة الدواء في 7-10 أيام السابقة كما هي معروفة بعض الأدوية للتأثير على وظائف الصفائح الدموية. 1.1 إعداد البلازما الغنية الصفيحات (الحزب الثورى) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ما يقرب من 5 ملمن الدم الكامل من مجموعة ساذجة الملاريا أو 2.5 مل من الدم من سم أو الملاريا الحادة (SM) من المرضى في vacutainer سترات الصوديوم (BD رقم المنتج 36276). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في الدم الكامل في 250 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لا أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية كما درجات الحرارة المنخفضة قد تتسبب في الصفائح الدموية لتجميع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية طاف غائم في بيئة نظيفة 15 مل أنبوب. الصفائح الدموية يتم تنشيطها بسهولة من خلال الاختلافات في درجة الحرارة والصدمات المادية وبالتالي ينبغي التعامل معها بحذر. تجنب اهتزاز أو أي حركات متشنج من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام haematocytometer على نيوباور إلى الاعتماد وضبط نظام التعليق الصفائح الدموية ل&gt; 300 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر لالمتبرعين الأصحاء و&lt;150 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر من CM والمرضى SM باستخدام 1X العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7،2-7،4؛ PBS). تأكد من اختيار عامل تخفيف عالية لتخفيف عدد الصفائح الدموية وضمان دقتها. </li></ol> ملاحظة: الملاريا باتients يقل لديهم عدد الصفائح الدموية بالمقارنة مع الاشخاص الاصحاء 16،17،18. تم تعديل تركيزات بالتالي الصفائح الدموية لCM و أم وفقا لمتوسط ​​عدد الصفائح الدموية لمرضى داخل كل مجموعة التشخيص الملاريا. وP. المنجلية النمط الظاهري التثاقل هو شائع في العزلات CM ويعرض تقارب ملزمة قوية وبالتالي فإن انخفاض تركيزات الصفائح الدموية لا يؤثر على حجم أجمة أو تردد منذ تركيز الصفائح الدموية هي موحدة لجميع الحالات CM. 1.2 إعداد الصفائح الدموية للفقراء البلازما (PPP) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على PPP، أجهزة الطرد المركزي لجزء من الحزب الثورى الحصول عليها أعلاه في 1،500 x ج لمدة 10 دقيقة. الغالبية من الصفائح الدموية هي مكعبات في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين كل من الحزب الثورى وPPP عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. ومن الناحية المثالية، واستخدام الصفائح الطازجة للمقايسة التثاقل. بعد 8-10 يوما أكثر من الصفائح الدموية من المحتمل أن تكون غير نشطة وربما المجمعة. </li></ol> 2. الفقراتالفنار الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مكعبات pRBC ثلاث مرات مع 5-10 مل المتوسط ​​1640 بواسطة الطرد المركزي في 370 x ج لمدة 5 دقائق. ملاحظة: في هذا البروتوكول جميع الثقافات بدأ من حوالي 1 مل حجم الخلية معبأة (PCV) وحافظت على 5٪ الهيماتوكريت. يمكن أن تبدأ الثقافات مع أي PCV من pRBC وتعديلها وفقا لذلك مع RBC غير المصاب وسائل الإعلام للوصول إلى الهيماتوكريت المرجوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع pRBC في قارورة الثقافة والملحق مع معيار مستنبت الملاريا من المتوسط ​​1640 تستكمل مع 25 ملي HEPES، 5٪ Albumax II أو 10٪ مصل و 40 ميكروغرام / مل جنتاميسين لتحقيق الهيماتوكريت 5٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلل قوارير الثقافة مع خليط من النيتروجين 92.5٪، 2.5٪ من الأكسجين وثاني أكسيد الكربون 5٪ قبل أن ينتزع ويحتضنها. بدلا من ذلك، محكمة الغلق طريقة جرة شمعة من تراغر-جنسن يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لpRBC الحصول عليها مباشرة من المرضى، واحتضان قارورة ثقافتهم ل 24-36 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 للحصول على الطفيليات ناضجة. ملاحظة: Mمختبر OST وخطوط ثقافة تكييفها من السهل جدا للحفاظ على الثقافة في ظل الظروف القياسية. هناك تقنيات بسيطة هو موضح أدناه والتي يمكن استخدامها لمزامنة مراحل الطفيلي مختلفة للاحتفاظ معدل النمو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد اللطاخة الدموية رقيقة كما هو موضح أدناه وفحص نضوج الطفيلي تحت المجهر الخفيفة. </li></ol> 3. رقيقة الدم السينمائي إعداد الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع حوالي 10-15 ميكرولتر من الدم على نهاية واحدة من شريحة زجاجية بلوري يستريح على سطح مستو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلمس قطرة دم مع حافة الشريحة الثانية حتى ينتشر بالتساوي الدم عبر حافة الشريحة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين عقد الشريحة الثانية في درجة 45 زاوية، بسرعة ولكن بلطف، دون بذل الكثير من الضغط على الشريحة الأولى، مرر الدم عبر الشريحة الأولى لجعل طبقة رقيقة من الدم الذي ينتشر بالتساوي. الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشريحة في الميثانول لمدة 10 ثانية. الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشريحة في 2٪ بالغيمزا شارععين لمدة 10 دقيقة على الأقل. شطف على نطاق واسع حتى الماء يتدفق واضحة. الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص الشريحة باستخدام 90-100X عدسة مستحلب الزيت على ضوء المجهر </li></ol> 4. تنقية وتزامن مراحل اللاجنسي تنقية P. ناضجة المنجلية pRBC هو خطوة لازمة لفحص التكتل. في الواقع، فقط طفيليات ناضجة قادرة على الالتصاق بمستقبلات الصفيحات كما هو الحال في هذه المرحلة دورة الحياة أن بروابط ذات الصلة يتم التعبير عن وتبرز من سطح الكريات الحمراء المصابة. هناك عدة طرق لتنقية ومزامنة مراحل اللاجنسي من P. المنجلية: مراحل اللاجنسي في وقت متأخر يمكن أثرى Percoll التدرج 19؛ الخلية المغناطيسي فرز 20 أو باستخدام الجيلاتين الترسيب بروتوكول الموصوفة هنا 21. السوربيتول تزامن يختار لمراحل حلقة 22، وبعد ذلك يتم استزراع الحلقات للموارد البشرية 24-26 للحصول على المراحل الناضجة (مع لا غيرالعيدين لأداء التعويم الجيلاتين). 4.1 هلامة بلازمية التعويم يستخدم هلامة بلازمية التعويم حل الجيلاتين مثل لتحديد لانخفاض الوزن knobbed الكريات الحمراء أن تظل في حل حين أن أشكال حلقة كثيفة وريدات تنزل الى القاع. هذا الأسلوب يعطي نقاء تصل إلى 90٪ من الكريات الحمراء الناضجة مرحلة المصابة، ويمكن أن تستخدم في كل مجال ويعزل المختبر. ومع ذلك، وكما ذكر سابقا، هلامة بلازمية التعويم يزيل rosetting pRBC وكذلك مراحل غير ناضجة الذي يمكن أن يؤدي إلى انخفاض وتيرة التثاقل في تلك العينات مع تردد rosetting عالية. ومع ذلك، فإن غياب pRBC rosetting بعد هلامة بلازمية التعويم لن يؤثر على فحص التثاقل بسبب rosetting هو تفاعل الكريات الحمراء pRBC وغير المصابة في حين التثاقل هو pRBCs بوساطة ملزمة من قبل الصفائح الدموية. يجند المشاركة في هذه الصفات اثنين مختلفة؛ مع مستقبلات تكمل أساسا CR-1 على كريات الدم الحمراء غير مصاب التوسط rosetting.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل Gelofusine Prewarm والمصل / Albumax خالية المتوسطة II إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الثقافة إلى بيئة نظيفة معقمة 15 مل أنبوب وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند درجة حرارة الغرفة في 370 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بعناية طاف حتى لا تعكر صفو بيليه والخلايا resuspend في حجم مساو من Gelofusine والمتوسطة الخالية من البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخليط إلى أنبوب معقم 15 مل والسماح للوقوف لمدة 15-20 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية أو حتى يمكن رؤية ترسيم الحدود واضحة بين مستوى العلوي والسفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الطبقة العليا إلى أنبوب معقم 15 مل الطازجة وإضافة 10 مل من RPMI الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 370 x ج لمدة 5 دقائق وتجاهل طاف بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم مرحلة الطفيليات في الدم والإنمائية التي اللطاخة الدموية رقيقة وفحص تحت المجهر ضوء كما هو موضح في القسم 4. </li></ol> ملاحظة: النطاق pRBC الناضجة بين 60-90٪ من الكريات الحمراء المصابة dependiنانوغرام على الطفيل الأولي للثقافة. لنسبة عالية من الطفيليات ناضجة، واستخدام الثقافات مع الطفيليات في الدم الأولي من ≥ 10٪. 5. التثاقل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام haematocytometer على نيوباور إلى الاعتماد وضبط نظام التعليق pRBC تم الحصول عليها بعد التعويم هلامة بلازمية إلى 1 × 10 8 pRBC / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 1.5 مل الطازجة، resuspend pRBC في الهيماتوكريت 5٪، أكريدين البرتقال في 20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي والحزب الثورى بنسبة 10٪ من حجم التداول الكلي. بدلا من أكريدين البرتقال، يمكن ملطخة الثقافات الطفيلي مع 25 ميكروغرام / مل بروميد إيثيديوم لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام. على سبيل المثال للحصول على 200 ميكرولتر مزيج التفاعل، إضافة 10 ميكرولتر pRBC ناضجة، 20 ميكرولتر من 300 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر لPRP من المتبرعين الأصحاء أو 150 × 10 3 الصفائح الدموية / ميكرولتر من المرضى SM و 170 ميكرولتر من متوسطة خالية من البروتين. ملاحظة: نسبة الصفائح الدموية: pRBC في ردود الفعل النهائي هو 20:01. وهذا أمر مهم كما هو يسمح مكسيمأم تردد التثاقل من عينة يحدد لاحقا. إذا تم إضافة عدد أقل من الصفائح الدموية في الضوابط ثم قد لا كل pRBCs التثاقل تتاح لهم الفرصة لأجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس الطريق إعداد الضوابط التالية؛ المعافين خلايا الدم الحمراء والحزب الثورى، وpRBC مع PPP للتأكد من دور الصفائح الدموية في تكتل pRBCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق إلى 1.5-2.0 مل مخروطي قارورة المسمار الحد الأقصى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القارورة في إطار التحريض لطيف من قبل المتداول في 10-12 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق لتشكيل أجمة من قبل شريحة الرطب من قبل pipetting 10 ميكرولتر من pRBC أعد ± مزيج الصفائح الدموية على شريحة زجاجية، وتغطي مع كوب الانزلاق وفحص تحت مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أن يتم أخذ العينات على فترات 15-20 دقيقة ليصبح المجموع 120 دقيقة. ويعتبر أجمة بوصفه الكلي من ثلاثة أو أكثر من كرات الدم الحمراء المصابة. </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+basis+of+malaria.">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li><li>Saul, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+variant+surface+antigens+on+malaria-infected+red+blood+cells.">The role of variant surface antigens on malaria-infected red blood cells.</a> Parasitol. Today. 15, 455-457 (1999).</li><li>Miller, L. H., Good, M. F., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+pathogenesis.">Malaria pathogenesis.</a> Science. 264, 1878-1883 (1994).</li><li>Newbold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-specific+adhesion+and+clinical+disease+in+Plasmodium+falciparum.">Receptor-specific adhesion and clinical disease in Plasmodium falciparum.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 389-398 (1997).</li><li>Turner, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immunohistochemical+study+of+the+pathology+of+fatal+malaria.+Evidence+for+widespread+endothelial+activation+and+a+potential+role+for+intercellular+adhesion+molecule-1+in+cerebral+sequestration.">An immunohistochemical study of the pathology of fatal malaria. Evidence for widespread endothelial activation and a potential role for intercellular adhesion molecule-1 in cerebral sequestration.</a> Am. J. Pathol. 145, 1057-1069 (1994).</li><li>Fried, M., Duffy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+of+Plasmodium+falciparum+to+chondroitin+sulfate+A+in+the+human+placenta.">Adherence of Plasmodium falciparum to chondroitin sulfate A in the human placenta.</a> Science. 272, 1502-1504 (1996).</li><li>Rowe, J. A., Moulds, J. M., Newbold, C. I., Miller, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P.+falciparum+rosetting+mediated+by+a+parasite-variant+erythrocyte+membrane+protein+and+complement-receptor+1.">P. falciparum rosetting mediated by a parasite-variant erythrocyte membrane protein and complement-receptor 1.</a> Nature. 388, 292-295 (1997).</li><li>Udomsangpetch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+-infected+erythrocytes+form+spontaneous+erythrocyte+rosettes.">Plasmodium falciparum -infected erythrocytes form spontaneous erythrocyte rosettes.</a> J. Exp. Med. 169, 1835-1840 (1989).</li><li>Rowe, J. A., Kyes, S. A., Rogerson, S. J., Babiker, H. A., Raza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+Plasmodium+falciparum+var+gene+implicated+in+malaria+in+pregnancy.">Identification of a conserved Plasmodium falciparum var gene implicated in malaria in pregnancy.</a> J. Infect. Dis. 185, 1207-1211 (2002).</li><li>Biswas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum+uses+gC1qR/HABP1/p32+as+a+receptor+to+bind+to+vascular+endothelium+and+for+platelet-mediated+clumping.">Plasmodium falciparum uses gC1qR/HABP1/p32 as a receptor to bind to vascular endothelium and for platelet-mediated clumping.</a> PLoS Pathog. 3, 1271-1280 (2007).</li><li>Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+accumulation+in+brain+microvessels+in+fatal+pediatric+cerebral+malaria.">Platelet accumulation in brain microvessels in fatal pediatric cerebral malaria.</a> J. Infect. Dis. 187, 461-466 (2003).</li><li>Wassmer, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+from+Malawian+patients+with+cerebral+malaria-possible+modulation+in+vivo+by+thrombocytopenia.">Platelet-induced clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes from Malawian patients with cerebral malaria-possible modulation in vivo by thrombocytopenia.</a> J. Infect. Dis. 197, 72-78 (2008).</li><li>Mayor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+severe+malaria+outcomes+with+platelet-mediated+clumping+and+adhesion+to+a+novel+host+receptor.">Association of severe malaria outcomes with platelet-mediated clumping and adhesion to a novel host receptor.</a> PLoS One. 6, e19422 (2011).</li><li>Arman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Mediated+Clumping+of+Plasmodium+falciparum+Infected+Erythrocytes+Is+Associated+with+High+Parasitemia+but+Not+Severe+Clinical+Manifestations+of+Malaria+in+African+Children.">Platelet-Mediated Clumping of Plasmodium falciparum Infected Erythrocytes Is Associated with High Parasitemia but Not Severe Clinical Manifestations of Malaria in African Children.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 77, 943-946 (2007).</li><li>Arman, M., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+conditions+affect+the+outcome+of+Plasmodium+falciparum+platelet-mediated+clumping+assays.">Experimental conditions affect the outcome of Plasmodium falciparum platelet-mediated clumping assays.</a> Malar. J. 7, 243 (2008).</li><li>Beale, P. J., Cormack, J. D., Oldrey, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombocytopenia+in+malaria+with+immunoglobulin+(IgM)+changes.">Thrombocytopenia in malaria with immunoglobulin (IgM) changes.</a> Br. Med. J. 1, 345-349 (1972).</li><li>Jy, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregates+as+markers+of+platelet+activation:+characterization+of+flow+cytometric+method+suitable+for+clinical+applications.">Platelet aggregates as markers of platelet activation: characterization of flow cytometric method suitable for clinical applications.</a> Am. J. Hematol. 57, 33-42 (1998).</li><li>Wilson, J. J., Neame, P. B., Kelton, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection-induced+thrombocytopenia.">Infection-induced thrombocytopenia.</a> Semin. Thromb. Hemost. 8, 217-233 (1982).</li><li>Wahlgren, M., Berzins, K., Perlmann, P., Persson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+humoral+immune+response+in+Plasmodium+falciparum+malaria.+II.+IgG+subclass+levels+of+anti-P.+falciparum+antibodies+in+different+sera.">Characterization of the humoral immune response in Plasmodium falciparum malaria. II. IgG subclass levels of anti-P. falciparum antibodies in different sera.</a> Clin. Exp. Immunol. 54, 135-142 (1983).</li><li>Uhlemann, A. C., Staalsoe, T., Klinkert, M. Q., Hviid, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells.">Analysis of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> MACS. 4, 7-8 (2000).</li><li>Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mature-stage+Plasmodium+falciparum+by+gelatine+flotation.">Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 88, 209-211 (1994).</li><li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture.">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li><li>Chotivanich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-induced+autoagglutination+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells+and+disease+severity+in+Thailand.">Platelet-induced autoagglutination of Plasmodium falciparum-infected red blood cells and disease severity in Thailand.</a> J. Infect. Dis. 189, 1052-1055 (2004).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-mediated+clumping+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+is+a+common+adhesive+phenotype+and+is+associated+with+severe+malaria.">Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes is a common adhesive phenotype and is associated with severe malaria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 1805-1810 (2001).</li><li>Wallace, M. A., Agarwal, K. C., Garcia-Sainz, J. A., Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-adrenergic+stimulation+of+phosphatidylinositol+synthesis+in+human+platelets+as+an+alpha-2+effect+secondary+to+platelet+aggregation.">Alpha-adrenergic stimulation of phosphatidylinositol synthesis in human platelets as an alpha-2 effect secondary to platelet aggregation.</a> J. Cell Biochem. 18, 213-220 (1982).</li><li>Zhou, L., Schmaier, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+aggregation+testing+in+platelet-rich+plasma:+description+of+procedures+with+the+aim+to+develop+standards+in+the+field.">Platelet aggregation testing in platelet-rich plasma: description of procedures with the aim to develop standards in the field.</a> Am. J. Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وصفناها فحص تجمع الصفائح الدموية بوساطة تستخدم لدراسة pRBC في العزلات السريرية مباشرة في الميدان. تكتل الصفائح الدموية بوساطة، والسلوك المميز في P. وقد تم تحديد العزلات السريرية المنجلية، باعتباره النمط الظاهري لاصق متميزة، وكثرة في العزلات CD36 ملزم 12،23-24. وقد استخدمنا هذا الاختبار لتحديد ثلاث نقاط رئيسية هي: 1) قوية في المختبر النمط الظاهري التثاقل من P. المنجلية المعزولة من الأطفال مالاوى مقترن شدة المرض والتشخيص 2) رواية مستقبلات mediaties ف selectin التثاقل على الصفائح الدموية معا مع CD36، 3) درجة الصفيحات موجودة في المرضى الذين يعانون من CM كافية للحد من تشكيل مزيد من كتل pRBC في المختبر 12. ويتجلى إشراك الصفائح الدموية في تشكيل أجمة من خلال فحص إعداد الرطب الشريحة كما هو موضح في القسم 6. الصفائح الدموية يمكن عزلها عن الحزب الثورى بواسطة الطرد المركزي بسرعات عاليةمن أجل تقليل مجموعة تفاعلات الأنتيجين الدم، ومع ذلك، كنا الحزب الثورى كله من أجل تقليل سابق لأوانه تنشيط صفائح الدم من الإفراط في التعامل مع وعن الطرد المركزي عالية السرعة. ويمكن قياس نشاط الصفائح الدموية من خلال اختبار تراكم الصفائح الدموية باستخدام ضعيفة منبهات الصفائح الدموية، ادرينالين أو ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP) 25 كما هو موضح في 26. هناك جوانب عديدة للمقايسة التي سبق لها أن تتميز على نحو رديء، واحد منهم على أهمية اختيار مصادر الحزب الثورى وتأثير الجماعات مستضد الدم على نتائج الفحص. نحن على استعداد الحزب الثورى من الأفراد الذين كانوا فصيلة الدم O + وأنها لم تتخذ أي دواء في الأيام الأخيرة قبل 7-10 ويوجه الدم وبعض الأدوية يمكن أن تؤثر على سلوك الصفائح الدموية. العوامل الأخرى التي قد تؤثر على نجاح تكتل تشمل pRBC الهيماتوكريت، ومستويات الطفيليات في الدم وطول مدة الفحص التثاقل. باستخدام الهيماتوكريت عالية وشارك الصفائح الدمويةالاتحاد الوطني للعمال انه سيكون من الصعب معرفة ما إذا كانت الكتلة هي حقا أجمة أو ما إذا كان عدد كبير جدا من الخلايا مجرد الجلوس معا لأنها مكتظة معبأة 15. التثاقل أيضا يزيد عموما مع أوقات الحضانة لفترة أطول. هذه هي جميع المبادئ التوجيهية المفيدة التي ينبغي أخذها في الاعتبار عند تصميم الدراسات التثاقل. نجد أن عينات من مجموعات سريرية مختلفة يمكن تحليلها في المتوازي باستخدام PRP من نفس المانحة إذا كان من الممكن القيام بذلك، ولكن في إعدادات الموارد محدودة مثل المواقع الميدانية هو تجمع نقل تقتصر عادة. ولذلك فمن الصعب أن يكون لها + O واحد المانحة لتوحيد المقايسات. لذلك حددنا عدة O + الجهات المانحة لضمان التوافق فصيلة الدم كلما كان ذلك ممكنا. باستخدام جهات مانحة متعددة هي أيضا مفيدة في حالات العينات أحجام كبيرة بحيث عبء التبرع بالدم لا تقع على فرد واحد فقط. نقاط أخذ العينات في 15-20 دقيقة هي أكثر جدوى بكثير إذا PE واحدrson يتم إجراء فحوصات، والسماح لاستعدادات الرطب للانزلاق، وأداء حركية فحص دون تداخل أوقات لأخذ العينات. معظم البيانات المجهرية هو مرئي وموضوعية إلى حد ما، وبالتالي، فمن المهم أن يتم التحقق العد الخلية عن طريق أكثر من شخص واحد. في هذه الحالة، يمكن التعامل مع عينة واحدة في وقت واحد يسمح تحليل كامل من 3-4 عينات يوميا اعتمادا على الكفاءة الشخصية. تكتل الصفائح الدموية بوساطة يمكن القيام بها باستخدام كل من العزلات السريرية والمختبرية. لخطوط المختبر، فمن المستحسن أن يتم استخدام CD36 الطفيليات ملزمة لتحقيق أقصى قدر من الترددات التثاقل. يمكن أن يقترن مقايسة مع المقايسات تراص أخرى مثل rosetting أو المستخدمة في التثاقل المقايسات تثبيط من شأنها أن تمكن الدراسة من المستقبلات على الصفائح الدموية التي قد توسط ملزم pRBC، وهو جانب غير مفهومة وفحصها من هذا النمط الظاهري.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

مثال لفحص الصفائح الدموية تتجمع بوساطة استخدام ما يقرب من 70٪ من مراحل النضج P. ويرد المنجلية بعد التخصيب بحلول هلامة بلازمية التعويم في الشكل 2. A أجمة هو مجموع من ثلاثة أو أكثر من كرات الدم الحمراء المصابة. يمكن تلطيخ مع أكريدين البرتقال أو إيثيديوم بروميد يمكن تصور بواسطة المجهر مضان. أكريدين البرتقال يشبه طيفيا إلى فلوريسئين، مع أقصى قدر من الإثارة في 502 نانومتر وأقصى الانبعاثات في 525 نانومتر (الأخضر)، بينما إيثيديوم بروميد لديه الحد الأقصى الإثارة في 493 نانومتر وأقصى الانبعاثات في 620 نانومتر (على غرار الأصباغ رودامين والأحمر ). ورصدت كتل بسهولة تحت المجهر وتحت ضوء طبيعي كما تظهر المجاميع الخلية وتحت مضان على شكل بقع من اللون الأخضر أو الأحمر عندما ملطخة أكريدين البرتقال أو الأصباغ بروميد إيثيديوم، على التوالي، كما هو مبين في الشكل 2 (30 دقيقة نقطة زمنية باستخدام أكريدين البرتقال ). أكبر كتل، أكبر التجميعية الخلية يظهر للأمم المتحدةدير الضوء الطبيعي وكلما كانت بقع من تحت أخضر أو ​​أحمر يتألق لالأصباغ منها. منذ الأصباغ الهدف DNA وبالتالي نوى وصمة عار، والصفائح الدموية RBC غير مصاب لم يتم الكشف عنها تحت المجهر الفلورسنت بسبب افتقارها للنوى. تشكيل عشوائية من كتل صغيرة من pRBC 4.7 ± 1.6 pRBCs / أجمة تحدث بعد 30 دقيقة. حجم أجمة يزيد بشكل كبير إلى ما متوسطه 15&gt; pRBC / كتل بعد حضانة لمدة 120 دقيقة مع بعض كتل تحتوي على العديد من pRBC / أجمة التي لا يمكن عدها بصريا. يتم احتساب وتيرة النمط الظاهري التثاقل حيث وصل عدد الخلايا المصابة الموجودة في كتل / 1،000 الخلايا المصابة، وعدها في المقايسات مكررة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> الشكل 1. تدفق العمل لتراكمها التجربة. صفائح الدم Rالتراث الثقافي غير المادي والفقراء البلازما (A) وP. ثقافة كرات الدم الحمراء المنجلية المصابة (ب) تعد وثم مجتمعة لفحص التكتل (C). <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> الشكل 2. تراكمها من الكريات الحمراء المصابة بواسطة P. المنجلية مختبر عزل. كتل التي شكلتها HB3 في الوقت 0، 30 و 120 دقيقة في البلازما الغنية الصفيحات (A) والفقراء تشكيل أجمة في الصفائح الدموية الفقراء البلازما (B). القيود مقايسة هناك قيود التي تؤثر على وجه التحديد وظيفة الصفيحات أو نتيجة النفوذ ومعظم هذه قد تم تسليط الضوء من قبل عرمان ورو 15. هنا نذكر بعض المشاكل المحتملة التي قد تواجهها في احمراحل NT للمقايسة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن التكيف العزلات السريرية لفي الثقافة المختبر يشكل تحديا وأحيانا مطلوبة فترات أطول الثقافة من أجل تحقيق الطفيليات في الدم عالية بما فيه الكفاية للسماح تشكيل كتل. مع ارتفاع معدلات التباين الأنتيجين في P. المنجلية، قد النمط الظاهري لاصق للطفيل مكيفة الثقافة لا تعكس الأصلي السكان طفيلي يصيب بعد الأزمنة المتطاولة في الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تجنب تراص غير محددة قد يعزى إلى مجموعة مولدات المضادات في الدم، وينبغي أن تكون مطابقة الصفائح الدموية الجهات المانحة للمستضد فصيلة الدم مع العزلات السريرية المستخدمة في نفس الفحص، أو مجموعة المستضد للمتبرعين بالدم عالمية O-استخدامها. ومع ذلك، فإن الأفراد مع فصيلة الدم O-نادرة في المواقع الأفريقية مثل ملاوي وبالتالي الصفائح المستخدمة عادة يتم الحصول عليها من الدم O + مجموعة المانحين، ويجب أن تكون مطابقة لفصيلة الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد كتل على إعداد الشرائح الرطب مرهقة وصعبة لالتقاط الصور كما جells هي في حركة مستمرة. عادة، pRBC تتراكم على حواف الغطاء زلة أو أنها تميل إلى العصا معا تشكيل كتل &quot;كاذبة&quot; والتي يمكن الخلط بسهولة مع كتل الحقيقي. من أجل الحد من حركة الخلية، تسمح للخلايا أن الرواسب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقايسة تكتل حساس في الوقت، وبالتالي يسمح فقط عينة واحدة ليتم تحليلها للشخص في وقت واحد للتأكد من دقتها الأمثل. يمكن أخذ العينات من النقاط الزمنية لمدة عينات مختلفة تتداخل بسهولة، مما أدى متطابقة نقاط أخذ العينات الوقت بين العينات إذا مناولة العينات أكثر من واحد في نفس الوقت. في مثل هذه الظروف، يمكن أن البرمجيات الكمية المتطورة حساب أحجام أجمة أو بدلا من الأجسام المضادة خلية محددة يمكن استخدامها لتحليل تكوين كتل. في حين أن هذه التقنيات يمكن أن تحسن كثيرا من أهمية البيانات، في البيئات فقيرة الموارد حيث من المرجح أن يتم استخدام هذا الاختبار، مثل هذه التقنيات والمعدات ليست متاحة بسهولة. </li></ol>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting at JoVE.com

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

هذا الأسلوب يحقق في النمط الظاهري تكتل الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; الكريات الحمراء المصابة (pRBC) في العزلات السريرية. يتم تنفيذ ذلك عن طريق عزل وشارك في احتضان البلازما الغنية الصفيحات وتعليق pRBC.

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K Views.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. هذا الأسلوب يحقق في النمط الظاهري تكتل الصفائح الدموية بوساطة المتصورة المنجلية الكريات الحمراء المصابة (pRBC) في العزلات السريرية. يتم تنفيذ ذلك عن طريق عزل وشارك في احتضان البلازما الغنية الصفيحات وتعليق pRBC.

Video: A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

بروتوكول لجمع ويلطخ Hemocytes من الحمى الصفراء البعوض الزاعجة المصرية</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

فصل<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; في وقت متأخر مرحلة المصابين تبدي الكريات الحمر بوسائل المغناطيسي

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

ارتفاع العائد تنقية<em&gt; المتصورة المنجلية</em&gt; Merozoites للاستخدام في فحوصات ضد طهائي

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

طرق بالتحقيق في الدور التنظيمي للالرنا الصغيرة وخاص بالريبوسوم إشغال<em&gt; المتصورة المنجلية</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.