نحن ممتنون للدكتور شياو ليان غاو، جامعة هيوستن، لتقديم المشورة إلى منصة ميكروأري LC العلوم ميرنا، للدكتور كارين Edvardsson، معهد كارولينسكا بالسويد، والدكتور Eylem Aydogdu، جامعة هيوستن، لتبادل الخبرات ميرنا بهم . وأيد البحوث التي أعلن عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للسرطان التابع لمعاهد الصحة الوطنية في إطار جائزة عدد R01CA172437. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وأيد هذا العمل أيضا من المنح المقدمة من صندوق التكنولوجيا الناشئة تكساس، في إطار اتفاق لا. 300-9-1958.

<ol>
	<li>Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-activated+estrogen+receptor+alpha+does+not+regulate+mature+microRNAs+in+T47D+breast+cancer+cells.">Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).</li><li>Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estradiol-regulated+microRNAs+control+estradiol+response+in+breast+cancer+cells.">Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells.</a> Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).</li><li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+and+estrogen+action.">miRNAs and estrogen action.</a> Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).</li><li>Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oestrogen-dependent+regulation+of+miRNA+biogenesis:+many+ways+to+skin+the+cat.">Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat.</a> Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).</li><li>Kao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+breast+cancer+cell+lines+defines+relevant+tumor+models+and+provides+a+resource+for+cancer+gene+discovery.">Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery.</a> PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).</li><li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours:+an+update.">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).</li><li>Ross, D. T., Perou, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+gene+expression+signatures+from+breast+tumors+and+breast+tissue+derived+cell+lines.">A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines.</a> Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).</li><li>Neve, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+breast+cancer+cell+lines+for+the+study+of+functionally+distinct+cancer+subtypes.">A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes.</a> Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling:+separating+signal+from+noise.">MicroRNA profiling: separating signal from noise.</a> Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).</li><li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+using+microParaflo+microfluidic+array+technology.">MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology.</a> Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).</li><li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+microRNA+sequences,+targets+and+gene+nomenclature.">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).</li><li>Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+culture+conditions+on+the+estrogenic+cell+growth+stimulation+of+human+breast+cancer+cells.">Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).</li><li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells.">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li><li>Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+study+of+the+repressive+effects+of+estrogen+receptor+beta+on+estrogen+receptor+alpha+signaling+in+breast+cancer+cells.">A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells.</a> Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).</li><li>Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U6+snRNA+function+in+nuclear+pre-mRNA+splicing:+a+phosphorothioate+interference+analysis+of+the+U6+phosphate+backbone.">U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone.</a> RNA. 1 (1), 46-54 (1995).</li><li>Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenol+red+in+the+culture+medium+strongly+affects+the+susceptibility+of+human+MCF-7+cells+to+roscovitine.">Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine.</a> Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).</li><li>Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+activity+of+phenol+red.">Estrogenic activity of phenol red.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50 (4), 244-249 (2010).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).</li><li>Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+to+monitor+the+expression+of+microRNA+precursors.">A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.</a> Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).</li><li>Setiawan, A. N., Lokman, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+reference+gene+selection+programs+to+study+the+silvering+transformation+in+a+freshwater+eel+Anguilla+australis:+a+cautionary+tale.">The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale.</a> BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).</li><li>Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+analysis+of+real-time+PCR+data.">Statistical analysis of real-time PCR data.</a> BMC Bioinform. 7, 85 (2006).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يمكن تحديد آلية التنظيم الهرموني من ميرنا في خلايا سرطان الثدي توفير منصة لفهم هذا المرض ويمكن تقديم العلاج المحتملة لسرطان الثدي. زراعة هذه الخلايا لتوفير الظروف المثلى للعمل هرمون مهم جدا. هنا، وقد وصفت البروتوكول الذي يضمن أن هرمون الفائدة (الاستروجين) تم استبعاد قبل العلاج والذي تم استخدامه جرعة الأمثل للE2 لوقت مناسب خلال فترة العلاج. بقيت آثار أخرى عامل الهرمونية والنمو في الحد الأدنى عن طريق خفض مستويات المصل تدريجيا واستخدام DCC-FBS، وهو FBS التي تم تجريده من معظم الهرمون لها، السيتوكينات وعوامل النمو. تم استخدام الفينول الحمراء الخالية وسائل الإعلام أخرى لتقليل الآثار nonhormonal أخرى، بالنظر إلى أن الفينول الحمراء تم الإبلاغ عن أن يكون نشاطا للاستروجين وتؤثر على وظائف معينة في خطوط الخلايا 20،21. وقت تعرض الخلايا لهرمون له أهمية كبيرة. لتنظيم المرتبطة الاستروجين من الجينات، فإنه قد ثبت في وقت سابق ان 24 hrexposure تنتج استجابة كبيرة من الجينات المستهدفة مباشرة في خلايا سرطان الثدي 1،18. منذ وكتب miRNAs بواسطة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني، مثل mRNAs و، فمن المتصور أن هذه النقطة الوقت المناسب للكشف عن التنظيم المباشر أيضا لل miRNAs. فمن لم يتحدد بعد إذا، وكيف تؤثر هذه miRNAs التعبير عن هذه الأهداف ER المعروفة في خلايا سرطان الثدي. ميرنا التعبير التنميط يمكن أن يكون تحديا بسبب صغر حجم النسبي لميرنا، والحقيقة أن تسلسل ميرنا ناضجة يمكن العثور عليها أيضا في الحزب الثوري المؤسسي، ميرنا وقبل ميرنا، وبسبب عدم التجانس في المحتويات الخاصة بهم GC 22. وقد استخدمت العديد من التقنيات التنميط وكيمياء للتغلب على هذه الصعوبة. ومن بين هذه المناهج المختلفة من ميكروأري والتحليل QPCR (الشكل 2). على الرغم من أن تحظى بقبول واسع ميكروأري لكامل الجينوم الشرجysis، فإنه يمكن توفير السلبيات كاذبة وتوجد اختلافات بين المنابر المتاحة، بدءا من الكيمياء إلى تكنولوجيا الطباعة 23. كما يعرض عملية التطبيع تحديا عند تحليل عدد قليل نسبيا من الجينات ميرنا، التي تحسب بالآلاف مقارنة مع عشرات الآلاف من النصوص مرنا. QPCR، من ناحية أخرى، هي أكثر حساسية، ويتم تطبيقها على نحو أفضل عندما ينبغي أن ينظر فيها أقل الجينات. ومع ذلك، عندما أجريت في لوحات كبيرة 384 جيدا، مع تكرار تقني واحد فقط لكل لوحة، لوحات متعددة تحتاج إلى تحليل لكل عينة مما يجعل تحليل مكلفة. أيضا، في أيدينا، تم الحصول على العديد من النتائج السلبية أكثر كاذبة باستخدام تحليل DLP-LDA مقارنة ميكروأري. بالنظر إلى أن تسلسل ميرنا ناضجة موجود في الحزب الثوري المؤسسي، ميرنا ومتواليات قبل ميرنا، فإنه من مصلحة للتمييز بين هذه النصوص باستخدام تقنيات PCR 24. هي تحقيقات DLP متوفرة أيضا لمرحلة ما قبل miRNAs، وسويمكن أيضا الاشعال ecific تكون مصممة لاستبعاد مختلفة ناضجة أو السلائف المتغيرات باستخدام Cyanine صبغ التكنولوجيا QPCR. QPCR هو المعيار الذهبي للتأكد من صحة التعبير التفاضلية من التنميط النتائج. فعالية QPCR، ومع ذلك، يعتمد على العديد من المعلمات بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي، سلامة الحمض النووي الريبي (جودة)، والتوليف [كدنا]، والتصميم التمهيدي، وطريقة الكشف عن (الكيمياء)، وهذا الجين مرجعية لتطبيع البيانات 1،22،25. خيارات التصميم التمهيدي للتحليل ميرنا محدودة للغاية، منذ قصيرة طول تسلسل ميرنا لا يعطي مجالا للبكثير تصميم التمهيدي البديلة، ويمكن آوى التمهيدي واحد فقط في هذا التسلسل القصير. وبالتالي، فإن الحاجة إلى التلاعب البديلة كما هو موضح في الشكل 2. مكررات التقنية مهمة للتحقق من صحة متانة الأسلوب والتضخيم، وعملية توظيف. ويلزم مكررات البيولوجية لتمثيل variatio البيولوجية العامةن، بما في ذلك الاستجابة متغير ليجند العلاج، وتبين أن الآثار ينظر في زنزانة هي استنساخه. بناء على تجربتنا، يمكن أن يحدث تغيرات في التعبير ميرنا بين الثقافات الخلية. عادة ما تكون هذه الخلافات هي أقل من 1.3 أضعاف، ومتوسط ​​القيم والمقابلة SD يحدد الاختلاف الطبيعية والتكنولوجية. هذا الاختلاف يمكن أن تنجم عن عوامل مختلفة بما في ذلك، كثافة الخلية، وحقيقة أن وظائف الخلية يمكن أن تتغير من مرور لمرور. لتحديد تعبيرات هامة إحصائيا الناتجة عن المعالجة يجند، أهمية قبلت على نطاق واسع هو عندما القيمة ع أقل من 0.05. هنا، وقد استخدمت اختبار t للطالب على مكررات البيولوجية والتقنية باستخدام التوزيع ثنائي الطرف وعينة معلمتين الفرق غير متكافئة. المعلمات اختبار t الأخرى موجودة، والاختيار يعتمد على الإعداد التجريبية 26. بروتوكول مفصلة في تقييم الأنظمة الهرمونية ناضجة ميروقدمت NA في خلايا سرطان الثدي. وقد أوضح التكنولوجيات الهامة والكيمياء في التنميط والتحقق من صحة هذه ميرنا التعبير بوضوح. التكنولوجيا المختارة للدراسات ميرنا في خلايا سرطان الثدي يعتمد في النهاية على ماذا بالضبط يجري التحقيق فيها.

هرمون الاستروجين هو الهرمون الذي هو مهمة خلال التنمية الغدة الثديية. هرمون الاستروجين يلعب أيضا دورا هاما في تطوير وصيانة، والمخاطر، والعلاج من سرطان الثدي 1. الاستروجين تمارس وظيفتها عن طريق الربط بين المتطلبات البيئية، والتي هي عوامل النسخ وتنظيم الجينات المستهدفة المحددة. اثنين من المتغيرات مستقبلات، ERα أمر ضروري لانتشار تعتمد على هرمون الاستروجين من خلايا سرطان الثدي. معظم سرطانات الثدي هي ERα إيجابية ويعتمد على هرمون الاستروجين للنمو. جعلت هذه إشارات هرمون الاستروجين وERα هدفا للعلاج في هرمون مستقبلات سرطان الثدي إيجابية. فهم الآلية الكامنة وراء ERα المهم لتحسين نتائج العلاج، والتغلب على مقاومة العلاج، وفهم كيفية تطور سرطان الثدي. miRNAs تلعب أدوارا حاسمة في وظائف الخلية وذلك بسبب تأثير كبير في تنظيم الجينات في مرحلة ما بعد النسخي. miRNAs هي 19-24 النيوكليوتيدات قصيرة، الذين تقطعت بهم السبل واحد، غير المكودة الرنا التي يتم نسخها أول من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني في النصوص ميرنا الابتدائي (الحزب الثوري المؤسسي ميرنا). يتم معالجتها في النواة عن طريق دروشة حيز miRNAs السلائف القصير دبوس (ما قبل ميرنا) ومن ثم معالجتها بواسطة المقامر وفصلها إلى خيوط واحد لتشكيل miRNAs ناضجة في السيتوبلازم. يتم نقل miRNAs ناضجة واحد الذين تقطعت بهم السبل على البروتينات Argonaute لتشكيل معقدة RISC. ثم، يمكن للهجن miRNAs إلى المناطق 3&#39;-غير مترجمة (3&#39;-UTR) من مرنا الهدف، مما يؤدي إلى تنظيم مرحلة ما بعد النسخي من خلال منع ترجمة أو المهينة مرنا الهدف 2. نظرا للدور الهام الذي يقوم به كل من الاستروجين وmiRNAs في تطور الورم، وتحديد miRNAs المرتبطة العادي أو تعطلت إشارات هرمون الاستروجين مهم من أجل تعزيز فهمنا لتطوير وتحسين العلاج من سرطان الثدي. في حين أن هناك فهم جيد لكيفية ينظم ERα الجينات ترميز البروتين، وتمديدوتفاصيل غير المكودة اللوائح RNA يبقى أن تحقيق شامل. وقد أسفرت الدراسات الأولية التي تهدف إلى توضيح اللوائح ERα من ميرنا في خطوط الخلايا سرطان الثدي نتائج متضاربة، حتى عندما يكون خط الخلية نفسها تم تحليلها 3-6. وهذا قد يكون نتيجة لعلاجات مختلفة، والاختلافات البيولوجية، واستخدام تقنيات مختلفة، وحقيقة أن صغر حجم لل miRNAs جعلها تحديا لتحليلها. هنا، يوصف بروتوكول الذي يتحكم عن الاختلافات والتحف الأسلوب. لتحديد أي وينظم miRNAs بواسطة هرمون الاستروجين، والتنميط من الثدي نموذج سرطان محددة جيدا من النشاط ERα هو الخطوة الأولى. وقد ولدت العديد من خطوط الخلايا من الأورام سرطان الثدي ERα إيجابية الإنسان، التي تعتمد على هرمون الاستروجين مماثلة لغالبية سرطانات الثدي السريري. الخصائص الجزيئية لاثنين من هذه خطوط الخلايا، T47D وMCF7، بما في ذلك التعبير عن ERα وهدفه المصب،هرمون مستقبلات هرمون البروجسترون (PR)، والافتقار إلى التعبير عن مستقبلات HER2 الغشاء، جنبا إلى جنب مع التعبير عن الجينات التي تستجيب للتمايز الاستروجين واللمعية الظهارية، وجعلها مناسبة كنماذج للسلالة اللمعية من أورام الثدي 7-10. 17β استراديول (E2) هو الشكل السائد من هرمون الاستروجين، واتسمت تركيزات والنقاط الزمنية لتفعيل النسخي الأمثل للERα في دراسات متعددة. في هذا البروتوكول 10 نانومتر E2 العلاج لمدة 24 ساعة ويستخدم T47D وMCF7 كنماذج للنشاط ERα في خلايا سرطان الثدي 1. بالإضافة إلى ذلك، لوائح ميرنا تعتمد على الوقت يمكن تحليلها على وجه التحديد في فترة زمنية من مثل 1-72 ساعة. ثانيا، تحليل ميرنا يواجه تحديات منفصلة، ​​ويرجع ذلك جزئيا إلى أحجامها قصيرة. لا يتم الاحتفاظ miRNAs جيدا في إجمالي إعداد الحمض النووي الريبي عند تنفيذ Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol الأمطار RNA العادية، أو عندما الحادي ووتستخدم التنقيات العمود ANDARD. يجب أن تؤخذ للحفاظ على إثراء أو لجزء أصغر من الرنا احتياطات خاصة. عن طريق زيادة حجم الأيزوبروبانول، وتخفيض درجة الحرارة قبل الطرد المركزي (-80 ° C)، وإهمال الغسيل في الايثانول 70٪، يمكن تعزيز الاحتفاظ لل miRNAs أثناء هطول الأمطار. أو، يمكن أن تستخدم الأعمدة ومخازن محددة لذات جودة عالية وقوية إعداد الحمض النووي الريبي مجموع المحتوية ميرنا. أيضا لتحليل نفسها، أحجامها قصيرة إنشاء التحديات. لالجينوم على نطاق ميرنا الفرز، وهناك ثلاث تقنيات التنميط ميرنا المشتركة للاختيار من بينها: ميكروأرس، QPCR، والجيل القادم التسلسل. كل تقنية يمكن القيام بها باستخدام منصات مختلفة متعددة، ويطلب من الاستعدادات عينة مختلفة، مع كل المخاطر المختلفة لإدخال الأعمال الفنية. ميرنا في ميكروأري، ورصدت شريحة أو توليفها مع الآلاف من أليغنوكليوتيد]. وتستخدم هذه أليغنوكليوتيد] وتحقيقات، ولكل من لجنة التحقيقتم تصميم و لهجن لتسلسل ميرنا معينة. إعداد نموذج لميكروأرس، كما أجريت في هذه الدراسة، يثري الأول لmiRNAs ثم يدخل Cy5 وCY3 وضع العلامات على miRNAs. ميكروأري يعطي الفرصة لمراقبة مستويات التعبير النسبية لعدد كبير من الجينات في وقت واحد، هو سريع ومناسب لفحص عدد كبير من العينات، ولكن يمكن تحليل متواليات فقط موجودة على ميكروأري وسوف لا يكشف مثل التغيرات في غير معروف أو تحور miRNAs. تحليل ميكروأري كما أجريت في هذا البروتوكول يتطلب أيضا كميات كبيرة نسبيا، حوالي 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع لكل عينة لتحليلها. منخفض الكثافة QPCR ميرنا التنميط يتطلب مواد أقل (700 نانوغرام / عينة وتكرار)، ويسمح للكشف والقياس الكمي لل miRNAs. يمكن تحديد مستويات النص، والكمية التي يمكن أن تكون القيمة المطلقة أو كمية نسبية. يتطلب تحليل QPCR الأولى تحويل ميرنا في [كدنا]، وهنا باستخدام يحلقالتمهيدي لكل ميرنا محددة ضمان تحليل فقط ناضجة ميرنا. هذا يولد قالب أطول التي يمكن تضخيمها باستخدام التمهيدي إلى الأمام ميرنا محددة والتمهيدي عكس عالمية مكملة لتسلسل يحلق، ويمكن أن تؤوي إدراج دقق المزدوج إعتبر للخصوصية. QPCR يمكن استخدامها في شكل منخفض الكثافة حيث يمكن الكشف عن مئات لل miRNAs بالتوازي باستخدام واحد أو عدة لوحات 384 جيدا مع أزواج التمهيدي الفردية في كل بئر 11. الجيل القادم التسلسل، من ناحية أخرى، هو فقط من هذه التقنيات التي تسمح لاكتشاف الرواية، miRNAs تحور أو تحريرها، وجميع الرنا في عينة يمكن أن تكون متسلسلة 11. هذه التقنية، ولكن يتطلب خطوات متعددة لإثراء الرنا الصغيرة وانتاج مكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام عدة خطوات عملية ربط رابط والتنقيات مع المخاطر المعززة اللاحقة من تحوير مستويات التعبير النسبية بين العينات. فإنه يتطلب أيضا bioinformati كبيرةتحليل خدمات العملاء. نظرا للتقنيات مختلفة لميرنا التنميط، والتقنية الأنسب يعتمد على التطبيقات. ميكروأرس هي الأكثر مناسبة عندما المواد وفيرة نسبيا والفائدة لتحديد التعبير التفاضلية لل miRNAs معروفة بالفعل. منخفض الكثافة صفائف QPCR هي الأكثر مناسبة عندما كمية محدودة من عينة متاحة ومطلوب حساسية عالية لل miRNAs المنخفضة التي أعرب عنها. التسلسل هو الأكثر ملاءمة عندما يكون مطلوبا تحليل لل miRNAs المجهول، أو تحور الأشكال الإسوية مختلفة من ميرنا. في دراسة لل miRNAs التنظيم هرمون الاستروجين في سرطان الثدي، وتستخدم اثنين من خطوط الخلايا نموذج، T47D وMCF7، حيث كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي متاحة بسهولة. تم تحليل كل سطر الخلية في مزارع الخلايا المنسوخة باستخدام مقاطع مختلفة، كل في مكررات التقنية من العلاج. وهذا يسمح للكشف قوية من بتكاثر، miRNAs ERα التنظيم. وتمت مقارنة مستويات التعبير النسبية ميرنا باستخدام كل من ميرنا ميكروأري وتحقيقات مزدوجة إعتبر - صفائف منخفض الكثافة (DLP-LDA) والتحقق من صحة النتائج مع QPCR محددة باستخدام كل cyanine الصبغة وكيمياء DLP. ثم تم تحليل أنظمة ميرنا أخرى في السلاسل الزمنية لتحديد التنظيم الدقيق على مر الزمن، والتي يمكن أن تساعد في التفريق الاختلافات عشوائي أو الإيقاعية من اللوائح التي يسببها هرمون الاستروجين، وتشير الآثار الأولية من الآثار الثانوية. يمكن مقارنات مع Bioinformatical الدراسات ملزم لونين من ERα المزيد من المساعدات في التفريق بين الابتدائي مقابل الآثار الثانوية. أسفر الفحص في تقييم يعول عليه لوائح ميرنا حيث يمكن ثبت أن بعد 24 ساعة العلاج E2 النصوص البروتين الترميز تم تنظيمها بسهولة ولكن تم miRNAs ناضجة لا تتأثر 1. ومع ذلك، فمن الممكن أن miRNAs تنظم في وقت لاحق نقاط الوقت، كما هو موضح في تحليل السلاسل الزمنية المحددة لل miRNAs 1. التفاصيل تحتاج إلى مزيد من استكشاف وبروتوكول المعروضة هنا يوفر robusر وسيلة لدراسة التنظيم الهرموني لل miRNAs ناضجة في خطوط خلايا سرطان الثدي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

هرمون الاستروجين يلعب دورا حيويا في التنمية الغدة الثديية وتطور سرطان الثدي. انها تتوسط ظيفتها ملزمة لوتفعيل مستقبلات هرمون الاستروجين (المتطلبات البيئية)، ERα، وERβ. وكثيرا ما upregulated ERα في سرطان الثدي ويدفع انتشار خلايا سرطان الثدي. يعمل المتطلبات البيئية بوصفها عوامل النسخ وتنظيم التعبير الجيني. في حين تم تأسيس التنظيم ERα من الجينات الترميز البروتين بشكل جيد، وتنظيمها من غير المكودة الرنا الميكروي (ميرنا) هو أقل استكشافها. miRNAs تلعب دورا رئيسيا في تنظيم مرحلة ما بعد النسخي من الجينات، مما يعوق ترجمتها أو المهينة مرنا بهم. يمكن miRNAs تعمل كما المسرطنة أو المكثفات ورم واعدة أيضا المؤشرات الحيوية. بين المقايسات ميرنا المتاحة، ميكروأري والكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (QPCR) وقد استخدمت على نطاق واسع لكشف وتحديد مستويات ميرنا. لتحديد miRNAs ينظمها هرمون الاستروجين في سرطان الثدي إشارات، الوتمت مقارنة التعبير EIR في خطوط خلايا سرطان الثدي ERα إيجابية قبل وبعد الاستروجين التنشيط باستخدام كل من ميكروأرس μParaflo-ميكروفلويديك ومزدوجة وصفت تحقيقات منخفض الكثافة صفائف. تم التحقق من صحة النتائج باستخدام فحوصات QPCR محددة، وتطبيق كل من Cyanine قائم على الأصباغ ومزدوجة وصفت الكيمياء أساس تحقيقات. وعلاوة على ذلك، تم استخدام مقايسة الوقت نقطة لتحديد الأنظمة مع مرور الوقت. مزايا النهج فحص ميرنا المستخدمة في هذه الدراسة هو أنه تمكن الفحص السريع للأنظمة ميرنا ناضجة في عينات عديدة، حتى مع كميات عينة محدودة. التخطيط، بما في ذلك شروط محددة لزراعة الخلايا وعلاج هرمون الاستروجين، ومكررات البيولوجية والتقنية، وفحص واسعة النطاق تليها في العمق تأكيد باستخدام تقنيات منفصلة، ​​يضمن الكشف عن لوائح قوية ميرنا، ويلغي ايجابيات كاذبة وغيرها من الأعمال الفنية. ومع ذلك، miRNAs تحور أو غير معروفة، أو لوائح في LEVE نص الابتدائية والسلائفل، لن يتم الكشف عنها. طريقة المقدمة هنا يمثل تحقيق شامل بوساطة الاستروجين التنظيم ميرنا.

ويقدم لمحة عامة عن النهج في الشكل 1 وتصور المقارنة بين مختلف التحضيرات والتعديلات عينة الحمض النووي المطلوبة لكل تقنية في الشكل 2. حالة البيئة والخلايا قبل العلاج مع هرمون مهم في تحديد الآثار الفعلية للهرمون 16. بعض المتوسطة ومصل يحتوي على عوامل النمو التي قد تؤثر على النتائج، لذلك هي خلايا الدم المتعطشة للتأكد من أن جميع التأثيرات الهرمونية قد انخفضت إلى أدنى حد ممكن. وبالتالي، عند علاج مع E2، هناك قدرا أكبر من اليقين أن الآثار الملاحظة ترتبط E2. عامل مهم هو confluency من الخلايا، مما يؤثر اتصال خلية خلية والسلوكيات مثل إشارات خلية خلية والانتشار. سمح الخلايا لتكون 80٪ متموجة (الشكل 3A) والمرفقة جيدا للسماح للنمو وتجنب فقدان الخلايا أثناء الغسيل لاحقة وسائل الإعلام الفصلآنج. الظروف أثناء استخراج الحمض النووي الريبي والتخزين مهمة لنوعية الحمض النووي الريبي وتحليلها لاحقا. وكما هو معروف أن عدد الخلايا، وطريقة الاستخراج، والمحتوى GC من ميرنا يمكن أن تؤثر على المحصول ونوعية كل من mRNAs وmiRNAs 17. وبالتالي، فمن الضروري إجراء استخراج الحمض النووي الريبي خلال ظروف ريبونوكلياز خالية وللتحقق من نوعية الحمض النووي الريبي قبل الشروع في التجارب. بعد الاستخراج، الكمي من الحمض النووي الريبي يقدم معلومات عن تركيز الحمض النووي الريبي مجموع (تحتوي على كل من mRNAs وmiRNAs)، والتي تمكن الملاحظة من الغلة. كما يوفر التمثيل البياني للنتائج كما رأينا في الشكل 3B، وهذا يسمح لمراقبة نقاء العينة (وعادة ما أشار ذروة واحدة، لوحة أعلى). سيكون العائد الفقراء من الحمض النووي الريبي لا تنتج الامتصاص النوعي في 260 نانومتر (الشكل 3B، اللوحة السفلية). لتحديد ما إذا كان الحمض النووي الريبي هو من نوعية عالية، RNAوقد تم قياس النزاهة. عدد سلامة الحمض النووي الريبي (رين) من بين 9-10 يضمن أن الحمض النووي الريبي ليست متدهورة، وهو من نوعية الأمثل. أيضا، ينبغي مراعاة تمثيل رسومي من الحمض النووي الريبي، ويجب أن يكون 18S 28S الريباسي قمم وكما هو مبين في الشكل (4) (لوحة المتوسطة). مقارنة مع سلم (الشكل 4، اللوحة العلوية) ويحدد حجم القمم. ومن شأن الحمض النووي الريبي المتدهورة لها قمم أقل وضوحا وكمية النسبية خفضت من 18S 28S الرنا الريباسي و(الشكل 4، اللوحة السفلية). يمكن زيادة ضمان جزء من الرنا صغيرة باستخدام الحمض النووي الريبي اجيلنت الصغيرة كيت. فمن المستحسن للتحقق من صحة استجابة هرمون الاستروجين بعد العلاج، تحت ظروف تجريبية محددة، قبل الانتقال إلى ميرنا الفرز. A QPCR لا يمكن أن يؤديها على الجين المعروف ER المستهدفة مثل PS2 أو SPINK4 18، وذلك باستخدام قالب [كدنا]. وعادة ما تكون مثل هذه upregulated الجينات داخل 1-24 ساعة بعد العلاج E2. مرة واحدة على نوعية الحمض النووي الريبي واستجابة هرمون الاستروجينوقد تم تقييم، ويمكن إجراء مزيد من التجربة. ميكروأري لا يزال أسلوب يستخدم على نطاق واسع لفحص واسعة النطاق لميرنا التعبير في الخلايا. على سبيل المثال، ميكروأري ميرنا تستخدم مرة واحدة الواردة 894 miRNAs ناضجة و50 ضوابط تحقيقات فريدة من نوعها في تواءم 1. أجريت التهجين في التكرارات مع إجراء المبادلة الصبغة. وعادة ما تكون النتائج ميكروأري ميرنا تمثيلها بيانيا بواسطة خرائط الحرارة. يبين الشكل 5A خريطة الحرارة، وتمثيل البيانات من المقارنة ميكروأري ميرنا بين السيارة وعينات معاملة E2. أحمر يشير إلى أن ميرنا وupregulated في العينة E2 المعاملة (أعلى التعبير)، في حين أشارت الأخضر downregulation من ميرنا (أقل تعبير). اختيار ميرنا عادة ما يعتمد على أهميتها في التعبير، ويعتبر عادة تكون قيمة ف أقل من 0.05 كبيرة. وmiRNAs التي اشارت الى أن أعرب تفاضلي ينبغي مواصلة التحقق من صحة ثإيث QPCR، لتمييزها عن ايجابيات كاذبة. مجموعة DLP-LDA، من ناحية أخرى، يستخدم أسلوب يستند QPCR-للكشف عن miRNAs ينظم في شكل 384 جيدا. عادة ما يتم توفير اثنين من لوحات 384 جيدا (بطاقات)، وحمامات سباحة ألف وباء وعادة ما يحتوي على أفضل وأكثر تتميز أعرب غاية miRNAs من B. تجمع ويتم تحديد المستوى النسبي لكل ميرنا من قبل QPCR، حيث يتم تحليل واحد لكل ميرنا كذلك (الشكل 5B). A ط م أعلى قيمة يشير التعبير ميرنا أقل. مثل الكثير من ميكروأري ميرنا، النتائج المحققة من DLP-LDA بحاجة إلى مزيد من التحقق من صحة لضمان الدقة. التصديقات يمكن القيام بها باستخدام QPCR. هنا، توصف اثنين QPCR طرق الكشف لمنع التحيز وطريقة للسماح للتأكيد شامل والتحقيق لوائح ميرنا. وCyanine قائم على الأصباغ كشف الكيمياء يعمل مختلفة من DLP أن التنميط DLP-LDA يستند، ومناسبة لتأكيدأغراض أوجه. يمكن أن يكون أقل تحديدا لأنه يكشف عن الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل تضخيمها، ولكن تجانس العينة يمكن تقييمها عن طريق إجراء تحليل منحنى ذوبان. 6A الشكل (اللوحة اليسرى) ويبين تحليل منحنى ذوبان من ميرنا، و ويمكن رؤية محددة بوضوح الذروة موحدة. سيكون لاحظ قمم متعددة إذا التمهيدي هو كميات غير محددة أو كبيرة من التمهيدي ديمر يتم تشكيل (الشكل 6A، اللوحة اليمنى). المقايسات DLP ميرنا من ناحية أخرى، هو أكثر تحديدا كما التضخيم فقط من الهدف يتم الكشف ميرنا. ويمكن ملاحظة المؤامرات التضخيم من كل هدف ميرنا، كما يتضح في الشكل 6B. الخيار للسيطرة على وقوع منتجات التضخيم متعددة باستخدام تحليل منحنى ذوبان هو، ومع ذلك، لا تتوفر مع هذه الكيمياء وCyanine صبغ QPCR هو أقل تكلفة. يمكن cyanine الصبغة وDLP QPCR المقايسات ولدت في بعض الأحيان نتائج مختلفة قليلا. على حد سواء المقايسات QPCR، بالمقارنة مع refeمطلوب RENCE الجينات لتحديد التعبير النسبية للجينات بين اثنين من العينات. الجين المرجعية، كما يشار إلى الجينات التدبير المنزلي، ينبغي أن تكون الجينات التي التعبير لا تتغير والتي يعبر عنها عند مستويات مماثلة لهذا الجين من الفائدة. مثال على الجين إشارة مناسبة في هذه السطور خلية سرطان الثدي هو ARHGDIA، وهو رو الناتج المحلي الإجمالي التفكك المانع الذي يعمل ردود الفعل الصرف الناتج المحلي الإجمالي / GTP من البروتينات رو. كما لوحظ في الشكل 6C (أعلى)، لا يتم تغيير مستوى مرنا من ARHGDIA بين السيارة والعينات المعالجة يجند. يمكن أيضا أن تستخدم 18S الرنا الريباسي، وإن كان التعبير العالية يتطلب 1:500 التخفيف منفصلة من الاسهم [كدنا] وبالتالي فهو أقل ملائمة. لتحليل ميرنا، لا يزال هناك نقاش حول الجينات مرجعية واضحة المعالم. حتى الآن، وU6 snRNA هو جين المرجعية التي تم قبولها على نطاق واسع لتحليل ميرنا. U6 snRNA هو 110 ~ النوكليوتيدات طويلة، غير المكودة الحمض النووي الريبي النووي الصغيرة التي تعمل في النووي قبل مرنا الاسكتلنديالجليد 19. كما لوحظ في الشكل 6C (القاع)، ومستويات التعبير U6 هي عن نفسها عبر جميع العينات المعروضة، وبالتالي السماح لإجراء العمليات الحسابية لمستويات متغير من ميرنا. ويمكن ملاحظة الشكل البياني للنتيجة ميرنا QPCR للمقارنة بين المركبات والخلايا E2 المعاملة التي تم تطبيع إلى U6 المرجعية في الشكل 6D. هذا يوضح ميرنا التي تم الكشف عن nonregulated بعد العلاج 24 ساعة E2، ولكن الذي يؤوي ER مواقع ملزم لونين على مقربة من موقعها الجيني، وحددت تحليل السلاسل الزمنية تنظيم كبير 72 ساعة بعد تلقي العلاج. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> الشكل 1. لمحة عامة عن النهج المستخدمة للكشف عن التنظيم الهرموني من ميرنا في خلايا سرطان الثدي. </strأونج&gt; تبدأ عملية مع خلية ثقافة والعلاج، يليها نطاق واسع لتحديد التنميط ميرنا miRNAs ربما أعرب تفاضلي، وينتهي مع التصديقات QRT-PCR من نتائج مجموعة. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> الشكل 2. مقارنة بين مختلف الاستعدادات والتلاعب عينة الحمض النووي لكل تقنية كشف ميرنا. (A) ميرنا ميكروأري باستخدام طريقة التكنولوجيا μParaflo يشمل التخصيب، وبولي-A المخلفات ووضع العلامات ربط. (B) تقنية DLP عينة إعداد وطريقة الكشف يتضمن [كدنا] يحلق التوليف التمهيدي الذي يمتد بعد خطوة تمسخ ويوفر جزء يعد إيواء إعداد نموذج التمهيدي وتسلسل التحقيق عكس (C) التكنولوجيا Cyanine صبغويتضمن طريقة الكشف بولي A-المخلفات، والتوليف [كدنا] مع الاشعال بنسبة ضئيلة من DT بما في ذلك سلسلة عالمية 5 &#39;. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> الرقم 3. زراعة الخلايا واستخراج الحمض النووي الريبي. (أ) الخلايا مثقف لتوضيح 80٪ confluency اللازمة قبل العلاج مع يجند. (B) التمثيل البياني للتركيز الحمض النووي الريبي والنقاء بعد الاستخراج. يمثل كل ذروة عينة وعملية استخراج الحمض النووي الريبي ناجحة تعطي النقي (اللوحة العلوية). ويظهر الحمض النووي الريبي المستخرج سيئة لا ذروة الامتصاص واضحة في 260 نانومتر (اللوحة السفلية). <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> الشكل 4. &amp; #160؛ الحمض النووي الريبي لمراقبة الجودة من نتائج تحليل الحمض النووي الريبي النزاهة تظهر تمثيل رسومي للسلم (أعلى)، وهو RNA نوعية جيدة (وسط) وعينة الحمض النووي الريبي المتدهورة (القاع). <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> الرقم 5. مثال على ميرنا نتائج التنميط. (A) خريطة الحرارة تمثيل ميرنا النتائج ميكروأري لmiRNAs أعرب تفاضلي. وupregulated مير-A، B، C في E2 المعاملة العينة كما هو مبين باللون الأحمر، في حين مير-D، E، F وdownregulated، G في العينة E2 المعاملة كما هو مبين باللون الأخضر. (B) المؤامرات التضخيم لكل ميرنا من نتائج DLP-LDA. وتتضخم ميرنا الكشف كما يتضح من الزيادة في قيمة آكانيوز. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" fس: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; الرقم 6. تحليل QPCR اللوائح ميرنا (أ) تحليل منحنى ذوبان لميرنا تحليلها باستخدام الكشف Cyanine الصبغة، والتي تبين تجانس جميع العينات المختبرة (يسار) والتضخيم من شظايا متعددة (يمين). (B) المؤامرات التضخيم لكل عينة ل ميرنا. هذا يمكن أن يكون إما من Cyanine صبغ أو DLP طرق الكشف. (C) التمثيل بار الرسم البياني للجينات مرجعية مناسبة لتحليل مرنا ARHGDIA (أعلى) وميرنا لتحليل snRNA U6 (القاع)، يظهر أي تعبير الفرق كبير بين العينات. (D) النتائج ميرنا QPCR لتوضيح المقارنة بين مستويات التعبير النسبية للمير 135A خلال دورة الزمن. يتم طبع الشكل 6D من Katchy وآخرون. 1 بإذن من السيفير. القيم هي عادة متوسط ​​EXPER منفصلةiments (التكرارات البيولوجية) ± SD. يتم استخدام اختبار t الطالب لإثبات أهمية: * ع &lt;0.05.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells at JoVE.com

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

الجزيئي يشير من خلال كل من الاستروجين وmicroRNAs حاسمة في تطوير سرطان الثدي والنمو. الاستروجين ينشط مستقبلات هرمون الاستروجين، والتي هي عوامل النسخ. يمكن أن العديد من عوامل النسخ تنظيم التعبير عن microRNAs، وmicroRNAs التنظيم الاستروجين يمكن لمحة باستخدام تقنيات مختلفة واسعة النطاق.

التنميط من MicroRNAs الاستروجين التنظيم في خلايا سرطان الثدي

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

profiling-of-estrogen-regulated-micrornas-in-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K Views.  University of Houston.  الجزيئي يشير من خلال كل من الاستروجين وmicroRNAs حاسمة في تطوير سرطان الثدي والنمو. الاستروجين ينشط مستقبلات هرمون الاستروجين، والتي هي عوامل النسخ. يمكن أن العديد من عوامل النسخ تنظيم التعبير عن microRNAs، وmicroRNAs التنظيم الاستروجين يمكن لمحة باست...

Video: Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

في ضوء بارد التصوير حيوية الجسم الحي من نقص الأكسجة ورم من الدماغ الانبثاث سرطان الثدي في نموذج الفأر

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

ومتعددة الوسائط التصوير من الأوعية الدموية في نموذج الفئران عاري من سرطان الثدي الإنبثاث العظام باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، الحجمي التصوير المقطعي والموجات فوق الصوتية

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

يعيش التصوير من الاستجابة للأدوية الأورام المكروية في في نماذج الماوس من سرطان الثدي

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

التنميط الجزيئي للالمكروية ورم الغازية في نموذج 3 الأبعاد للخلايا سرطان القولون والمستقيم و<em&gt; خارج الحي</em&gt; الخلايا الليفية

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي في الثديية الدهون وسادة من الفئران لدراسة نمو الأورام.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

في فيفو وفيفو السابقين المداخل لدراسة سرطان المبيض النقيلي الاستعمار من الهياكل التبانة بقعة في البريتوني الدهنية

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.