Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem Wellcome Trust. JM (080964) und SCW (080948) wurden von Wellcome Trust Stipendien und DT von einem Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Stipendium unterstützt.

1. Probenentnahme Thrombozyten kann leicht durch Temperatur, Bewegung oder Lagerung aktiviert werden und sollten daher mit Vorsicht behandelt werden. Die Verwendung von Vacutainern Blut für Blutplättchenzubereitung sammeln unvermeidbar ist in den meisten klinischen Situationen, sollte aber sorgfältig geprüft werden als Saug potenziell verursachen können Thrombozyten-Aktivierung. Aufgrund der klinischen Protokoll bei unserer Forschung Krankenhaus verwendet werden, sind unsere Proben vorsichtig in Natriumcitrat Vacutainern gesammelt. Wir haben keine Probleme mit der vorzeitigen Thrombozytenaktivierung in dieser oder unserer früheren Studie 12 erlebt. Wir sammeln Blut für Blutplättchen-Zubereitung von Blutgruppe O + Einzelpersonen unspezifische Blutgruppenantigen Aggregation zu minimieren. Die Geber haben auch keine Medikamente in den letzten 7-10 Tage, da einige Medikamente bekannt sind die Thrombozytenfunktion beeinflussen gemacht. 1.1 Herstellung von Plättchen-reichem Plasma (PRP) <ol><li> Sammeln Sie ca. 5 mlVollblut aus einem Malaria naive Host oder 2,5 ml Blut aus CM oder schwerer Malaria (SM) der Patienten in einem Natrium-Citrat vacutainer (BD Produkt-Nummer 36276). </li><li> Zentrifugieren des Vollbluts bei 250 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Nicht bei 4 ° C zentrifugiert, da niedrige Temperaturen können die Thrombozyten zu aggregieren verursachen. </li><li> Sorgfältig übertragen die trübe Überstand in ein sauberes 15 ml Tube. Thrombozyten werden leicht durch Temperaturschwankungen und Erschütterungen aktiviert und sollten daher mit Vorsicht behandelt werden. Vermeiden Sie Schütteln oder keine ruckartigen Bewegungen des Rohres. </li><li> Verwenden Sie einen Neubauer haematocytometer zu zählen und stellen Sie die Plättchensuspension bis&gt; 300 x 10 3 Blutplättchen / ul für gesunde Spender und &lt;150 x 10 3 Blutplättchen / ul von CM und SM Patienten mit 1X Phosphat-Puffer (pH 7,2-7,4; PBS). Achten Sie auf eine hohe Verdünnung Faktor wählen, um die Thrombozyten zu erleichtern und sicherzustellen, deren Richtigkeit. </li></ol> Hinweis: Malaria patients eine reduzierte Thrombozytenzahl im Vergleich zu den gesunden Personen 16,17,18. Daher Thrombozytenkonzentrationen für CM und UM sind nach dem Durchschnitt der Thrombozyten für die Patienten in jeder Gruppe Diagnose Malaria angepasst. Die P. falciparum Verklumpung Phänotyp ist üblich in CM Isolate und zeigt eine starke Affinität daher die reduzierte Thrombozyten-Konzentrationen nicht beeinflusst Klumpen Größe oder Frequenz seit Thrombozytenkonzentration ist standardisiert für alle CM Fällen. 1.2 Herstellung von Plättchen-armes Plasma (PPP) <ol><li> Um PPP erhalten, Zentrifuge einen Teil des PRP oben bei 1.500 xg für 10 min erhalten. Die Mehrheit der Thrombozyten sind an der Unterseite des Rohres pelletiert. </li><li> Sowohl PRP und PPP kann bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen gelagert werden. Idealerweise verwenden frische Blutplättchen für die Verklumpung Assay. Nach 8-10 Tagen die meisten der Plättchen sind wahrscheinlich inaktiv und wahrscheinlich aggregiert. </li></ol> 2. Parasite Kultur <ol><li> Waschen Sie die pelletierten pRBC dreimal mit 5-10 ml RPMI 1640 durch Zentrifugation bei 370 xg für 5 min. Hinweis: In diesem Protokoll alle Kulturen von etwa 1 ml gepackten Zellvolumens (PCV) gestartet und bei 5% Hämatokrit. Kulturen können mit jedem von PCV pRBC gestartet werden und dementsprechend mit nicht infizierten RBC und Medien angepasst, um gewünschte Hämatokrit erreichen. </li><li> Legen Sie die pRBC in einer Kulturflasche und Ergänzung mit Standard Malaria Kulturmedium RPMI 1640 mit 25 mM HEPES, 5% Albumax II oder 10% Serum und 40 ug / ml Gentamycin um eine 5% Hämatokrit erreichen ergänzt. </li><li> Permeat Kulturflaschen mit einer Mischung aus 92,5% Stickstoff, 2,5% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid vor dem Verschließen und Inkubieren. Alternativ kann die luftdichte Kerze Glas Verfahren Trager-Jensen verwendet werden. </li><li> Für pRBC direkt von Patienten erhalten, brüten ihre Kultur Flasche für 24-36 h in einem 37 ° C Inkubator in 5% CO 2, um zu reifen Parasiten bekommen. HINWEIS: Most Labor-und Kultur-Linien angepasst sind sehr einfach in der Kultur unter Standard-Bedingungen gewährleisten. Es gibt einfache Techniken beschrieben, die verwendet werden, um verschiedene Parasitenstadien synchronisieren Wachstumsrate beibehalten werden kann. </li><li> Bereiten Sie einen dünnen Blutausstrich wie unten beschrieben und untersuchen Parasiten Reifung unter einem Lichtmikroskop. </li></ol> 3. Thin Film Blut Slide Vorbereitung <ol><li> Zeigen ca. 10-15 ul Blut an einem Ende einer Milchglas-Folie, die auf einer ebenen Fläche. </li><li> Berühren Sie den Blutstropfen mit dem Rand einer zweiten Folie, bis das Blut gleichmäßig über den Rand der zweiten Objektträger ausgestrichen. </li><li> Halten Sie die zweite Folie in einem 45 °-Winkel, schnell, aber sanft, ohne großen Druck auf der ersten Folie, schieben das Blut über die erste Folie, um einen dünnen Film von Blut, die gleichmäßig verteilt machen. Air trocken. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in Methanol für 10 sec. Air trocken. </li><li> Tauchen Sie die Objektträger in 2% Giemsa stain für mindestens 10 min. Spülen Sie ausgiebig, bis das Wasser klar bleibt. Air trocken. </li><li> Untersuchen Folie mit einem 90-100x-Öl-Emulsion Linse auf einem Lichtmikroskop </li></ol> 4. Reinigung und Synchronisation von Asexual Stages Die Reinigung der reifen P. falciparum pRBC ist ein erforderlicher Schritt für die Verklumpung Assay. Tatsächlich sind nur reife Parasiten fähig zur Bindung an Blutplättchen-Rezeptoren, wie er in diesem Lebenszyklusstufe ist, dass die entsprechenden Liganden exprimiert und ragen aus der Oberfläche der infizierten Erythrozyten. Es gibt mehrere Methoden, um zu reinigen und zu synchronisieren asexuellen Stadien von P. falciparum: Late asexuellen Stadien kann durch Percollgradienten 19 angereichert werden; magnetische Zellsortierung 20 oder mit der Gelatine Sedimentation 21 hier beschriebene Protokoll.. Sorbit-Synchronisation wählt für Ring 22 Stufen, nach denen die Ringe für 24-26 h kultiviert werden, um zu reifen Stufen erhalten (ohne nEED Gelatine Börsengang durchführen). 4.1 Plasmagel Flotation Plasmagel Flotation verwendet Gelatine-ähnliche Lösung zu wählen für geringeres Gewicht knorrig Erythrozyten in Lösung bleiben, während die dichten Ring Formen und Rosetten auf den Boden sinken. Diese Technik gibt bis zu 90% Reinheit der reifen Stadium-infizierten Erythrozyten und kann sowohl für Feld und Labor Isolate verwendet werden. Wie jedoch zuvor erwähnt, entfernt Plasmagel Flotation rosettenbildendem pRBC sowie unreifen Stufen, die zu einer verringerten Frequenz Verklumpung in den Proben mit einer hohen Frequenz Rosetting führen kann. Jedoch würde die Abwesenheit des rosettenbildendem pRBC nach Plasmagel Flotation nicht die Verklumpung Assay weil Rosetting eine Wechselwirkung von pRBC und nicht infizierten Erythrozyten während Verklumpung ist prbcS Bindung vermittelt durch Blutplättchen. Der Ligand in diesen beiden Züge beteiligt ist anders, mit allem ergänzen Rezeptor CR-1 infizierten Erythrozyten vermittelnde Rosetting.<ol><li> Vorwärmen Gelofusine Lösung und Serum / Albumax II-freiem Medium bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Übertragen Kultur auf eine saubere sterile 15 ml Röhrchen und Pellets Zellen durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 370 × g für 5 min. </li><li> Saugen Sie vorsichtig den Überstand, so nicht, um das Pellet und Zellen in einem gleichen Volumen Gelofusine und Protein-freiem Medium zu stören. </li><li> Übertragen Mischung in ein steriles 15 ml-Tube und lassen Sie sie für 15-20 Minuten in einem 37 ° C Inkubator oder stehen, bis eine klare Abgrenzung zwischen einer oberen und unteren Ebene gesehen werden kann. </li><li> Sorgfältig übertragen Sie die obere Schicht zu einem frischen sterilen 15-ml-Tube und 10 ml frisches RPMI. </li><li> Zentrifuge bei 370 xg für 5 min und sorgfältig Überstand verwerfen. </li><li> Bewerten Parasitämie und des Entwicklungsstadiums von dünnen Blutausstrich und untersuchen unter einem Lichtmikroskop, wie in Kapitel 4 beschrieben. </li></ol> HINWEIS: Ältere pRBC Bereich zwischen 60-90% der infizierten Erythrozyten depending auf dem ursprünglichen Parasitämie der Kultur. Für hohen Anteil an reifen Parasiten, verwenden Kulturen mit einer anfänglichen Parasitämie von ≥ 10%. 5. Klumpende Assay <ol><li> Verwenden Sie einen Neubauer haematocytometer zu zählen und stellen Sie die pRBC Suspension nach Plasmagel Flotation erhaltenen 1 x 10 8 pRBC / ul. </li><li> In einem frischen 1,5 ml-Tube, resuspendieren pRBC bei 5% Hämatokrit, Acridinorange bei 20 ug / ml Endkonzentration und PRP bei 10% des Gesamtvolumens. Statt Acridinorange können Parasiten Kulturen mit 25 ug / ml Ethidiumbromid für 5 min vor Gebrauch gefärbt werden. ZB für eine 200 ul Reaktionsansatz, fügen Sie 10 ul reifen pRBC, 20 ul 300 x 10 3 Blutplättchen / ul für PRP von gesunden Spendern oder 150 x 10 3 Blutplättchen / ul von SM-Patienten und 170 ul Protein-freiem Medium. HINWEIS: Das Verhältnis von Thrombozyten: pRBC in den letzten Reaktionen 20:1. Dies ist wichtig, wie es ermöglicht die Maximeum Verklumpungen Frequenz einer zu bestimmenden Probe. Werden weniger Blutplättchen in Kontrollen zugegeben dann nicht alle Verklumpung PRBCs vielleicht die Chance haben, zu verklumpen. </li><li> In der gleichen Weise bereiten die folgenden Kontrollen; infizierten roten Blutkörperchen und PRP und pRBC mit PPP, die Rolle der Thrombozyten im PRBCs Verklumpung zu ermitteln. </li><li> Übertragen Sie die Suspension auf einen 1,5-2,0 ml konische Röhrchen mit Schraubverschluss. </li><li> Stellen Sie die Durchstechflasche unter leichtem Schütteln durch Walzen bei 10-12 min bei Raumtemperatur. </li><li> Überprüfen Klumpenbildung durch eine Nass-Rutsche durch Pipettieren 10 ul pRBC vorbereitet ± Thrombozyten Mix auf einen Objektträger aus Glas, Deckel mit einem Glas gleiten und prüfen, unter Fluoreszenz. </li><li> Die Probenahme kann bei 15-20 Minuten-Intervallen für insgesamt 120 min durchgeführt werden. Ein Klumpen wird in einer Summe von drei oder mehr infizierten Erythrozyten betrachtet. </li></ol>

<ol>
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Clin. Pathol. 123, 172-183 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine Blutplättchen-vermittelten Verklumpung Assay zur Untersuchung pRBC in klinischen Isolaten direkt im Feld eingesetzt beschrieben. Thrombozyten-vermittelte Verklumpung, ein charakteristisches Verhalten in P. falciparum klinischen Isolaten, wurde als eigenständige Klebstoff Phänotyp, häufiger in CD36-bindenden Isolate 12,23-24 identifiziert worden. Wir haben diesen Test verwendet werden, um drei Punkte zu identifizieren: 1) eine starke in vitro Verklumpung Phänotyp von P. falciparum aus Malawi Kinder, die mit der Schwere der Erkrankung und Diagnose 2) neuen Rezeptor P-Selektin auf Thrombozyten mediaties Verklumpung zusammen mit CD36, 3) der Grad der Thrombozytopenie bei Patienten mit CM verbunden ist isoliert ist ausreichend, um die weitere Bildung von Klumpen in pRBC begrenzen vitro 12. Die Beteiligung von Blutplättchen in Klumpenbildung ist durch die Untersuchung einer Nass-slide Vorbereitung, wie in Kapitel 6 beschrieben, nachgewiesen. Thrombozyten aus PRP durch Zentrifugation bei hohen Geschwindigkeiten isoliert werdenZur Minimierung Blutgruppe Antigenreaktionen, jedoch haben wir ganze PRP, um eine vorzeitige Aktivierung von Thrombozyten durch übermäßige Handhabung und der Hochgeschwindigkeitszentrifugation minimieren. Thrombozyten-Aktivität kann durch Thrombozytenaggregation Test mit schwachen Thrombozytenagonisten, Adrenalin oder Adenosindiphosphat (ADP) 25, wie in 26 beschrieben gemessen werden. Es gibt mehrere Aspekte des Tests, die zuvor schlecht charakterisiert, eine davon ist die Bedeutung der Auswahl PRP Quellen und die Wirkung von Blut Antigen Gruppen über das Ergebnis des Tests. Wir bereiteten PRP von Personen, die Blutgruppe O + waren und hatte keine Medikamente in den letzten 7-10 Tagen eingenommen, bevor Blut abgenommen, da einige Arzneimittel Thrombozyten Verhalten beeinflussen können. Andere Faktoren, die beeinflussen Verklumpung Erfolg kann pRBC Hämatokrit, Parasitämie Ebenen und Länge der Verklumpung Assay. Mit hoher Hämatokrit und Thrombozyten count wäre es schwierig zu sagen, ob der Cluster ist wirklich ein Klumpen oder ob zu viele Zellen sind nur zusammen sitzen, weil sie dicht gepackt sind 15. Klumpende auch erhöht im Allgemeinen mit längeren Inkubationszeiten. Dies alles sind nützliche Hinweise, die bei der Gestaltung Verklumpung Studien werden sollte. Wir finden, dass Proben aus verschiedenen klinischen Gruppen parallel mit PRP vom gleichen Spender, wenn es möglich ist, dies zu tun kann analysiert werden, sondern in begrenzten Ressource Einstellungen wie Wiese die Transfusion Pool ist in der Regel begrenzt. Es ist daher schwierig, eine einzige O + Spender zum Assays standardisieren haben. Wir haben daher mehrere O + Spender identifiziert Blutgruppe Kompatibilität zu gewährleisten, wo immer möglich. Die Verwendung mehrerer Spender ist auch hilfreich in Fällen von großen Proben Größen, so dass Last der Blutspende nicht nur auf einem einzelnen fallen. Die Messstationen, 15-20 min sind viel mehr machbar, wenn eine einzelne person wird die Durchführung der Tests, so dass für Nass-Präparaten und die Durchführung des Tests Kinetik ohne Probenahme mal überlappen. Die meisten der mikroskopischen Daten visuell und etwas Ziel, daher ist es wichtig, dass Zellzählung von mehr als einer Person überprüft. In diesem Fall kann die Handhabung einer Probe in einer Zeit gestatten vollständige Analyse von drei bis vier Proben pro Tag je nach persönlichen Effizienz. Thrombozyten-vermittelte Verklumpung kann mit klinischen und Laborverfahren Isolate werden. Für Labor-Linien, ist es empfehlenswert, dass CD36 bindenden Parasiten verwendet werden, um Verklumpung Frequenzen zu maximieren. Der Assay kann mit anderen Agglutinierungsassays wie rosettenbildendem oder in Klumpen Inhibitionsassays dass das Studium der Rezeptoren auf den Blutplättchen die Bindung pRBC ein schlecht verstanden und untersucht Aspekt dieser Phänotyp vermitteln kann ermöglichen würde, gekoppelt sein.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum verursacht die Mehrzahl der schweren Malaria-Infektionen. Die pathophysiologischen Mechanismen, die zerebrale Malaria (CM) sind noch nicht vollständig verstanden und mehrere Hypothesen wurden vorgeschlagen, einschließlich der mechanischen Obstruktion Mikrogefäßen von P. setzen falciparum-Parasiten befallenen roten Blutkörperchen (pRBC). In der Tat, während der intra-erythrozytären Stadium seines Lebenszyklus, P. falciparum hat die einzigartige Fähigkeit, um die Oberfläche der infizierten Erythrozyten durch den Export Oberflächenantigene mit unterschiedlichen Hafteigenschaften auf die RBC-Membran ändern. Dies ermöglicht die Sequestrierung von pRBC in verschiedenen Geweben und Organen durch Adhäsion an Endothelzellen der Mikrozirkulation der Post-Venolen 1. Auf diese Weise vermeiden, dass die reifen Formen des Parasiten Milz Clearance des verformten infizierten Erythrozyten 2 und beschränken ihre Umwelt zu einer günstigeren niedrigen Sauerstoffdruck 3. Als Folge dieser SEQUESTRation, ist es nur unreife asexuellen Parasiten und Gametozyten, die im peripheren Blut nachgewiesen werden kann. Cytoadherence und Sequestrierung von reifen pRBC den zahlreichen Host-Rezeptoren auf mikrovaskuläre Betten ausgedrückt tritt in schwerer Krankheit und unkompliziert. Allerdings deuten verschiedene Hinweise, dass nur bestimmte Klebstoff Phänotypen wahrscheinlich mit schweren pathologischen Ergebnisse der Malaria zugeordnet werden sollen. Ein Beispiel eines solchen spezifischen Wirt-Parasit-Interaktion in vitro, wobei die Fähigkeit des ICAM-1 zu unterstützen, die Bindung von pRBC besonders Hafteigenschaften Entwicklung von zerebraler Malaria 4,5 gebracht wurde nachgewiesen. Die Plazenta hat sich auch als Ort der bevorzugte pRBC Akkumulation in Malaria-infizierten schwangeren Frauen anerkannt, mit Chondroitin-Sulfat Ein Ausdruck auf Synzytiotrophoblasten die Linie der Plazenta intervillösen Raum als wichtigste Rezeptor 6. Rosettenbildung von pRBC to infizierten Erythrozyten über den Komplement-Rezeptor 1 (CD35) 7,8 wurde auch mit schwerer Krankheit 9 in Verbindung gebracht. Einer der zuletzt beschriebenen P. falciparum cytoadherence Phänotypen ist die Fähigkeit des pRBC gegen Thrombozyten vermittelte Klumpen in vitro zu bilden. Die Bildung solcher pRBC Klumpen erfordert CD36, ein Glykoprotein auf der Oberfläche von Blutplättchen exprimiert. Anderen menschlichen Rezeptor gC1qR/HABP1/p32, auf verschiedenen Zelltypen, einschließlich Endothelzellen und Blutplättchen exprimiert, wurde ebenfalls gezeigt, dass pRBC Haftung auf Blutplättchen verklumpen 10 zu erleichtern. Ob Verklumpung in vivo auftritt, bleibt unklar, aber es kann für die signifikante Häufung von Blutplättchen in Gehirn Mikrovaskulatur Malawi Kinder, die von CM 11 starb beschrieben ausmachen. Außerdem isolieren die Fähigkeit der klinischen Kulturen zum Verklumpen in vitro direkt mit der Schwere der Erkrankung in Malawian 12 verbunden </sup&gt; Und mosambikanischen Patienten 13, (wenn auch nicht in Mali 14). Mit verschiedenen Aspekten der pRBC Verklumpung Phänotyp schlecht charakterisiert, haben aktuelle Studien zu diesem Thema nicht ein standardisiertes Verfahren gefolgt. Dies ist ein wichtiges Thema, weil der bekannten hohen Variabilität inhärente im Test 15. Hier präsentieren wir eine Methode zur in vitro Blutplättchen-vermittelten Verklumpung von P. falciparum mit der Hoffnung, dass es eine Plattform für eine konsistente Methode für andere Gruppen und Sensibilisierung der Einschränkungen bei der Untersuchung dieser Phänotyp in zukünftigen Studien. Being in Malawi basiert, bieten wir ein Protokoll speziell für eine begrenzte Ressource Einstellung entwickelt, mit dem Vorteil, dass frisch gesammelten klinischen Isolaten für Phänotyp ohne die Notwendigkeit für die Kryokonservierung untersucht werden.

Ein Beispiel für einen Thrombozyten-vermittelten Klumpen unter Verwendung von etwa 70% reifen Stadien von P. falciparum nach Anreicherung durch Flotation Plasmagel ist in Abbildung 2 dargestellt. Ein Klumpen ein Aggregat aus drei oder mehr infizierten Erythrozyten. Färbung mit Acridinorange oder Ethidiumbromid kann durch Fluoreszenzmikroskopie visualisiert. Acridinorange spektral ähnlich Fluorescein, mit einem Anregungsmaximum bei 502 nm und ein Emissionsmaximum bei 525 nm (grün), Ethidiumbromid weist ein Anregungsmaximum bei 493 nm und ein Emissionsmaximum bei 620 nm (ähnlich Rhodamin-Farbstoffe, rote ). Klumpen sind leicht unter dem Mikroskop entdeckt als unter normalen Lichtbedingungen sie als Zellverbände und unter Fluoreszenz als Flecken erscheinen grün oder rot, wenn sie mit Acridinorange oder Ethidiumbromid Farbstoffe bzw. gefärbt, wie in Abbildung 2 gezeigt (30 min Zeitpunkt mit Acridinorange ). Je größer die Klumpen, je größer der Zellverband wird under normalen Licht und desto größer die Flecken grün oder rot fluoreszieren unter für die jeweiligen Farbstoffe. Da die Farbstoffe Ziel-DNA und somit Fleck Kerne, Blutplättchen und nicht infizierten RBC werden nicht unter Fluoreszenz-Mikroskopie aufgrund ihrer mangelnden Kerne erkannt. Zufällige Bildung von kleinen pRBC Klumpen von 4,7 ± 1,6 PRBCs / Klumpen auftreten, nachdem 30 min. Die Klumpen Größe erhöht sich auf durchschnittlich&gt; 15 pRBC / Klumpen nach Inkubation für 120 min mit einigen Klumpen mit zahlreichen pRBC / Büschel, die visuell nicht gezählt werden konnten. Die Frequenz der Verklumpung Phänotyp wird berechnet, wie die Zahl der infizierten Zellen in Klumpen / 1.000 infizierten Zellen präsentieren, gezählt in Duplikatprüfungen. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Abbildung 1. Der Ablauf für Verklumpung Experiment. Platelet rich und Plasma (A) und einem P. falciparum-infizierten Erythrozyten Kultur (B) hergestellt werden und dann kombiniert zur Verklumpung Assay (C). <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verklumpung der Erythrozyten von P. infiziert falciparum Labor zu isolieren. Büschel von HB3 zum Zeitpunkt 0 gebildet wird, 30 bis 120 min in Plättchen-reichem Plasma (A) und schlechte Klumpenbildung in Blutplättchen armes Plasma (B). Assay Einschränkungen Es gibt Grenzen, die speziell die Thrombozytenfunktion beeinflussen oder Einfluss auf die Prognose und die meisten von ihnen wurden bereits von Arman und Rowe 15 hervorgehoben worden. Hier erwähnen wir einige der möglichen Probleme, die bei differe begegnet werden könntent Stufen des Tests: <ol><li> Anpassung klinischen Isolaten in vitro-Kultur kann eine Herausforderung, da manchmal längere Zeiträume Kultur erforderlich sind, um ausreichend hohe Parasitämie erreichen, um die Bildung von Klumpen zu ermöglichen. Mit hochantigenen Veränderungsraten in P. falciparum, könnte der Klebstoff Phänotyp der Kultur angepasste Parasiten nicht unbedingt die ursprüngliche Infektion Parasiten Bevölkerung nach längerer Zeit in der Kultur. </li><li> Um unspezifische Agglutination durch Blutgruppen-Antigene zu vermeiden, sollte Plättchenspendern für Blutgruppenantigen mit klinischen Isolaten im gleichen Assay verwendet wird, oder die universelle Spenderblut Antigen O-Gruppe verwendet, abgestimmt werden. Jedoch sind die Personen mit der Blutgruppe O-sind in afrikanischen Websites wie Malawi selten und daher Blutplättchen häufig verwendet werden, von der Blutgruppe O + Spendern erhalten und müssen für Blutgruppe abgestimmt werden. </li><li> Zählen Klumpen auf einer nassen Folie Zubereitung ist aufwendig und anspruchsvoll für die Bilderfassung als cEllen sind in ständiger Bewegung. Normalerweise ansammeln pRBC an den Kanten des Deckglases oder sie neigen zum Verkleben Bildung &quot;falsch&quot; Klumpen, die leicht mit echten Klumpen verwechselt werden können. Um Zellbewegung zu reduzieren, damit die Zellen zu sedimentieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur vor der Analyse. </li><li> Die Verklumpung Assay ist zeitkritische und erlaubt daher nur eine Probe pro Person zu einem Zeitpunkt für eine optimale Genauigkeit analysiert werden. Probenahme Zeitpunkten für zwei verschiedene Proben können leicht überlappen, was mismatched Probenahme Zeitpunkten zwischen den Proben bei Verarbeitung mehr als eine Probe zur gleichen Zeit. In einem solchen Fall könnten komplexer quantitativer Software berechnet Klumpen Größen oder alternativ Zell-spezifische Antikörper verwendet werden, um die Zusammensetzung der Klumpen zu analysieren. Während diese Techniken erheblich verbessern könnte die Bedeutung der Daten in Ressourcen armen Einstellungen, wo dieser Test wird wahrscheinlich verwendet werden, sind solche Techniken und Geräte nicht ohne weiteres verfügbar. </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung Phänotyp<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten (pRBC) in klinischen Isolaten. Dies wird durch Isolieren und Co-Inkubation von Plättchen-reichem Plasma und eine Suspension von pRBC durchgeführt.

Ein einfaches Protokoll für Thrombozyten-vermittelte Verklumpung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Infizierten Erythrozyten in einer Ressource Schlechte Einstellung

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K Aufrufe.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. Diese Methode untersucht die Blutplättchen-vermittelten Verklumpung Phänotyp Plasmodium falciparum-Infizierten Erythrozyten (pRBC) in klinischen Isolaten. Dies wird durch Isolieren und Co-Inkubation von Plättchen-reichem Plasma und eine Suspension von pRBC durchgeführt.

Serie: A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

A Simple Chelex Protokoll zur DNA-Extraktion aus<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Trennung<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Ein Protokoll für die Analyse von Hepatitis-C-Virus-Replikation

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield Reinigung von<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Methoden, um die regulatorische Rolle kleiner RNAs und Ribosomal Belegung von Untersuchen<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.