המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר סטיבן Kingsmore ומרכז לרפואת הגנום ילדים בבתי החולים ומרפאות מרסי לילדים לשימוש באשכולות המחשוב שלהם לניתוח הנתונים שלנו, צוות של Illumina תחום השירות (אליזבת בוייר, סקוט קוק ומארק קוק) והטכני צוות יועצים לתגובות המהירות שלהם והצעות מועילות על הריצה של מכשיר הדור הבא של רצפי DNA, HiScanSQ, וניתוח איכות נתונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט HL080042 (לSQY) והקרן הזנק והנחלה של בתי החולים ומרפאות מרסי לילדים, אוניברסיטת מיזורי בקנזס סיטי (לSQY).

<html> תרשים זרימה מתאר פרוטוקול זה מוצג באיור 1. 1. טיפול בתאים עם טרומבין, RNA בידוד, הערכת איכות וכימות של RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושי ריאות כלי דם (אנדותל HMVEC-LBL) למפגש 90-100% בצלחות 6-גם במדיום EGM-2 עם 5% FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה (Lonza, חתול # CC-3202). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת לתקשורת הרעבה (0% FBS) 30 דקות לפני הטיפול עם תרומבין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התאים עם 0.05 U / ml תרומבין או להשאיר מטופל כשלט עבור 6 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA כלל מהתאים שטופלו ושליטה באמצעות Ambion מיר נה הערכה לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות RNA עם שבב RNA האיקריוטים StdSense Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion (= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את RNA באמצעות שיטת spectrophotometric סטנדרטית. </li></ol> 2. בניית הספרייה ורצף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוגרם 1 של RNA באיכות הגבוהה הכולל לדוגמה כחומר מוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות את הספרייה, בצע את ההליך הסטנדרטי מIllumina (פרוטוקול # 15008136 כומר). בפרוטוקול זה, שני סיבובים של פולי () בחירות mRNA מכילים מבוצעים כדי להסיר rRNA כדי למזער את רצפי rRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות הספריות באמצעות שבב ה-DNA 1K Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">(www.bio-rad.com).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הספרייה באמצעות qPCR: השתמש בספרייה שבעבר כבר רצף כעקומה ופריימרים ספציפיים למתאמי הגבעול סטנדרטי. השתמש במגוון של דילולים של ספריות לא הידועות (כלומר 1:100, 1:500 ו1:1,000). הפעל qPCR עכוrding לפרוטוקול MM SyberGreen ולחשב את ריכוז המנייה המקורית של כל ספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות לספריית 10 ננומטר ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לאשכול תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן לאשכול תא זרימה, להפשיר את הצלחת מגיבה CBOT באמבט מים. CBOT הוא מכשיר Illumina משמש כדי לייעל את תהליך יצירת האשכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מכשיר CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל ספריות: שלב 13 מיקרומטר ספריית 6 μl 10 1x TE μl ו, לצדו של הצינור, להוסיף 1 μl 1 N NaOH (המסופק על ידי Illumina). מערבולת, ספין למטה, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולמקם את הספריות המפוגלות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הספריות: לדלל את הספריות המפוגלות עם חיץ הכלאה מראש מצונן (HT1, המסופק על ידי Illumina) על ידי שילוב HT1 ו4 ספריית μl מפוגלת μl 996 לריכוז סופי של 12 PM. הנח את הספריות מפוגלות ומדוללות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך כל שורה של צינורות של צלחת CBOT,להבטיח כי כל ריאגנטים מופשרים. הספין למטה הצלחת, להסיר / לנקב את חותמות רדידים ולהעמיס CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 120 μl aliquot של ספריות המדוללות, המפוגלות לצינור רצועה, שכותרתו 1-8. הוסף 1.2 ספריית μl מדוללת, מפוגלת PhiX שליטה (מIllumina) לכל צינור כמחודד בשליטה. מערבולת וספין למטה את הצינורות ולטעון אותם על CBOT בכיוון הנכון (צינור # 1 בצד ימין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תא זרימה וסעפת על CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הזרימה לבדוק ולהתחיל לרוץ באשכולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריצה תושלם, לבדוק משלוח מגיב בכל הנתיבים. שים לב לתופעות חריגות. גם להתחיל לרוץ רצף מייד או לאחסן את תא הזרימה בצינור ספק ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את כל סידור אחר הסינתזה (SBS, Illumina) ריאגנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ריאגנטים למקומות המתאימים במגשים המגיבים, כדי לוודא שלא לגעת בחומרים הכימיים האחרים לאחר שנגע תמהיל המחשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש לאתא n-רצף זרימה (כלומר אחד שמיצה בעבר), ממשלת הקווים המגיבים פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את תא רצף זרימה עם EtOH 70% וKimwipes, ואחרי EtOH 70% ונייר עדשה. בדוק את תא זרימה לכל פסים. מחדש לנקות אותו במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תא הזרימה על הרצף ולבצע זרימה לבדוק כדי להבטיח שחותם בין הסעפות ותא הזרימה הוא הדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לרוץ רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את מדדי האיכות (לדוגמה, צפיפות האשכול, אשכולות שעברו סינון, Q30, עצמה) כפי שהם מתפרסמים בזמן הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח עצמה לאורך הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 101 מחזורי הסקרים, לבצע תפנית כימיה כדי להשלים את 2 קראו: הפשר את ריאגנטים הקצה לזווג והצפת התאגדות הקריאה השנייה (ICB, מרכיב של ריאגנטים SBS, Illumina) ולטעון את החומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ריצת הרצף, הערכת 2 nd לקרוא עצמה, Q30מדדים אחרים nd איכות כמו התקדמות הריצה. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגרסה העדכנית ביותר של CASAVA (Illumina, כרגע 1.8.2) כדי להמיר את קבצי הבסיס (הטלפוניים. BCL) קבצים לקבצים. Fastq, הגדרת fastq-אשכול ספירה ל 0 כדי להבטיח יצירת קובץ fastq יחיד עבור כל דגימה . לפתוח את קבצי fastq לניתוח במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע יישור הסוף לזווג שימוש בגרסות האחרונות של TopHat (1.4.1) 5, שמיישרת RNA-seq קורא לגנומים של יונקים בגודל באמצעות אולטרה aligner התפוקה גבוהה הקצר הקריאה (BOWTIE, 0.12.7) 6 וSAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools מיישם כלי עזר שונים למערכים לאחר עיבוד בפורמט SAM. Transcriptome אנושי ההתייחסות ניתן להוריד מiGenomes <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">(www.illumina.com).</a> בריצת TopHat והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים כוללים אפשרות סוג הספרייה כfr-unstranded (ברירת מחדל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוing CuffDiff התכנית, חלק מחפת (1.3.0) חבילת תוכנה 8, להשוות את תאי תרומבין שטופל לתאי הבקרה לסנן את תמלילי הגנים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בעבר על בסיס transcriptome ההתייחסות האנושית. השוואה זו מזהה את ביטוי ההפרש של תמלילים ידועים. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בצורת טבלה. בהפעלת תכנית חפת והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים. אלה תעתיקי גנים עם FPKM &lt;0.05 ו-p&gt; 0.05 מסוננים החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות isoforms רומן, לרוץ בלי חפת transcriptome הפניה. השווה את קבצי תמליל הדוגמא להתייחסות הגנום באמצעות Cuffcompare ולבדוק את ביטוי ההפרש עם Cuffdiff באמצעות קבצי תמליל תרומבין המשולבים כהגנום התייחסות לניתוח אחד ואת קבצי תמליל בקרה המשולבות כהגנום התייחסות לניתוח שני. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בתבנית טבלאית. שוב, thosתעתיקי גני E עם FPKM &lt;0.05 ו-p&gt; 0.05 מסוננים החוצה. לאחר שלב זה, חוקרים יכולים לבחור כדי להעלות רשימה של תמלילים שדווחו לאחרונה לאתר UCSC הגנום הדפדפן <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">(http://genome.ucsc.edu/)</a> כדי לאמת את תוקפם על ידי בדיקה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח רשימות של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי לניתוח נתיב שנינות (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com)</a> לאפיון של הגנים והשבילים המושפעים מטיפול תרומבין. בשלב זה, חוקרים יכולים לבחור להשתמש באבנט <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">(http://compbio.mit.edu/cummeRbund/),</a> חבילת R אשר נועדה לסייע ולפשט את המשימה של ניתוח חפת פלט RNA-seq, כדי לסייע בניהול, לדמיין ולשלב את כל נתונים המיוצרים על ידי ניתוח Cuffdiff. </li></ol> 4. אימות של תוצאות RNA-seq ידי בזמן אמת-פו כמוניתגובת שרשרת lymerase (qRT-PCR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד RNA מוחלט משליטה ותאי תרומבין טופל HMVEC-LBL, RNA איכות הערכה וכימות רנ&quot;א תאר בצעדים 1.4-1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר דנ&quot;א משלים מ1 RNA מיקרוגרם הכולל של כל דגימה עם ערכות עיליות III ראשון גדיל סינתזת מערכת RT, בעקבות הוראות היצרן (Invitrogen, 18080-051). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח qRT-PCR על מערכת Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR באמצעות TaqMan oligonucleotides נועד Assay על פי דרישה לגילוי CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor גורם הקשור 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), וβ-יקטין (ACTB, Hs99999903_m1). כל דגימה הייתה תבנית שווה ערך ל 5 ננוגרם של רנ&quot;א בסך הכל. למדוד לכמת בשיטת DDCt ולנרמל לβ-תקטין. כל assay בוצע על פני לפחות שלוש ביולוגיים משכפל. </li></ol>

<ol>
	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data.">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li><li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שלבים עיקריים טיפול RNA: RNases לבזות אפילו את רוב RNA באיכות גבוהה, ולכן יש להקפיד בעת הבידוד, האחסון והשימוש של רנ&quot;א 10. כפפות תמיד שחוקות על מנת למנוע זיהום על ידי RNases שנמצא על ידי אדם. כפפות צריכות להיות שונות לעתים קרו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="183"> ריאגנטים או ציוד </td><td width="85"> חברה </td><td width="185"> מספר קטלוגים </td><td width="359"> תגובות </td></tr><tr><td> תאי ריאת כלי דם האנדותל אדם </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, קיט Bullet </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> מכיל EGM-2, FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה </td></tr><tr><td> תרומבין </td><td> סיגמא </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion מיר נה קיט </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens רנ&quot;א </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq רנ&quot;א הכנהקיט </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> עילי הפוך transcriptase השני </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> 1K Experion DNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster דור קיט </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX בקרת הקיט </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 מחזור SBS קיט </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> מכונת qPCR - Viia7 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> # VIIA7 / ציוד דגם # 10631261 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Experion מערכת </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer היא מערכת חלופית </td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> Bio-Tek </td><td> אפוק Microplate ספקטרופוטומטר </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> צנטריפוגה - Sorvall המקרא XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> מעמד מגנטי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-היטב thermocycler </td><td> ספק מעבדת כללית </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לוח 3. רשימה של ריאגנטים מפתח ומי מז&#39;ורquipment. *, בוידאו, HiSeq1000 במקום HiScanSQ הודגם. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

האפיון של ביטוי גנים בתאים באמצעות מדידת רמות ה-mRNA הוא כלי שימושי בקביעה כמה מכונות התעתיק של התא מושפעות מאותות חיצוניים (לדוגמה: טיפול תרופתי), או כמה תאים שונים בין מצב בריא ומצב חולה. עם כניסתו ועידון מתמיד של טכנולוגיית רצפי DNA של הדור הבא, RNA-רצף (RNA-seq) הפך שיטה פופולרית יותר ויותר של ניתוח transcriptome לקטלג את כל המינים של תמלילים, כדי לקבוע את מבנה התעתיק של כל הגנים הביעו ולכמת הרמות המשתנות הביטוי של המערך הכולל של תמלילים בניתן 1,2 תא, רקמה או אורגניזם. RNA-seq הדרגה מחליף מערכי DNA כשיטה מועדפת לניתוח transcriptome כי יש לו את היתרונות של אפיון transcriptome מלא, ומספק נתון סוג דיגיטלי (מספר העתק של כל פרוטוקול) ולא להסתמך על כל sequen הגנומי ידוע3 לספירה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומפורט כדי להחיל RNA-seq לtranscriptomes פרופיל בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה תחת הכותרת שלנו &quot;RNA-seq חושף transcriptome רומן של גנים וisoforms בתאי כלי דם ריאתי אדם שטופלו באנדותל טרומבין,&quot; 4 שבבצענו ניתוח transcriptome המלא הראשון של תאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל בהצלחה טופל בתרומבין באמצעות RNA-seq. הוא הניב משאבים חסרי תקדים לניסויים נוספים כדי לקבל תובנה לתוך מנגנונים מולקולריים שבבסיס תפקוד האנדותל תרומבין בתיווך בפתוגנזה של מצבים דלקתיים, סרטן, סוכרת, ומחלת לב כלילית, ומספק לידים חדשים פוטנציאליים למטרות טיפוליות למחלות אלה. טקסט התיאורים של פרוטוקול זההוא מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון מתאר את הטיפול בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם תרומבין ו-RNA בידוד, איכות ניתוח וכימות. החלק השני מתאר את בניית ספרייה וסדר. החלק השלישי מתאר את ניתוח הנתונים. החלק הרביעי מתאר assay אימות RT-PCR. תוצאות מייצגות של כמה צעדים מרכזיים מוצגות. טיפים או אזהרות שימושיים כדי לשפר את ההצלחה בשלבים עיקריים מובאים בסעיף הדיון. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי אנדותל כלי דם ריאתי אדם שטופלו בתרומבין, זה יכול להיות כללי לtranscriptomes הפרופיל בשני תאי יונקים ושאינם יונקים וברקמות שטופלו בגירויים שונים או מעכבים, או להשוואת transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב של מחלה.

עבור שלב 1: -28: יחס 18s משמש באופן מסורתי כאינדיקציה לפירוק רנ&quot;א. באופן אידיאלי, -28 השיא צריך להיות בערך פי שניים מהשטח של להקת 18s (יחס של 2), אולם יחס אידיאלי זה הוא לעתים קרובות לא ראה בפועל. יתר על כן, יחסים -28: 18S המתקבלים משיטות spectrophotometric יכולים לזלזל בסכום של ה?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells at JoVE.com

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K Views.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

Video: RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

בידוד תרבות לתאי אנדותל ריאתי מעכברים ילודים

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

האדם Bioengineering רשתות כלי הדם של עכברים Immunodeficient

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

בידוד של כלי הדם האנדותל צינורות מעורקי עכבר התנגדות

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ניתוח של סטרס חמצוני בעוברי דג הזברה

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.