We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.

1. إعداد التحقيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول أليغنوكليوتيد] فريدة متعددة في Xist ([أليغنوكليوتيد 20-30 النوكليوتيدات طول، 63-65 درجة مئوية درجة حرارة انصهار، الجدول 1) مع تعديل 5&#39;-الأمينية وتعليق في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجمع كميات متساوي المولية من [أليغنوكليوتيد مع 5&#39;-الأمينية تعديل (إجمالي 4.5 ميكروغرام) وتسمية مع أمين رد الفعل صبغة الفلورسنت التالية تعليمات الشركة المصنعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل [أليغنوكليوتيد المجمعة في 5 ميكرولتر النهائية من nuclease خالية من المياه وإضافة 3 ميكرولتر من 1 M بيكربونات الصوديوم إلى حل قليل النوكليوتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر DMSO إلى قارورة-أمين صبغ رد الفعل ودوامة لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل قليل النوكليوتيد مع صبغ رد الفعل في DMSO واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في الظلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى من قبل العمود G-25 تليها هطول الأمطار الإيثانول. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; العمود الطرد المركزي G-25 في 750 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة عازلة تخزين الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر nuclease خالية من الماء إلى الخليط وضع العلامات وردت في الخطوة 1.2.3 وتنطبق على العمود G-25. أجهزة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر nuclease خالية من الماء، و 10 ميكرولتر 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 250 ميكرولتر الإيثانول إلى التحقيق تنقيته من الخطوة 1.3.2. متجر في -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 21،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أليغنوكليوتيد] عجلت مرة واحدة مع 1 مل من الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة تعليق في 50 ميكرولتر nuclease خالية من الماء أو TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA) لتركيز النهائي من ما يقرب من 10 ميكرومتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تحقيقات قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى إلى تركيز النهائي من 250 نانومتر مع العازلة التهجين (10٪ الفورماميد، 2X SSC [300 مم كلوريد الصوديوم، و 30 ملي سيترات الصوديوم]، 2 ملغ / مل BSA، و 10٪ كبريتات ديكستران). ملاحظة: مع هذا البروتوكول FISH سريع، قليل النوكليوتيد صتم تصميم الجلباب في Xist وتستخدم بتركيز أعلى من بروتوكول FISH العادي باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد من أجل تقصير فترة حضانة لالتهجين. </li></ol> 2. الانزلاق إعداد ملاحظة: الشرائح يمكن أن تكون على استعداد لالمناعية FISH باستخدام الماوس الجذعية الجنينية (ES) أو هيئة مضغي الشكل (EB) التفريق خلايا 20 و 21 من قبل أي من تزايد بشكل مباشر على شريحة تعامل بولي يسين أو باستخدام cytospin مع التعليق الخلية. هنا، يظهر إعداد الشريحة التي cytospin. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح مستنبت في صحن 6 جيدا. يغسل مع PBS (درجة حرارة الغرفة)، ونضح بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من التربسين إلى الطبق 6-جيدا، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من المتوسط ​​وتفريق الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل المتوسطة لد بتعليق بلطف الخلايا في 2 مل PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وتمييع تعليق خلية في 4 × 10 5 خلية / مل من برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الشرائح، بطاقة مرشح وغرفة مع مقطع ووضعها في فتحات مناسبة في الدوار من cytospin. إضافة 250 ميكرولتر من كل عينة أعدت في الخطوة 2.6 في كل غرفة من وحدات تجميعها في cytospin. أجهزة الطرد المركزي في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء 3 الجرار coplin على الجليد مع 40 مل كل من الجليد الباردة PBS، CSK عازلة (10 أنابيب ملي، ودرجة الحموضة 6.8، 100 مم كلوريد الصوديوم، 300 ملي السكروز، 3 ملي MgCl 2)، وعازلة CSKT (CSK عازلة مع 0.5٪ تريتون X-100)، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من cytospin، ونقل بسرعة الشريحة في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة واحتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة إلى الجليد الباردة CSK العازلة واحتضان لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة إلى عازلة الجليد الباردة CSKT واحتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة مرة أخرى في الجليد الباردة CSK BUFفر واحتضان لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة إلى 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol> 3. المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في جرة coplin مع PBST (1X PBS مع 0.1٪ توين-20) لعدة ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد خارج الشريحة ووضعها في مربع الماصة طرف فارغة بالماء. تراكب الشريحة مع 40 ميكرولتر من عرقلة الحل (1X PBS، 1٪ BSA، 0.1٪ توين-20)، ضع بلطف ساترة، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة، وإزالة عرقلة الحل، وإضافة 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة هيستون H3K27me3 الأساسي المخفف لتركيز 1: 500 في عرقلة الحل. ضع ساترة مرة أخرى على الشريحة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: إن المانع ريبونوكلياز في عرقلة الحل قد يكون من المفيد للحفاظ على الحمض النووي الريبي في هذا RNA FISH بروتوكول عندما تستخدم الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشريحة 2 مرات في الجرار coplin مليئة PBST، لمدة 5 دقائق لكل منهما، في حين هز بلطف الغسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد ووضع الشريحة مرة أخرى إلى المربع تلميح. تراكب مع 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (1: 500) مخففة في عرقلة الحل، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام. للخطوات التالية، والحفاظ على الشريحة في الظلام في جميع الأوقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 2 مرات في coplin الجرار مع PBST كما في الخطوة 3.4. </li></ol> 4. RNA FISH مع قليل النوكليوتيد تحقيقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الدافئة مربع الماصة طرف فارغة بالماء في الجزء السفلي لمنع الشرائح من الجفاف عند 37 درجة مئوية لمدة RNA FISH في الخطوة 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد خارج الشريحة من الخطوة 3.6 و ضع الشريحة في مربع الماصة طرف مع واتإيه في الأسفل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة FISH (10٪ الفورماميد في 2X SSC) على الشريحة واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة FISH الحل غسيل، وإضافة 8 ميكرولتر من تحقيقات قليل النوكليوتيد على الشريحة ضع زلة تغطية، ونقل الشريحة إلى مربع الماصة طرف قبل تحسنت مع المياه في أسفل؛ احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 3 الجرار coplin قبل تحسنت في حمام مائي عند 37 درجة مئوية مع غسل العازلة FISH، FISH غسل عازلة مع دابي، و2X SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1-2 ساعة الحضانة لRNA FISH، وطرح الشريحة في المخزن المؤقت قبل تحسنت غسل FISH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة لبضع دقائق حتى تسقط ساترة الخروج من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشريحة مرة أخرى في غسل العازلة، وتستمر الحضانة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشريحة إلى جرة coplin آخر مع درجة حرارة ما قبل FISH غسل العازلة مع 0.5 نانوغرام / مل دابي واحتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الشريحة إلى جرة coplin أخرى مع تدفئته قبل 2X SSC واحتضان لمدة 5 ميلن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشرائح في الميل السماح عازلة المتبقية لتتدفق الشريحة. يمسح بعناية السائل الزائد ووضع الشريحة مرة أخرى إلى مربع طرف الجاف. إضافة 4 ميكرولتر من antifade مع دابي على الشريحة ووضع ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم ساترة مع طلاء الأظافر ومراقبة تحت المجهر. ويمكن تخزين الشريحة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة بضعة أشهر. </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gracefully+ageing+at+50,+X-chromosome+inactivation+becomes+a+paradigm+for+RNA+and+chromatin+control.">Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).</li><li>Gendrel, A. V., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+years+of+X-inactivation+research.">Fifty years of X-inactivation research.</a> Development. 138, 5049-5055 (2011).</li><li>Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+by+RNAs:+X-inactivation+as+a+model+for+lncRNA+function.">Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function.</a> J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).</li><li>Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+Xist+in+X+chromosome+inactivation.">Requirement for Xist in X chromosome inactivation.</a> Nature. 379, 131-137 (1996).</li><li>Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-deficient+mice+are+defective+in+dosage+compensation+but+not+spermatogenesis.">Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis.</a> Genes Dev. 11, 156-166 (1997).</li><li>Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIST+RNA+paints+the+inactive+X+chromosome+at+interphase:+evidence+for+a+novel+RNA+involved+in+nuclear/chromosome+structure.">XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure.</a> J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).</li><li>Sado, T., Brockdorff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+chromosome+silencing+by+the+long+non-coding+RNA.">Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA.</a> Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322, 750-756 (2008).</li><li>Plath, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+X+inactivation.">Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation.</a> Science. 300, 131-135 (2003).</li><li>Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+histone+h3+methylation+on+the+inactive+X+chromosome+requires+transient+recruitment+of+Eed-Enx1+polycomb+group+complexes.">Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes.</a> Dev Cell. 4, 481-495 (2003).</li><li>Gall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synthesis+of+the+genes+for+ribosomal+RNA+during+amphibian+oogenesis.">Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Katayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+transcription+in+the+mammalian+transcriptome.">Antisense transcription in the mammalian transcriptome.</a> Science. 309, 1564-1566 (2005).</li><li>Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-inactivation+intergenic+transcription+elements+that+regulate+the+probability+of+choice.">X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice.</a> Mol Cell. 11, 731-743 (2003).</li><li>Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+in+mouse+ES+cells:+histone+modifications+and+FISH.">X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).</li><li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression.">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).</li><li>Martin, G. R., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+clonal+lines+of+teratocarcinoma+cells:+formation+of+embryoid+bodies+in+vitro.">Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).</li><li>Lee, J. T., Lu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+mutagenesis+of+Tsix+leads+to+nonrandom+X+inactivation.">Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation.</a> Cell. 99, 47-57 (1999).</li><li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells.">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182, 685-698 (2009).</li><li>Raj, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+individual+endogenous+RNA+transcripts+in+situ+using+multiple+singly+labeled+probes.">Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes.</a> Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).</li><li>Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+histone+H3+modifications+as+revealed+by+a+panel+of+specific+monoclonal+antibodies.">The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies.</a> Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).</li><li>Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersection+of+the+RNA+interference+and+X-inactivation+pathways.">Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways.</a> Science. 320, 1336-1341 (2008).</li><li>Kohlmaier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosomal+memory+triggered+by+Xist+regulates+histone+methylation+in+X+inactivation.">A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation.</a> PLoS Biol. 2, 171 (2004).</li><li>Wang, K. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Molecular mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Mol Cell. 43, 904-914 (2011).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

في هذه الورقة، قدمنا ​​سريع بروتوكول المناعية FISH أن يستغرق أقل من 5 ساعة لاستكمال إعداد الشرائح، Xist RNA FISH، والمناعي للH3K27me3. وبالمقارنة مع النهج المناعية FISH العام لXist RNA الكشف، الذي يحتاج عادة الحضانة بين عشية وضحاها RNA FISH، هذا البروتوكول ليس فقط يخفف كثيرا من الوقت ال...

الثدييات X-كروموسوم تعطيل (XCI) هو استراتيجية للتعويض عن الخلل في العاشر مرتبطة جرعة الجينات بين XX XY و، حيث واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث هو transcriptionally المعطل 1. X-كروموسوم تعطيل هو نظام نموذج رائع لفترة طويلة RNA غير المشفر (lncRNA) البحوث. وينظم X-كروموسوم تعطيل من قبل lncRNAs متعددة، وتمت دراسة على نطاق واسع على مدى العقود القليلة الماضية لكشف آليات الحديث المتبادل بين lncRNAs، النسخ، هيكل الكروماتين وتنظيم النووية 2 و 3. مركز X تعطيل (XIC) تقع على الصبغي X-هو موضع الجيني معقدة تتألف من عدد من الجينات إنتاج الرنا غير الترميز 4. -X غير نشط نص معين (Xist) lncRNA في الثدييات eutherian هو واحد من هذا القبيل lncRNA التي تلعب دورا حاسما في كروموسوم X-تعطيل 5،6. النصوص Xist تحيط موقع فوالبنية شي لبدء كروموسوم X-تعطيل، وتبدو وكأنها سحابة عندما تصور باستخدام RNA FISH. ويشار إلى هذا التشكيل ب &quot;Xist الغيمة&quot; 7. منذ Xist RNA يتفاعل مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين، ويلاحظ شارك في توطين الغيوم Xist مع تعديلات جينية مختلفة لونين الصمت والنسخ القمعي خلال كروموسوم X-تعطيل 8. على سبيل المثال، يتفاعل Xist RNA مع polycomb مجمع القمعي 2 (PRC2) وهي المسؤولة عن H3K27me3 وتفضي إلى حالة لونين القمعية 9. وقوع سحابة Xist على زيان والتي تشترك في التعريب مع تعديل H3K27me3 المكثف يمثل المشهد المغاير الاختياري للشي 10،11. وتأتي التقنيات الوراثية الخلوية، مثل DNA / RNA FISH شوطا طويلا من الطريقة التقليدية باستخدام تحقيقات radiolabelled 12 إلى التقنيات الحديثة والمتقدمة مع تعزيز الحساسية والتصوير الفلورسنت باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد متعددة 13،14. FISH DNA / RNA إلى جانب المناعي وقد استخدم بشكل روتيني كأداة الخلوي لفهم تنظيم الزمانية المكانية النووية، RNA الترجمة، وهيكل الكروماتين والتعديلات. إعداد التحقيق الأكثر القياسي لRNA FISH ينطوي على استخدام البلازميد أو البكتيرية الصبغي الاصطناعي (BAC) استنساخ ووضع العلامات لاحقا إما مع الترجمة نيك أو فتيلة العشوائي 15. ومع ذلك، ما يقرب من 70٪ من الجينات في الفئران و 40٪ من الجينات في البشر تظهر تداخل الحس والعقاقير النصوص 16، وبالتالي تتطلب طريقة FISH حبلا محددة من أجل التمييز الشعور والعقاقير النصوص. في المختبر تحقيقات RNA كتب (riboprobe ) غالبا ما تستخدم لحبلا محددة RNA FISH 17،18. ومع ذلك، وهذا ينطوي إعداد استنساخ البلازميد أو منتج PCR مع T7، SP6 أو T3 المروج وriboprobes تجميع. وعلاوة على ذلك، riboprobes المستمدة من genomجيم DNA أو كدنا] غالبا ما تحتوي على مناطق غير محددة والعناصر المتكررة، مما يؤدي إلى ارتفاع الضوضاء في الخلفية. وثمة مسألة أخرى هي أن riboprobes، والتي هي بضع مئات من النيوكليوتيدات في الطول واحتواء fluorophores متعددة، لا يمكن أن تخترق بفاعلية في النواة. للتحايل على هذا، تم وضع عدة تحقيقات قليل النوكليوتيد أقصر المسمى مع fluorophore واحد في نهاية التي لديها حساسية جيدة، وقوة الإشارة موحدة، وسهولة تنقية ومعالجة 14. وبالإضافة إلى ذلك، [أليغنوكليوتيد DNA عادة ما تكون أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي. طبقنا استراتيجية مماثلة باستخدام [أليغنوكليوتيد في Xist RNA FISH 19 مع المناعي لفهم ديناميات جينية من شي الناجمة عن Xist lncRNA خلال عملية كروموسوم X-تعطيل. يصف هذا البروتوكول خلق تحقيقات قليل النوكليوتيد والإعداد المناسب من الخلايا، وكذلك الاستفادة من RNA المناعي وFISH. Xist RNA FISH باستخدام oligonucle متعددةotides هو نهج فعال من حيث التكلفة في المدى الطويل إذا يتم تنفيذ Xist RNA FISH بشكل روتيني في مختبر واحد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد lncRNAs في الخلايا في حين رسم في وقت واحد شارك في التعريب مع تعديلات جينية أو عوامل. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هي القدرة على تعديله بسهولة لتناسب مصالح المرء البحوث.

<table><tbody><tr><td>oligonucleotides with 5&amp;rsquo;-amino modification</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Reactive Dye</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 columns</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer)</td><td>Roche</td><td>10715859103</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3K27me3 antibody</td><td>Active Motif</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagent</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

quick fluorescent in situ hybridization protocol for xist rna combined with immunofluorescence of histone modification in x-chromosome inactivation

الجمع بين RNA فلوري التهجين في الموقع (FISH) مع المناعي (المناعية FISH) في يخلق التقنية التي يمكن استخدامها على مستوى خلية واحدة للكشف عن ديناميات المكانية للتوطين RNA مع البصيرة في وقت واحد في توطين البروتينات أو تعديلات جينية وغيرها من التفاصيل والتي يمكن التي أبرزها المناعي. X-كروموسوم تعطيل هو نموذج لفترة طويلة غير المشفر RNA (lncRNA) بوساطة إسكات الجينات. -X غير نشط نص معين (Xist) تراكم lncRNA (وتسمى سحابة Xist) على واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث الثدييات هو خطوة حاسمة لبدء كروموسوم X-تعطيل. Xist RNA يتفاعل مباشرة أو غير مباشرة مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين ويقدم المناظر الطبيعية جينية مميزة لغير نشط X-كروموسوم (شي). واحد السمة المميزة جينية معروف من شي هي هيستون H3 ثلاثي ميثيل يسين 27 (H3K27me3) التعديل. هنا، نحن تصف المناعية FISH بسيطة وسريعةبروتوكول للكشف عن Xist RNA باستخدام RNA FISH مع تحقيقات قليل النوكليوتيد متعددة إلى جانب المناعي من H3K27me3 لدراسة توطين Xist RNA وتعديلات جينية المرتبطة بها. استخدام نتائج تحقيقات قليل النوكليوتيد في فترة حضانة أقصر والكشف عن أكثر حساسية من Xist RNA مقارنة في المختبر كتب تحقيقات RNA (riboprobes). يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لفهم ديناميات lncRNAs وما يرتبط بها من تعديله جينية، هيكل الكروماتين، والتنظيم النووية وتنظيم النسخي.

وتظهر الصور التمثيلية للسريع المناعية FISH في الشكل 1A. تم الكشف عن التعاون توطين Xist RNA السحابية وH3K27me3 إشارة على زيان في تمييز الخلايا الإناث. في اليوم 12 على التمايز، وكان أكثر من 90٪ من خلايا EB سحابة Xist (الشكل 1B). تحقيقات قليل النوكليوتيد قصيرة اخترقت بك?...

Watch this Scientific Journal Video about Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation at JoVE.co

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

خيارات نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

quick-fluorescent-situ-hybridization-protocol-for-xist-rna-combined

Research

JoVE Journal

Biology

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

13.9K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level. 

Video: Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Developmental Biology

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including genetic disorders, of which chromosomal abnormalities are the most common. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a well-known and frequently used method to detect chromosomal aberrations in humans. FISH is mainly used for the analysis of chromosomal abnormalities in the spermatozoa of males with numerical or structural chromosomal aberrations. Furthermore, this technique is also frequently applied in females to detect X chromosomal aberrations that are known to cause ovarian dysgenesis. However, information on the X chromosomal content of ovarian cells from females with X chromosomal aberrations in lymphocytes and/or buccal cells is still lacking.
The aim of this study is to advance basic research regarding X chromosomal aberrations in females, by presenting two methods based on FISH to identify the X chromosomal content of ovarian cells. First, a method is described to determine the X chromosomal content of isolated ovarian cells (oocytes, granulosa cells, and stromal cells) in non-grafted ovarian cortex tissue from females with X chromosomal aberrations. The second method is directed at evaluating the effect of chromosomal aberrations on folliculogenesis by determining the X chromosomal content of ovarian cells of newly formed secondary and antral follicles in ovarian tissue, from females with X chromosomal aberrations after long-term grafting into immunocompromised mice. Both methods could be helpful in future research to gain insight into the reproductive potential of females with X chromosomal aberrations.

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

This article presents two methods based on fluorescence in situ hybridization to determine the X chromosomal content of ovarian cells in non-grafted and grafted ovarian cortex tissue from females with X chromosomal aberrations.

استكشاف انحرافات كروموسومات X في خلايا المبيض باستخدام التهجين الفلوري في الموقع

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

Genetics

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can be hampered by the lack of specific primary or secondary antibodies for immunostaining. Here we describe a protocol to detect the expression of three different genes in the same brain section using double fluorescence in situ hybridization with two gene-specific probes followed by immunostaining with an antibody of high specificity directed against the protein encoded by a third gene. The Aspartoacyclase (ASPA) gene, mutations of which can lead to a rare human white matter disease - Canavan disease - is thought to be expressed in oligodendrocytes and microglia but not in astrocytes and neurons. However, the precise expression pattern of ASPA in the brain has yet to be established. This protocol has allowed us to determine that ASPA is expressed in a subset of mature oligodendrocytes and it can be generally applied to a wide range of gene expression pattern studies.

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.

الجمع بين نقرا الإسفار<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين مع Immunolabelling للكشف عن التعبير عن ثلاثة جينات في أقسام الدماغ ماوس

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

Neuroscience

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Immunology and Infection

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون<em&gt; في الوضع الطبيعي</em&gt; التهجين (FISH) لدراسة كروموسوم X التعطيل في المتباينة أنثى الفأر الخلايا الجذعية الجنينية

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

خيارات نيون

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة

استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

الزرد الجامع جبل الرفيع قرار مزدوج نيون في الموقع التهجين

استكشاف انحرافات كروموسومات X في خلايا المبيض باستخدام التهجين الفلوري في الموقع

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

الجمع بين نقرا الإسفار

الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

كله جبل RNA نيون

الحمض النووي RNA-مجتمعة نيون

طريقة بسيطة لDNA الإسفار