فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ستيفن Kingsmore والطب الجينوم مركز طب الأطفال في مستشفيات الرحمة للأطفال وعيادات لاستخدام مجموعات الحوسبة من أجل تحليل البيانات المتوفرة لدينا، البورشيد لفريق الخدمة الميدانية (اليزابيث بوير، كوك سكوت وكوك مارك) والتقنية فريق استشاري لردودها سريعة ومقترحات مفيدة على التوالي الصك الجيل القادم التسلسل DNA، HiScanSQ، وتحليل البيانات النوعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL080042 (لSQY) وبدء صندوق الوقف للمستشفيات والرحمة للأطفال وعيادات. جامعة ميسوري في مدينة كنساس (لSQY)

<html> يتم عرض مخطط يحدد هذا البروتوكول في الشكل 1. 1. علاج الخلايا مع الثرومبين، RNA العزلة، وتقييم جودة الكمي لRNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الخلايا البطانية الإنسان (HMVEC-LBL) لالتقاء 90-100٪ في 6 وحات جيدة في EGM-2 مع المتوسط ​​5٪ FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية (Lonza، القط # CC-3202). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير وسائل الاعلام الى وسائل الاعلام المجاعة (0٪ FBS) 30 دقيقة قبل العلاج مع ثرومبين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا مع 0.05 U / مل الثرومبين أو ترك دون علاج كعنصر تحكم لمدة 6 ساعة عند 37 ° C و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المعالجة والتحكم باستخدام مير Ambion فانا عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم نوعية RNA مع رقاقة StdSense Experion RNA حقيقية النواة وفقا للبروتوكول قياسي الكهربائي على محطة Experion الآلي (= &quot;_blank&quot;&gt; www.bio-rad.com). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب قياسي الطيفي. </li></ol> 2. مكتبة البناء وتسلسل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع ذات جودة عالية لكل عينة عن بدء المادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء المكتبة، اتبع الإجراء القياسي من البورشيد (البروتوكول # 15008136 القس A). في هذا البروتوكول، جولتين من بولي (A) يتم إجراء التحديدات التي تحتوي مرنا لإزالة الرنا الريباسي للحد من تسلسل الرنا الريباسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم جودة المكتبات باستخدام رقاقة الحمض النووي Experion 1K وفقا لبروتوكول قياسي الكهربائي على محطة Experion الآلي ( <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس مكتبة باستخدام qPCR: استخدام المكتبة التي سبق التسلسل كما منحنى القياسية والاشعال محددة لمحولات ligated. استخدام مجموعة من التخفيفات من مكتبات غير معروف (أي 1:100، 1:500 و1:1،000). تشغيل ACCO qPCRrding في البروتوكول MM SyberGreen وحساب تركيز المخزون الأصلي من كل مكتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأسهم مكتبة إلى 10 نانومتر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للكتلة خلية تدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصبح مستعدة لخلية تدفق الكتلة، ذوبان الجليد لوحة كاشف CBOT في حمام مائي. CBOT أداة تستخدم البورشيد لتبسيط عملية توليد الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الصك CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد المكتبات: الجمع بين ميكرولتر 1X 13 TE ميكرولتر و 6 10 و مكتبة ميكرومتر، إلى جانب الأنبوب، إضافة 1 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم (التي قدمها البورشيد). دوامة، وتدور إلى أسفل، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ووضع المكتبات التشويه والتحريف على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يخفف من المكتبات: مكتبات تمييع مع العازلة التهجين التشويه والتحريف ما قبل المبردة (HT1، التي تقدمها البورشيد) من خلال الجمع بين 996 و 4 ميكرولتر HT1 ميكرولتر مكتبة التشويه والتحريف لتركيز النهائي من 12 مساء. وضع المكتبات التشويه والتحريف والمخفف على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس كل صف من الأنابيب لوحة CBOT،ضمان إذابة كل الكواشف. تدور أسفل لوحة، إزالة / ثقب الأختام احباط وتحميله إلى CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 120 ميكرولتر من المكتبات، والمخفف التشويه والتحريف لأنبوب قطاع، وصفت 1-8. تضيف 1.2 ميكرولتر المخفف، ومراقبة PhiX التشويه والتحريف مكتبة (من البورشيد) في كل أنبوب وتصاعد في السيطرة. وتدور دوامة أسفل أنابيب وتحميلها على CBOT في الاتجاه الصحيح (أنبوب # 1 إلى اليمين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خلية تدفق ومتعددة على وCBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استكمال فحص وتدفق على المدى تبدأ المجموعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال التشغيل، تحقق التسليم في جميع الممرات كاشف. دون أي تشوهات. بدء إما على المدى التسلسل مباشرة أو تخزين الخلية في أنبوب تدفق المقدمة في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في تسلسل على حدة التوليف (SBS، البورشيد) الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الكواشف إلى المناطق المناسبة على الصواني كاشف، والتأكد من عدم لمس الكواشف الأخرى بعد لمس مزيج الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أيN-التسلسل خلية تدفق (أي تلك التي كانت في السابق التسلسل)، رئيس وخطوط كاشف مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف شامل لخلية تدفق التسلسل مع EtOH 70٪ وKimwipes، تليها EtOH 70٪ ورقة العدسة. تفقد الخلية التدفق لأي الشرائط. إعادة تنظيفه إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل خلية تدفق على التسلسل وإجراء فحص تدفق للتأكد من أن الختم بين الفتحات وخلية تدفق ضيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل التسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم مقاييس الجودة (مثل كثافة الكتلة، مجموعات تمرير مرشح، Q30، وكثافة) عندما تصبح متاحة خلال الفترة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد كثافة في جميع أنحاء المدى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من 101 دورات، نفذ الكيمياء تحول لإكمال الثانية كما يلي: ذوبان الجليد في نهاية الاقتران الكواشف وإدماج الاحتياطي قراءة الثاني (ICB، وهو مكون من الكواشف SBS، البورشيد) وتحميل الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل على المدى التسلسل، وتقييم شدة 2 الثانية قراءة، وQ30مقاييس الجودة الثانية الأخرى ومع تقدم التشغيل. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أحدث إصدار من CASAVA (البورشيد، حاليا 1.8.2) لتحويل الملفات مكالمة قاعدة (. BCL) الملفات إلى ملفات fastq.، ووضع fastq للمجموعة العد إلى 0 لضمان إنشاء ملف واحد لfastq كل عينة . بفك الملفات fastq لتحليل المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المقترنة باستخدام المحاذاة نهاية الإصدارات الأحدث من TopHat (1.4.1) 5، والتي تؤيد RNA-يليها يقرأ لالثدييات بحجم الجينوم باستخدام فائقة الإنتاجية العالية اليجنر قراءة قصيرة (بووتي، 0.12.7) 6 و SAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools تنفذ المرافق المختلفة لمرحلة ما بعد المعالجة التحالفات في شكل SAM. يمكن تحميل transcriptome مرجعية الإنسان من iGenomes ( <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). في إدارة TopHat، استخدمنا كافة الإعدادات الافتراضية المعلمة بما في ذلك مكتبة نوع الخيار كما FR-unstranded (افتراضي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لناجي في برنامج CuffDiff، وهي جزء من أزرار أكمام (1.3.0) 8 حزمة البرامج، قارن الخلايا ثرومبين المعالجة إلى الخلايا ضوابط لحجب النصوص الجينات أعرب تفاضلي في السابق على أساس مرجعية transcriptome الإنسان. هذه المقارنة بالكشف عن التعبير الفرق النصوص المعروفة. استخدام Microsoft Excel لتصور النتيجة في شكل جدول. في تشغيل أزرار أكمام البرنامج، استخدمنا كافة الإعدادات الافتراضية المعلمة. هذه النصوص الجينات مع FPKM &lt;0.05 و p&gt; يتم تصفيتها من 0،05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للكشف عن الأشكال الإسوية الرواية، تشغيل بدون أزرار أكمام transcriptome المرجعية. مقارنة الملفات نص عينة إلى إشارة الجينوم باستخدام Cuffcompare واختبار التعبير الفرق مع Cuffdiff باستخدام نسخة ثرومبين مجتمعة الملفات كما الجينوم مرجعية واحدة وتحليل نص السيطرة المشتركة الملفات كما الجينوم مرجعية للتحليل الثاني. استخدام Microsoft Excel لتصور النتيجة في شكل جداول. مرة أخرى، THOSمحاضر الجين ه مع FPKM &lt;0.05 و p&gt; يتم تصفيتها من 0،05. بعد هذه الخطوة، قد تختار المحققين لتحميل قائمة النصوص التي أبلغ عنها حديثا إلى موقع الجينوم UCSC متصفح ( <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> ) للتحقق من صحتها من قبل التفتيش اليدوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم قوائم الجينات أعرب تفاضلي لتحليل المسارات الإبداع (IPA، <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> ) لتوصيف الجينات والمسارات المتضررة من العلاج ثرومبين. في هذه الخطوة، قد تختار لاستخدام المحققين CummeRbund ( <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> )، حزمة R التي تم تصميمها لمساعدة وتسهيل مهمة تحليل RNA-أزرار أكمام يليها الإخراج، للمساعدة في إدارة والتخيل ودمج جميع البيانات التي تنتجها تحليل Cuffdiff. </li></ol> 4. المصادقة على النتائج RNA-يليها من الكمية بو في الوقت الحقيقيlymerase سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء مجموع RNA بمعزل عن السيطرة والمعالجة ثرومبين HMVEC-LBL الخلايا، RNA RNA نوعية التقييم والقياس الكمي موضح في الخطوات 1،4 حتي 1،6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد DNA مكملة من الحمض النووي الريبي ميكروغرام 1 المجموع من كل عينة III مع أطقم مرتفع التجميعي الأول حبلا RT النظام، باتباع إرشادات الشركة المصنعة (إينفيتروجن، 18080-051). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء QRT-PCR تحليل النظم البيولوجية التطبيقية على ViiA 7 نظام PCR في الوقت الحقيقي باستخدام Taqman الفحص عند الطلب أليغنوكليوتيد] مصممة للكشف عن، CUGBP Elav-likefamilymember1 (CELF1، Hs00198069_m1)، Fanconianemia، complementationgroupD2 (FANDCD2، Hs00276992_m1)، TNFreceptor المرتبطة عامل 1 (TRAF1، Hs01090170_m1)، وβ أكتين-(ACTB، Hs99999903_m1). كان كل عينة قالب يعادل 5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. قياس الكميات باستخدام طريقة DDCt وتطبيع للأكتين-β. تم إجراء الفحص عبر كل ثلاثة على الأقل البيولوجية مكررات. </li></ol>

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخطوات الرئيسية التعامل مع RNA: RNases سوف تتحلل حتى أكثر عالية الجودة RNA، لذلك يجب توخي الحذر خلال العزلة، تخزين واستخدام RNA 10. يتم ارتداؤها دائما قفازات لمنع التلوث من RNases العثور على الأيدي البشرية. يجب تغيير القفازات ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="183"> الكواشف أو معدات </td><td width="85"> شركة </td><td width="185"> كتالوج رقم </td><td width="359"> تعليقات </td></tr><tr><td> خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الإنسان غشائي </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza، كيت رصاصة </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> يحتوي EGM-2، FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية </td></tr><tr><td> ثرومبين </td><td> سيجما </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion مير فانا كيت </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 1560 AM </td><td></td></tr><tr><td> ريبونوكلياز-زاب </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> بيو راد </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA إعدادعدة </td><td> البورشيد </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> الخرز AMPureXP </td><td> بيكمان كولتر </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> مرتفع عكس المنتسخة II </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> بيو راد </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> QIAGEN </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE الكتلة الجيل كيت </td><td> البورشيد </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX التحكم كيت </td><td> البورشيد </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 دورة SBS كيت </td><td> البورشيد </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> البورشيد </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> البورشيد </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR آلة - Viia7 </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> نموذج # VIIA7 / 10631261 # المعدات </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> Experion نظام </td><td> راد الحيوي </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer هو نظام بديل </td></tr><tr><td> الطيف </td><td> الحيوي تك </td><td> عصر صفيحة ميكروسكوبية الطيف </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> الطرد المركزي - الكتب التي أسطورة XTR </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 75004521 </td><td> أو ما يعادلها </td></tr><tr><td> موقف المغناطيسي </td><td> الحياة تكنولوجيز </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-جيدا thermocycler </td><td> مختبر مزود العامة </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 3. قائمة الكواشف الرئيسية وE الرئيسيةquipment. *، وفي شريط الفيديو، وقد تجلى HiSeq1000 بدلا من HiScanSQ. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

توصيف التعبير الجيني في الخلايا عن طريق قياس مستويات مرنا هو أداة مفيدة في تحديد كيفية تأثر الجهاز النسخي للخلية بواسطة إشارات خارجية (على سبيل المثال العلاج من تعاطي المخدرات)، أو كيف تختلف الخلايا بين حالة صحية ودولة مريضة. مع ظهور والتحسين المتواصل لتكنولوجيا DNA الجيل القادم التسلسل، أصبح RNA-التسلسل (RNA-يليها) وسيلة شعبية متزايدة لتحليل transcriptome الى الدليل كافة أنواع النصوص، لتحديد هيكل الترانسكربتي من جميع الجينات التي أعرب عنها وتحديد ل مستويات التعبير المتغيرة للمجموعة مجموع النصوص في الخلية 1،2، أو الأنسجة كائن معين. RNA-يليها إلى تغييره بالتدريج ميكروأرس DNA كأسلوب مفضل للتحليل transcriptome لأنه يحتوي على مزايا أنشأ حسابا باسم transcriptome كاملة، وتوفير نوع مسند الرقمية (عدد نسخة من أي نص) وليس الاعتماد على أي sequen الجيني المعروفةم 3. هنا، نقدم بروتوكول كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. ويستند هذا البروتوكول على دراسة حديثة نشرت لدينا بعنوان &quot;RNA-يليها يكشف Transcriptome الرواية الجينات والأشكال الإسوية خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الإنسان الرئوي غشائي المعالجة مع الثرومبين،&quot; 4 التي نفذنا بنجاح أول تحليل transcriptome كاملة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية تعامل مع الثرومبين باستخدام RNA-يليها. أسفرت موارد تكنولوجيا المعلومات لم يسبق لها مثيل لمزيد من التجارب للحصول على أفكار في الآليات الجزيئية الكامنة ثرومبين بوساطة ضعف البطانية في التسبب في حالات الالتهابات، والسرطان، والسكري، وأمراض القلب التاجية، ويوفر إمكانية خيوط جديدة الأهداف العلاجية لتلك الأمراض. النص الوصفي من هذا البروتوكولوينقسم إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول يصف العلاج للخلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع الثرومبين والعزلة RNA، والتحليل الكمي والجودة. الجزء الثاني يصف بناء مكتبة والتسلسل. الجزء الثالث ويصف تحليل البيانات. الجزء الرابع يصف مقايسة التحقق من صحة RT-PCR. يتم عرض نتائج ممثلة من الخطوات الرئيسية عدة. وتقدم نصائح مفيدة لتعزيز الاحتياطات أو النجاح في الخطوات الرئيسية في قسم المناقشات. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الخلايا البطانية تعامل مع الثرومبين، يمكن أن يكون تعميمها على transcriptomes الشخصي في كل من خلايا الثدييات وغير الثدييات والأنسجة في التعامل مع محفزات مختلفة أو مثبطات، أو لمقارنة transcriptomes في الخلايا أو الأنسجة بين حالة صحية ودولة المرض.

لخطوة 1: 28S: يستخدم تقليديا 18S نسبة كمؤشر على تدهور RNA. ومن الناحية المثالية، ذروة 28S يجب أن يكون حوالي ضعف مساحة الفرقة 18S (نسبة 2)، ولكن هذا في كثير من الأحيان لا ينظر النسبة المثالية من الناحية العملية. وعلاوة على ذلك، 28S: يمكن الحصول عليها من نسب 18S طرق طيفية نقل?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

ويعرض هذا البروتوكول إجراء كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها، قوية تكنولوجيا الحمض النووي من الجيل التالي تسلسل، لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. هذا البروتوكول هو تعميم لمختلف الخلايا أو الأنسجة المتضررة من الكواشف المختلفة أو الحالات المرضية.

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K Views.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. ويعرض هذا البروتوكول إجراء كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها، قوية تكنولوجيا الحمض النووي من الجيل التالي تسلسل، لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. هذا البروتوكول هو تعميم لمختلف الخلايا أو الأنسجة ا...

Video: RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

الهندسة الحيوية شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان في الفئران العوز المناعي

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

تحليل الاكسدة في الزرد الأجنة

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.