فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور محمد Cliona مكهيل لقراءة ناقدة وتحرير المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، المعهد الوطني للصحة منح R01ES017452 لتشانغ L.

1. نموذج إعداد الشرائح <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تصميم FISH OctoChrome لدراسة التغيرات الكروموسومية في هوامش الطورية من الخلايا البشرية، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر مثقف الخلايا الدموية المحيطية، والخلايا الجذعية / السلف، وخطوط الخلية. وينبغي إعداد العينات بعد أن الإجراء المعتاد لحصاد metaphases 3،11-13: عن طريق استخدام العلاج colcemid للقبض على خلايا في الطورية، علاج تضخم منخفض التوتر على الخلايا، وCarnoy ومثبت لإصلاح الخلايا في التعليق على ما يقرب من 0،5-1 X الخلايا 6 10 لكل مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف الشريحة 8 مربع (المنصوص عليها في عدة OctoChrome، كتالوج #: PMP 803، Cytocell المحدودة، كامبريدج، المملكة المتحدة، الشكل 2) عن طريق غمس إلى الإيثانول النقي لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل اتخاذ الشريحة عينة، وانخفاض كمية صغيرة من الخلايا على شريحة لفحص كثافة الخلية. إذا كانت كثافة الخلية مرتفعة جدا (عدد كبير جدا من الخلايا المتداخلة)، يخفف من التعليق مع مثبت الطازجة. إذا كانت كثافة منخفضة جدا الخلية (خلية قليلة جداق على الشريحة)، وتدور باستمرار في الخلايا وأصغر حجم مثبت الطازجة إعادة تعليق. ماصة ميكرولتر 5-10 من التعليق على كل خلية من 8 مناطق من الشريحة قالب في سلسلة من المربعات بالتناوب 1/7 - 2 / 8-3 / 5 - 4/6. مرة الاولى مربعين والمجفف في الهواء، بقعة الساحات المتبقية بنفس الطريقة. وهذا يمنع انتشار الخلايا من التداخل مع بعضها البعض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تخزين الشريحة المجففة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في جو النيتروجين لأكثر من 5 سنوات قبل التهجين. </li></ul> 2. توطين metaphases باستخدام نظام آلي <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 20 ميكرولتر من 4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole (0.2 ميكروغرام / مل) إلى مركز كل نصف الشريحة ومن ثم تغطية مع ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الفحص الآلي للشريحة عينة في توطين الخلايا الطورية باستخدام Metafer البرمجيات (MetaSystems، Altlussheim، ألمانيا). هذا يسهل موقع metaphases جميع والمستقبل إعادة تقييم جميع الصور الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض نتائج المسح يدويا وحذف غير الطورية التحف. </li></ul> 3. تهجين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الشريحة عينة وجهاز OctoChrome </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشريحة عينة في محكمة أمن الدولة العازلة 2X في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ليغسل دابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الشريحة عينة من خلال سلسلة من يغسل الإيثانول (2 دقيقة في كل من 70٪، 85٪ والايثانول 100٪)، والسماح ليجف ووضعه على 37 درجة مئوية موقد لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع التهجين Multiprobe غرفة Chromoprobe (المنصوص عليها في عدة OctoChrome) في حمام ماء C ° 37، والسماح للتوازن إلى 37 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من حل التهجين (المنصوص عليها في عدة OctoChrome) بواسطة pipetting المتكررة وقبل دافئ 1 قسامة 25 ميكرولتر لكل جهاز OctoChrome إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ كل جهاز OctoChrome (المنصوص عليها في عدة OctoChrome، انظر الشكل 2) إلى 37 درجة مئوية عن طريق وضع الجانب تسمية جهاز حفر على موقد. لا تلمس رانه السطوح تنقش الجهاز OctoChrome لأنها تحتوي على تحقيقات. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المواقع من الشريحة عينة على جهاز OctoChrome (الشكل 2) </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من حل تهجين ما قبل حرارة على كل من المجالات الثمانية على الجهاز قبل حرارة OctoChrome في حين لا يزال عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية عكس الشريحة قالب على جهاز OctoChrome مثل الموجود الرقم 1، والذي هو الآن رأسا على عقب، فوق منطقة اليد اليمنى العليا للجهاز OctoChrome. للمساعدة في تحديد مربع 1، اتسم موقفها على الجهاز في أورانج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن يتم محاذاة بعناية الشريحة قالب مع مجالات مطابقة على الجهاز OctoChrome. خفض بعناية الشريحة على جهاز OctoChrome بحيث قطرات من محلول التهجين اجراء اتصالات مع الشريحة. تطبيق لطيف، والضغط حتى لضمان أن يتم نشر حل التهجين على حواف كل مجال من المجالات المطروحة على الجهاز OctoChrome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفعالشريحة / OctoChrome، وعقد بعناية نهاية متجمد من شريحة زجاجية، وعكس ذلك أن الشريحة هي تحت الجهاز OctoChrome. تأكد من أن الجهاز لا تشهير عبر الشريحة قالب مثل هذا يمكن أن تسبب انتقال التلوث من التحقيقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على 37 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) موقد لمدة 10 دقائق. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمسخ </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجهاز الشريحة / OctoChrome عينة لموقد رعاية خاصة من أجل الاحتفاظ بها مستوى. ضمان الشريحة عينة الاتصالات بالتساوي على موقد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد على موقد عند 75 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تهجين </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشريحة عينة / جهاز OctoChrome في التهجين غرفة Chromoprobe Multiprobe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال غطاء وتطفو على غرفة في 37 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) حمام الماء (غير - التحريك) بين عشية وضحاها. يرجى ملاحظة: لا اغلاق الغطاء على غرفة تهجين، لا ختم غطاء على حمام مائي، لا هجن فيالحاضنة. هذه الخطوات حاسمة لضبط نسبة الرطوبة. </li></ul><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تهجين يغسل </li><ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محاليل غسيل الحل 1: إعداد جرة Coplin / Hellendahl تحتوي على 0.4x محكمة أمن الدولة. تتوازن إلى 72 درجة مئوية (+ / - 1 درجة مئوية) في حمام مائي وضبط درجة الحموضة إلى 7.0. حل 2: إعداد جرة Coplin / Hellendahl 2X تحتوي على محكمة أمن الدولة و0.05٪ توين 20. السماح للوقوف على درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجهاز OctoChrome بعناية من الشريحة ووضع الشريحة في الحل 1 لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الانزلاق نحو الحل 2 لمدة 30 ثانية. </li></ul></ol> 4. تصاعد والتصور لنتائج <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 20 ميكرولتر من دابي إلى مركز كل نصف الشريحة وتطبيق ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الظلام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل عرض بواسطة الفحص المجهري مضان. </li></ul> 5. ممثل النتائج فيقوإعادة 3A يظهر خلية الطورية طبيعي في ساحة 2. (1) - (3): رسمت الكروموسومات 8، 21 و 12 الأحمر والأخضر والأزرق، ونحن من خلال تصور الأحمر تكساس، FITC، ومرشح DEAC، على التوالي، (4): التصور من خلال دابي / FITC / تكساس الأحمر الثلاثي مرشح. عموما، فإن الكروموسومات رسمت باللون الأزرق ليست واضحة من خلال الفلتر الثلاثي وتحتاج إلى أن ينظر إليها في إطار تصفية DEAC محددة. ويبين الشكل 3B الخلايا الشاذة مع ممثل اللوكيميا محددة إزفاء الكروموسومات وعدم توازن الصبغيات. (1): تي (8، 21)، وإزفاء مشترك الكروموسومات في سرطان الدم النخاعي الحاد، (2): تثلث الصبغي 21، ثلاث نسخ من كروموسوم 21، وعدم توازن الصبغيات شيوعا في الإصابة بسرطان الدم. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig1.jpg" /> الشكل 1. ترتيب مجموعات كروموسوم على الجهاز OctoChrome والنتائج المتوقعة لوحة الكروموسومات. <img alt="الشكل 2" src= &quot;/ files/ftp_upload/3619/3619fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. وضعية شريحة عينة على جهاز OctoChrome. الشكل 3. النتائج الممثلالتي تم الحصول عليها من الأسماك OctoChrome (مربع 2). <img alt="الرقم 3A" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3A.jpg" /> 3A الشكل. خلية طبيعية مع الصبغيات (الكروموسومات) 8، 12، 21 رسمت في ساحة 2. <img alt="الشكل 3B" src="/files/ftp_upload/3619/3619fig3B.jpg" /> 3B شخصية. الخلايا الشاذة مع الممثل اللوكيميا محددة إزفاء الكروموسومات وعدم توازن الصبغيات في ساحة 2.

<ol>
	<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+of+chromosomal+aberrations+detected+in+humans+exposed+to+benzene.">The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene.</a> Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrations+in+chromosomes+associated+with+lymphoma+and+therapy-related+leukemia+in+benzene-exposed+workers.">Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers.</a> Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzene+increases+aneuploidy+in+the+lymphocytes+of+exposed+workers:+a+comparison+of+data+obtained+by+fluorescence+in+situ+hybridization+in+interphase+and+metaphase.">Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+aneusomy+and+long+arm+deletion+of+chromosomes+5+and+7+in+the+lymphocytes+of+Chinese+workers+exposed+to+benzene.">Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene.</a> Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).</li><li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+translocations+and+aneusomy+in+chromosomes+8+and+21+among+workers+exposed+to+benzene.">Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene.</a> Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).</li><li>Bayani, J., Squire, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+detection+of+chromosomal+aberrations+using+spectral+karyotyping.">Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping.</a> Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome-wide+aneuploidy+study+(CWAS)+in+workers+exposed+to+an+established+leukemogen,+benzene.">Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene.</a> Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).</li><li>Rowley, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromosome+translocations+in+leukemogenesis.">The role of chromosome translocations in leukemogenesis.</a> Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+OctoChrome+fluorescence+in+situ+hybridization+to+detect+specific+aneuploidy+among+all+24+chromosomes+in+benzene-exposed+workers.">Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers.</a> Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).</li><li>Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S., Barch, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In The ACT cytogenetics laboratory. , 17-30 (1991).</li><li>Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonrandom+aneuploidy+of+chromosomes+1,+5,+6,+7,+8,+9,+11,+12,+and+21+induced+by+the+benzene+metabolites+hydroquinone+and+benzenetriol.">Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol.</a> Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).</li><li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroquinone,+a+benzene+metabolite,+increases+the+level+of+aneusomy+of+chromosomes+7+and+8+in+human+CD34-positive+blood+progenitor+cells.">Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells.</a> Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).</li><li>Smith, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+benzene+health+effects+and+susceptibility.">Advances in understanding benzene health effects and susceptibility.</a> Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

هذه الرواية OctoChrome الأسماك فحص يسمح احد لفحص في وقت واحد كل 24 الكروموسومات البشرية في تهجين واحدة على شريحة واحدة. وقد تم تصميم هذا الترتيب من تركيبات كروموسوم على المربعات 8 إلى تسهيل التعرف على إعادة ترتيب الكروموسومات غير عشوائية في سرطانات الدم الأكثر شيوعا واللي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td><tr><tr><td> OctoChrome كيت </td><td> Cytocell المحدودة، كامبريدج، المملكة المتحدة </td><td> PMP 803 </td><td></td></tr><tr><td> phytohaemagglutinin (PHA) </td><td> إينفيتروجن شركة </td><td> 10576-015 </td><td></td></tr><tr><td> Colcemid </td><td> إينفيتروجن شركة </td><td> 15212-012 </td><td></td></tr><tr><td> Carnoy ومثبت </td><td></td><td></td><td> الميثانول: حامض الخليك الجليدي = 3: 1 </td></tr><tr><td> مضان ميلcroscope </td><td></td><td></td><td> مجهزة مرشحات لعرض دابي، تكساس الأحمر، FITC، والأطياف الكومارين بشكل فردي ودابي / FITC / تكساس الأحمر الفلتر الثلاثي لعرض ألوان مختلفة في وقت واحد </td></tr><tr><td> Metafer البرمجيات </td><td> MetaSystems، Altlussheim، ألمانيا </td><td></td><td> تسهيل لتحديد موقع كل metaphases وإلى إعادة تقييم حالة شذوذ </td></tr></tbody></table>

chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel octochrome fish assay

مضان في تهجين موضعية (سمكة) هي تقنية تسمح ليتم الكشف عن تسلسل الحمض النووي محددة على الكروموسومات الطورية أو الطور البيني في نوى الخلايا 1. هذه التقنية يستخدم الحمض النووي تحقيقات مع تسلسل فريد من نوعه لهجن الكروموسومات كله أو مناطق معينة الكروموسومات، وبمثابة مساعدا قويا لعلم الوراثة الخلوية الكلاسيكية. على سبيل المثال، ذكرت في وقت سابق العديد من الدراسات للكشف الانحرافات المتكررة للكروموسوم زيادة في المرضى بسرطان الدم وبين التعرض للبنزين، والمرضى البنزين للتسمم، والعاملين في مجال صحي يتعرضون لمادة البنزين، وذلك باستخدام التحليل الوراثي الخلوي الكلاسيكية 2. استخدام الأسماك، وقد لوحظت اللوكيميا محددة التعديلات الكروموسومات إلى أن تكون مرتفعة في اصحاء العمال المعرضين لمادة البنزين 3-6، مما يشير إلى الأدوار الحاسمة من التغييرات cytogentic في البنزين التي يسببها leukemogenesis. بشكل عام، وهو فحص سمكة واحدة يدرس فقط واحد أو عدد قليل الكروموسومات كاملأو مواضع معينة لكل شريحة، حتى التهجين متعددة تحتاج إلى أن تتم على عدة شرائح لتغطية كل من الكروموسومات البشرية. karyotyping الطيفية (السماء) ويسمح التصور من الجينوم كله في وقت واحد، ولكن شرط لبرنامج خاص وحدود معدات تطبيقه 7. هنا، نحن تصف رواية فحص الأسماك، OctoChrome للأسماك، والتي يمكن تطبيقها لChromosomics، التي نحدد هنا كما في التحليل المتزامن لجميع الكروموسومات 24 الإنسان على شريحة واحدة في الدراسات الإنسانية، مثل عدم توازن الصبغيات دراسة كروموسوم واسعة (CWAS) 8. وبناء على طريقة، وتسويقها بواسطة Cytocell كما Chromoprobe نظام Multiprobe، هو جهاز OctoChrome الذي ينقسم إلى 8 مربعات، كل منها يحمل ثلاثة مختلفة اللوحة كروموسوم كامل تحقيقات (الشكل 1). وصفت مباشرة كل من تحقيقات مع 3 fluorophore بلون مختلف، والأخضر (FITC)، الحمراء (تكساس الأحمر)، والأزرق (الكومارين). ترتيب مجموعات كروموسوم على OctoChromوقد تم تصميم الجهاز الإلكتروني لتسهيل التعرف على التعديلات غير عشوائية كروموسوم الهيكلية (translocations) وجدت في سرطانات الدم الأكثر شيوعا واللمفومات، لتي سبيل المثال (9، 22)، تي (15، 17)، تي (8 و 21 )، تي (14 و 18) 9. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن التغييرات العددية (عدم توازن الصبغيات) في الصبغيات (الكروموسومات) في وقت واحد. وينقسم أيضا الشريحة قالب المقابلة إلى 8 مربعات على الذي لا بد ينتشر الطورية (الشكل 2)، ويتم وضعه على جهاز OctoChrome. تحقيقات والحمض النووي المستهدفة هي التشويه والتحريف في درجة حرارة عالية والمهجنة في غرفة رطبة، وبعد ذلك كل الكروموسومات 24 الإنسان يمكن تصور في وقت واحد. FISH OctoChrome هي تقنية واعدة للتشخيص السريري لسرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية وللكشف عن [أنيوبلويدي] في جميع الكروموسومات. وقد طبقنا هذا النهج الجديد Chromosomic في دراسة CWAS من البنزين المعرضة للعمال الصينيين 8،10.

Watch this Scientific Journal Video about Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay at JoVE.com

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

رواية مضان<em&gt; في الموقع</emيوصف&gt; تهجين (FISH) الأسلوب الذي يدرس في نفس الوقت تعديلات كروموسوم على حد سواء العددية والهيكلية، ولا سيما translocations محددة الكروموسومات المرتبطة اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية، من جميع الكروموسومات 24 الإنسان على جهاز واحد في واحد تهجين،.

Chromosomics: الكشف عن التغيرات العددية والهيكلية في جميع الكروموسومات 24 الإنسان وقت واحد باستخدام رواية الفحص FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

chromosomics-detection-numerical-structural-alterations-all-24-human

Research

JoVE Journal

Biology

18.7K Views.  University of California, Berkeley. رواية مضان في الموقع تهجين (FISH) الأسلوب الذي يدرس في نفس الوقت تعديلات كروموسوم على حد سواء العددية والهيكلية، ولا سيما translocations محددة الكروموسومات المرتبطة اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية، من جميع الكروموسومات 24 الإنسان على جهاز واحد في واحد تهج...

Video: Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

كشف اشارة المستجيب - مجمعات التكرير والتسويق لاستخدام BMP4 في الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وربط الفحص القرب

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing a biorefinery. These raw materials would constitute a new industrial platform, which is both sustainable and carbon neutral, to replace 
the current dependency on fossil fuel. The recalcitrance to deconstruction observed in lignocellulosic materials is produced by several intrinsic properties 
of plant cell walls. Crystalline cellulose is embedded in matrix polysaccharides such as xylans and arabinoxylans, and the whole structure is encased by the 
phenolic polymer lignin, that is also difficult to digest 1. In order to improve the digestibility of plant materials we need to discover the main bottlenecks 
for the saccharification of cell walls and also screen mutant and breeding populations to evaluate the variability in saccharification 2. These tasks require 
a high throughput approach and here we present an analytical platform that can perform saccharification analysis in a 96-well plate format. This platform has 
been developed to allow the screening of lignocellulose digestibility of large populations from varied plant species. We have scaled down the reaction volumes 
for gentle pretreatment, partial enzymatic hydrolysis and sugar determination, to allow large numbers to be assessed rapidly in an automated system.
This automated platform works with milligram amounts of biomass, performing ball milling under controlled conditions to reduce the plant 
materials to a standardised particle size in a reproducible manner. Once the samples are ground, the automated formatting robot dispenses specified and recorded 
amounts of material into the corresponding wells of 96 deep well plate (Figure 1). Normally, we dispense the same material into 4 wells to have 4 replicates for 
analysis. Once the plates are filled with the plant material in the desired layout, they are manually moved to a liquid handling station (Figure 2). In this 
station the samples are subjected to a mild pretreatment with either dilute acid or alkaline and incubated at temperatures of up to 90&deg;C. The pretreatment solution 
is subsequently removed and the samples are rinsed with buffer to return them to a suitable pH for hydrolysis. The samples are then incubated with an enzyme
mixture for a variable length of time at 50&deg;C. An aliquot is taken from the hydrolyzate and the reducing sugars are automatically determined by the MBTH 
colorimetric method.

A simple, rapid method for determining the saccharification potential of large numbers of plant biomass samples is described. The automated platform for this analysis involves the preparation of the plant biomass for analysis in 96 well plates and the subsequent performance of pretreatment, hydrolysis and quantification of the sugars released.

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

الكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي بواسطة الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

الكشف عن التعديلات الوراثية الجسدية في عينات الورم عن طريق التقاط اكسون وتسلسلها الموازي واسع

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

التعبير البروتين المؤتلف لعلم الأحياء الهيكلي في HEK 293F خلايا نظام التعليق: رواية ويمكن الوصول إليه المنهج

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

الكشف عن التعبير الجيني بين الخلايا في الخلايا الحية من الفئران، الإنسان ولحم الخنزير المنشأ عن طريق النانوية المسمى الإسفار

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be assessed by alkaline hydrolysis and gel electrophoresis as RNA is highly susceptible to hydrolysis in alkaline conditions. This, in combination with Southern blot analysis can be used to determine the location and strand into which the ribonucleotides have been incorporated. However, this procedure is only semi-quantitative and may not be sensitive enough to detect small changes in ribonucleotide content, although strand-specific Southern blot probing improves the sensitivity. As a measure of one of the most striking biological consequences of ribonucleotides in DNA, spontaneous mutagenesis can be analyzed using a forward mutation assay. Using appropriate reporter genes, rare mutations that results in the loss of function can be selected and overall and specific mutation rates can be measured by combining data from fluctuation experiments with DNA sequencing of the reporter gene. The fluctuation assay is applicable to examine a wide variety of mutagenic processes in specific genetic background or growth conditions.

Ribonucleotides are among the most abundant non-canonical nucleotides incorporated into the genome during eukaryotic nuclear DNA replication. If not properly removed, ribonucleotides can cause DNA damage and mutagenesis. Here, we present two experimental approaches that are used to assess the abundance of ribonucleotide incorporation into DNA and its mutagenic effects.

دراسة Ribonucleotide التأسيس: كشف حبلا على حدة Ribonucleotides في جينوم الخميرة وقياس الطفرات المستحثة Ribonucleotide

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...