فإن الكتاب أود أن أنوه هارلان GWU زمالة لدعم المنح وPaaqua لوثر رايس GWU زمالة لدعم هيرولد منى. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة MCB-1121711.

1. إعداد وسائل الإعلام أدوات الثقافة، وأطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شحذ 4 ملقط باستخدام الفيلم جلخ الألومينا. القيام بذلك تحت المجهر تشريح لرصد حجم الإكراميات. زوج واحد من الملقط بمثابة احتياطية في حالة تلف معلومات سرية أثناء العملية. الأوتوكلاف جميع ملقط أربعة وتخزينها في وعاء معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل كل 500 مل من مستنبت 0.1X 1.0X و(إما لمارك معدلة قارعو الأجراس [MMR] أو تعديل لبارت المالحة [MBS]؛ صفات في 15) وفلتر تعقيم. نحن نستخدم بشكل روتيني MBS (1X = 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملي بوكل، 0.7 ملي CaCl 2، 1 ملم MgSO 4، 5 مم HEPES [الرقم الهيدروجيني 7،8]، 2.5 ملم NaHCO 3). المحل في 14-18 درجة مئوية لمدة شهور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل الاغاروز 2٪ في المتوسط ​​الثقافة (2 ز الكهربائي الاغاروز في الصف 100 مل مستنبت 1X في زجاجة المسمار CAP). الأوتوكلاف حل الاغاروز. يمكن تخزين هذا في C ° 4 أشهر، وميكرووافيد لتسييل عند الحاجة الاغاروز القادمة عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن السائل هو الاغاروز، صب حوالي 0.5 مل على الجزء السفلي من كل بئر من لوحة العقيمة الثقافة 24 أيضا. وهذا سيمنع إإكسبلنتس من التمسك البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن السائل هو الاغاروز، صب حوالي 2-3 مل على القعر من سنتين إلى ثلاث أطباق بتري 60 مم، وعباب بلطف للتأكد من تغطية القاع. وهذه بمثابة أطباق تشريح والأجنة الاغاروز يمنع من التمسك البلاستيك مرة واحدة تتم إزالة الأغشية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الاغاروز قد بردت وتصلبت، اللهب غيض من ماصة باستور 6 &quot;حتى يذوب في الكرة، ولمس طفيفة على سطح الاغاروز في كل بئر من لوحة الثقافة، وهذا سيخلق الاكتئاب الضحلة التي في سيتم وضع يزدرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كل بئر من لوحة الثقافة مع 1X ثقافة المتوسط ​​العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الاغاروز قد بردت وتصلبت، وملء الطبق مع تشريح ثقافة المتوسط ​​المخفف (0.1X 0.1X MMR أو MBS) لتسهيل فصل قسيم أرومي. </lط&gt; </ol> 2. اختيار الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيض المخصب وإزالة هلام المعاطف وفقا لبروتوكولات المعيار 15. نقلها إلى ثقافة المتوسط ​​0.5X في طبق بتري 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل إلى مرحلة الأجنة 2-الخلية، فرز تلك التي ثلم الانقسام يشطر 1 المنطقة المصطبغة طفيفة في نصف الكرة الحيواني (الشكل 1) في طبق منفصل. وستكون هذه الجهات المانحة للإإكسبلنتس. الحفاظ على ما تبقى من الخلايا 2-الأجنة في طبق منفصل بجانب الأجنة المانحة في جميع أنحاء الداخلي لتكون بمثابة ضوابط الأخوة لاستضافة إإكسبلنتس. </li></ol> 3. إعداد إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة 5-10 في طبق تشريح، ولكن تعمل فقط على جنين واحد في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين أولا حتى يمكن رؤية الغشاء المحي شفافة؛ وفصلها بمسافة واضحة (الحيز المحيط بالمح) فوق سطح القطب الحيواني من الجنين. باستخدام القوة شحذفرع فلسطين في يد واحدة subdominant (اليد اليسرى إذا سلم حق واحد)، فهم الغشاء المحي فوق المحيط بالمح الفضاء. باستخدام ملقط تركيزها في جهة أخرى، فهم على مقربة من غشاء ملقط غيض الأولى، وسحب بلطف في اتجاهين معاكسين لتقشير الغشاء بعيدا. جعل فهم الأولي على مسافة من الخلية التي سيتم تشريح، بحيث لا يتم تلف الخلية المستهدفة خلال إزالة الغشاء. يمكن للمرء أن يقول أنه تمت إزالة الغشاء لأن الجنين سوف تتسطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتزاع واحدة الزنزانة المجاورة مع ملقط في اليد subdominant واستخدام هذه الخلية بأنها &quot;مؤشر&quot; بحيث لا يتم الخلية إلى أن تشريح لمست مباشرة. مع ملقط في ناحية أخرى، وسحب بلطف الخلايا المتبقية المجاورة بعيدا عن قسيم أرومي المطلوب. في حال استهدفت خلايا خط الوسط، التي تتقاسم نفس المصير، ويمكن إزالتها معا كزوج. وأخيرا، تشريح بعيدا &quot;مقبض&quot; الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط قسيم أرومي (أو الزوج قسيم أرومي)، مع العقيمةوالزجاج ماصة باستور، وتجنب فقاعات الهواء والشفط الزائد. يمكن أن تكون ماصة النار مصقول لإزالة الحواف الحادة التي يمكن أن تلحق الضرر الخلية، ولكن لم نفعل هذا بشكل روتيني. وضع غيض من ماصة باستور تحت سطح ثقافة المتوسط ​​في بئر الطبق الثقافة يزدرع، وطرد بلطف قسيم أرومي. ينبغي أن ينزلق الى الكساد الضحلة عن طريق الجاذبية. ويمكن الجمع بين قسيم أرومي نفسه من أكثر من جنين واحد إلى واحد يزدرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء مع الأجنة المتبقية في طبق تشريح، واحدة تلو الأخرى. بعد حوالي 10 الأجنة، سوف تملأ طبق تشريح بالحطام الخلوي. وعندما يحدث هذا، قم بالتغيير إلى طبق تشريح الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء من جميع التشريح، تأكد من أن إإكسبلنتس هي في المنخفضات الضحلة. إن لم يكن، يمكن أن يدفع برفق في الاكتئاب مع حلقة الشعر الذي تم تعقيمها في الايثانول 70٪ والهواء المجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نحو ساعة من تشريح الماضي، إزالة الحطام surrounding في إإكسبلنتس تلتئم مع معقمة، ماصة باستور الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة لوحة من إإكسبلنتس في 14-20 ° C بجانب طبق بتري تحتوي على الأخوة والأجنة السيطرة. سوف الأجنة الأخوة تشير إلى مرحلة من مراحل تطور إإكسبلنتس قسيم أرومي. </li></ol> 4. حصاد إإكسبلنتس لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد إإكسبلنتس عندما تصل إلى مرحلة الأشقاء المطلوب التنموية. هذه إإكسبلنتس البقاء على قيد الحياة بشكل جيد حتى وإن كانت بعض الخلايا تتفكك. ولذلك، إذا كان هناك كتلة غائم في الثقافة جيدا، واستكشاف مع حلقة أو ملقط شعر لتحديد ما إذا دفن يزدرع صحية داخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط إإكسبلنتس في حجم صغير من محلول الثقافة مع ماصة باستور الزجاج، وطرد منهم بلطف إلى المخزن المؤقت مثبت أو تحلل المناسبة لفحص تجرى. </li></ol>

<ol>
	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li><li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+(Xenopus+laevis)+blastomeres.">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus.">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li><li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways.">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li><li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لزراعة ناجحة لblastomeres الفردية هي: 1) تحديد بشكل صحيح قسيم أرومي المصالح؛ 2) الحفاظ على معقمة، والثقافة الصحية؛ 3) خلايا تشريح في الجزء الصحيح من دورة الخلية، و4) تطوير دليل الضرورية البراعة لمنع الضرر خلال تشريح ونقل إلى الثقافة أيضا. <p class="...

وقد استخدمت على نطاق واسع المورق القيطم الأجنة للتعرف على الآليات التي الخلايا الجنينية الحصول على مصائرهم محددة لبيضها هي كبيرة بما يكفي للسماح النهج المجهرية. بالإضافة إلى ذلك، فإنها تضع خارجيا دون الحاجة للمكملات الغذائية للثقافة المتوسط ​​لأن كل خلية تحتوي على إمدادات الغنية داخل الخلايا الصفائح الدموية صفار التي توفر مخزن الطاقة الذاتية. رصيدا هاما لدراسة الآليات التي يتم تحديد مصير الخلية هي مجموعة شاملة من خرائط مصير blastomeres مرحلة الانقسام (من 2 - من خلال 32-الخلية مراحل) 1، 2، 3، 4، 5، 6. تم بناء هذه الخرائط من قبل microinjecting جزيء كشف في قسيم أرومي، واحدة للتحديد ورصد في وقت لاحق في التنمية التي يتم ملؤها من قبل الأنسجة ذرية المسمى. خرائط مصير يتفق ممكنة لأنه لا يمكن للمحاور الأساسية للأجنة التي تم تحديدها بشكل صحيح في كثير من امبرينظام التشغيل. أولا، في جميع الأجنة النوع البري نصف الكرة الحيوان مصطبغة، في حين أن نصف الكرة نباتية ليست كذلك. ثانيا، دخول الحيوانات المنوية في الإخصاب يسبب انكماش للحيوان تصبغ نصف الكرة نحو الجانب البطني في المستقبل؛ في الأجنة العديد من الفرق تصبغ بالتالي يمكن استخدامها للتمييز بين الجانبين الظهرية والبطنية. ثالثا، ثلم الانقسام يقارب 1 يمكن استخدام الطائرة منتصف السهمي في معظم الأجنة، وبالتالي لتحديد الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين. الخرائط مصير تعتمد أيضا على حقيقة أن البيض المخصب بشكل طبيعي في كثير من الأحيان يلتصق في أنماط منتظمة التي تجعل كل قسيم أرومي التعرف عبر عدد كبير من الأجنة. بينما هناك تفاوتا داخل وبين براثن البيض والانقسام بشأن تصبغ أنماط، وذلك باستخدام إجراءات الاختيار وصف يسمح هنا الكشف عن هويته الخلايا مع مصائر المقررة بدقة حوالي 90٪. يمكن أن مصير الخلايا ردعالملغومة خلال مرحلة التطور الجنيني من عدة آليات. العوامل الذاتية، مثل mRNAs وحشوية ورثت تفاضلي أو البروتينات، والمساهمة في العديد من جوانب الزخرفة في وقت مبكر. على سبيل المثال، mRNAs والأمهات محددة تحديد الخلايا التي ستسهم في خط الجرثومية، تصبح الأديم الباطن، أو المساهمة في محور الجسم الظهرية (في تاريخ 7). عوامل خارجي المقدمة محليا من قبل الخلايا المجاورة أو أكثر بعيدة من مركز إشارات الجنينية، هي المسؤولة عن إحداث أنواع الأنسجة محددة والزخرفة تقريبا كل نظام الجهاز. أمثلة على مراكز يشير تشمل المنظم / عقدة في المعيدة أن الحث على الأديم الظاهر العصبي وأنماط الطبقة الجرثومية الوسطى، ومنطقة استقطاب نشاط أنماط المحور الأمامي الخلفي من برعم الطرف. على الرغم من أن خرائط تحديد مصير السلائف من مختلف الأجهزة والكشف عن المسار التنموي الذي اتخذته أولادهم في الجنين الطبيعي، فإنها لا يمكن التمييز بين الذاتيةوالتأثيرات الخارجية على تلك الخلايا. كما أنها لا تكشف عن الإمكانات الكاملة التنموية للخلية، التي تفرق أحفاد في بيئة معقدة من الإشارات الجنين. يمكن نهجين التجريبية اختبار ما إذا كان يتم تحديد مصير الخلية من العوامل الجوهرية أو يتأثر لاحقا من قبل العوامل الخارجية: 1) زرع الخلية إلى موقع الرواية في الجنين، أو 2) إزالة الخلايا من الجنين تليها الثقافة في غياب إشارات خارجية. وكانت كلا النهجين التجريبية الممكنة في القيطم لأن الخلايا هي كبيرة بما يكفي ليمكن فصلها يدويا. على سبيل المثال، قد حذفت العديد من الدراسات الخلايا من أجنة واحدة (لتغيير خلية خلية التفاعلات) أو الخلايا المزروعة إلى مواقع جديدة في الأجنة المضيفة لاختبار التغييرات مصير (مراجعة في 7 و 8 و 9). وبالإضافة إلى ذلك، فإن النهج الثاني من شرحا أعداد صغيرة من الخلايا من مناطق مختلفة من الجنين أناn لثقافة لتوضيح التفاعلات الأنسجة الاستقرائي في غياب عوامل خارجية ممكن لأن تمتلئ خلايا الجنين القيطم مع تخزين المواد الغذائية داخل الخلايا والصفائح الدموية صفار. ولذلك، يمكن تربيتها أنها لبضعة أيام في المتوسط ​​دون تعريف الملح مكملات الغذائية أو عامل نمو ثقافة المتوسط. وقد استخدمنا هذا النهج لإظهار أن blastomeres الحيوان الظهرية لديها قدرة مستقلة لإنتاج الأنسجة العصبية أرومية متوسطة والظهرية بسبب mRNAs ورثت أمهات 10 و 11، وغيرها أظهرت أن مواصفات الأديم المتوسط ​​من 32 خلية blastomeres تعتمد على كل من المعلومات الجوهرية وخارجي 12 . ميزة زراعة الخلايا كما هو إإكسبلنتس التي يمكن أيضا أن تستكمل المتوسطة مع عوامل محددة لتحديد أي إشارة الخلية الى خلية الاتصال مسار قد تؤثر على مصير الخلية explanted 12 و 13 و 14. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن حقن العلاقات العامة قسيم أروميIOR للثقافة مع مرنا لجين لأكثر من صريحة، أو مع مضاد للاحساس [أليغنوكليوتيد] لمنع ترجمة mRNAs والمحلية. يمكن لهذه، وزيادة والخسائر من الوظائف التحليلات التي تتطلب تحديد جزيئات لمصير أعرب مستقل. لتحليل مصير يزدرع، يمكن إجراء تحديد أنواع معينة من الخلايا عن طريق التعبير الجيني القياسي (على سبيل المثال، في الموقع التهجين، RT-PCR) والمقايسات immunocytochemical. هذا البروتوكول يوفر بسيطة، لكنها قوية، وسيلة للتمييز بين آليات الجوهرية وخارجي التي تنظم كيفية خلية جنينية تطور الى أنسجة معينة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> جلخ فيلم الألومينا </td><td> توماس العلمية </td><td> # 6775E-38 </td><td> بالطبع (12 ميكرون)، لإجراء إصلاحات كبيرة من النصائح ملقط </td></tr><tr><td> جلخ فيلم الألومينا </td><td> توماس العلمية </td><td> # 6775E-46 </td><td> متوسطة (3 ميكرون)، لشحذ غرامة من النصائح ملقط </td></tr><tr><td> جلخ فيلم الألومينا </td><td> توماس العلمية </td><td> # 6775E-54 </td><td> غرامة (0.3 ميكرومتر)، لتلميع نصائح من ملقط </td></tr><tr><td> ملقط: دومون، Dumoxel البيولوجيا # 5 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> # 11252-30 </td><td> هذه لديها نصائح الغرامة التي لا تحتاج شحذ عند شرائها الأولى. تآكل مقاومة حتى يتمكنوا منيمكن تعقيمها. </td></tr><tr><td> جنتاميسين الحل </td><td> سيجما </td><td> G1397 </td><td> إضافة إلى متوسطة على نفس يوم استخدام </td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

خرائط مصير، التي شيدت من النسب تتبع كافة الخلايا من الجنين، التي تكشف الأنسجة ينزل من كل خلية من خلايا الجنين. على الرغم من أن مصير خرائط مفيدة جدا لتحديد السلائف من جهاز لتوضيح والمسار التنموي الذي الخلايا سليل ملء هذا الجهاز في الجنين الطبيعي، فإنها لا توضح الإمكانات الكاملة التنموية للخلية السلائف أو تحديد الآليات التي يتم تحديد مصيرها. لاختبار التزام مصير الخلية، واحدة يقارن مرجع الخلية العادية من أصل أفريقي في الجنين سليمة (خريطة مصير) مع الآراء التي أعرب بعد التلاعب التجريبية. ومصير الخلية ثابتة (الملتزم) بغض النظر عن البيئة المحيطة الخلوية، أم أنها تتأثر بعوامل خارجية المقدمة من جيرانها؟ باستخدام خرائط شاملة مصير الجنين القيطم، ونحن تصف كيفية تحديد وعزل ودعا ثقافة الانقسام المرحلة السلائف واحد، الأرومةمرس. هذا النهج يسمح احد لتقييم ما إذا كانت تلتزم هذه الخلايا في وقت مبكر لمصير يكتسبون في بيئتها الطبيعية في الجنين سليمة، يتطلب التفاعل مع الخلايا المجاورة لها، أو يمكن أن تتأثر للتعبير عن مصائر بديلة إذا تعرضت إلى أنواع أخرى من الإشارات.

قدرة هذا الاختبار إلى تقييم دقيق لإمكانات النمو للخلية يعتمد على تشريح خارج قسيم أرومي الصحيح يعتمد على مصير الخرائط 1، 2، 3، 4، 5، 6. لذا، فمن الأهمية بمكان اختيار الأجنة مع نمط تصبغ الصحيح في المرحلة 2-الخلية، كما هو موضح في الشكل (1)، التي تتوافق مع أنماط ...

Watch this Scientific Journal Video about Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development at JoVE.com

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

ويمكن أن يتأثر مصير خلية جنينية عن طريق الجزيئات الفردية الموروثة و / أو عن طريق إشارات من الخلايا المجاورة. استخدام الخرائط مصير الجنين مرحلة الانقسام القيطم، يمكن تحديد blastomeres واحدة للثقافة في عزلة لتقييم مساهمات جزيئات الخلية الموروثة مقابل خلية التفاعلات.

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

blastomere-explants-to-test-for-cell-fate-commitment-during-embryonic

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

15.2K Views.  The George Washington University. ويمكن أن يتأثر مصير خلية جنينية عن طريق الجزيئات الفردية الموروثة و / أو عن طريق إشارات من الخلايا المجاورة. استخدام الخرائط مصير الجنين مرحلة الانقسام القيطم، يمكن تحديد blastomeres واحدة للثقافة في عزلة لتقييم مساهمات جزيئات الخلية الموروثة مقابل خلية التفاعلات.

Video: Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Growth Factor-Coated Bead Placement on Dorsal Forebrain Explants

This video demonstrates two methods for preparing and placing beads, which have been coated with growth factor, on explants of the developing cerebral cortex. These beads can be used to induce spatially restricted gene expression on developing neural tissue such as forebrain explants. Methods are given for using both Affi-Gel beads and heparin acryllic beads.

عامل النمو المغلفه الموضع الخرزة على Explants الدماغ المقدم الظهرية

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Isacson أوله : تطوير علاجات جديدة لمرض باركنسون

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be  fed  every day by performing a complete medium change to replenish lost nutrients and to keep the cultures free of unwanted differentiation factors. Although a small amount of differentiation is normal and expected in stem cell cultures, the culture should be routinely cleaned up by manually removing, or "picking" differentiated areas. Identifying and removing excess differentiation from hES cell cultures are essential techniques in the maintenance of a healthy population of cells.

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells

This protocol demonstrates how to maintain healthy, undifferentiated human embryonic stem (ES) cells.

الثقافة والمحافظة على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells from a frozen stock have become important procedures performed in routine hES cell culture. Since hES cells are very sensitive to the stresses of freezing and thawing, special care must taken. Here we demonstrate the proper technique for rapidly thawing hES cells from liquid nitrogen stocks, plating them on mouse embryonic feeder cells, and slowly freezing them for long-term storage.

تجميد والذوبان الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

تتبع الخلية عن طريق البروتينات Photoconvertible خلال التنمية اسماك الزرد

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video