حتى الأجنة المبكرة جدا تحتوي على العديد من جزيئات الإشارات المختلفة ، مما قد يجعل من الصعب تمييز الوظيفة الكاملة لأي إشارة جنينية فردية. من خلال عزل الخلايا عن مراكز الإشارات الذاتية ، تمكن هذه النباتات الخارجية الباحثين من فحص دور جزيء إشارات معين في عزلة نسبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا قادرون على تلخيص التوقيت الجنيني وحركات الخلايا وأنماط التعبير الجيني داخل نظام الجسم الحي السابق المبسط دون الوقت أو الجهد اللازم للحفاظ على الخلايا الجذعية في الثقافة.
ابدأ بقطع النباتات من الأجنة غير المصابة أولا. إذا كان explants توسيع الثقافة، ثم تم إجراء خفض على مقربة من صفار. تبدأ عن طريق ملء إبرة شعرية زجاجية سحبت مع الجيش الملكي النيبالي.
ضع الإبرة المملوءة في متلاعب صغير وكسر طرف الإبرة بالملقط. معايرة حجم الحقن باستخدام ميكرومتر المرحلة مع قطرة من الزيت المعدني، وضبط وقت الحقن والضغط على حاقن هوائي لتحقيق بولوس من الحجم المطلوب. إبقاء طرف إبرة الجيش الملكي النيبالي مغمورة في الزيت حتى تصبح جاهزة للحقن.
قم بتحميل الأجنة في لوحة الحقن باستخدام ماصة باستور ومضخة ماصة، ثم استخدم إصبعا قفازا للضغط على البيض في الأحواض برفق. حقن 10 picograms ndr2 الجيش الملكي النيبالي في صفار أجنة خلية واحدة حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الأجنة أو حتى تبدأ الأجنة لتقسيم. استخدم تيارا لطيفا من ماء البيض من زجاجة ضغط لغسل الأجنة من لوحة الحقن إلى طبق بيتري المسمى.
ضع الأجنة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة الخلية 128. إزالة البويضات غير المخصبة والأجنة الميتة من الطبق. بمجرد وصول الأجنة إلى مرحلة الخلية 128 ، ضعها في أطباق بيتري الزجاجية المسماة ، وديكنت أكبر قدر ممكن من ماء البيض منها.
تسمية الزجاج بلورة الأطباق مع شريط مختبر المقابلة لأسماء طبق صغير، وملء ثلثي الطريق مع ماء البيض. ضع هذه الأطباق بجانب مجهر التشريح لسهولة الوصول السريع. إضافة ملليلتر واحد من 20 ملليغرام لكل سهم بروناز ملليلتر، إذابة على الجليد إلى 15 ملليلتر من محلول 3X دانيو في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
إضافة ما لا يقل عن خمسة ملليلتر من محلول البروناز إلى كل طبق بيتري الزجاج التي تحتوي على الأجنة. تهييج الأطباق الزجاجية في حركة دائرية ، ورصد التقدم المحرز في dechorionation باستمرار تحت المجهر تشريح. بمجرد أن تبدأ الكوريونات في التجاعيد ويخرج جنين إلى جنينين من المشيمات الخاصة بهم ، قم بغمر طبق بيتري الزجاجي الذي يحتوي على البروناز والأجنة في طبق تبلور الزجاج المقابل الذي يحتوي على ماء البيض.
غسل الأجنة dechorionation ثلاث مرات مع ماء البيض وdecant ماء البيض من الطبق. قم بإجراء الغسيل الثالث والأخير مع حل 0.3X Danieau. قم بتغطية الأجنة المتشترية بغطاء طبق بيتري، وأعيدها إلى الحاضنة عند 28.5 درجة مئوية حتى وصلت إلى مرحلة ال 256 خلية.
ملء طبق بيتري المغلفة agarose مع حل 3X دانيو. بمجرد أن تكون الأجنة في مرحلة 256 خلية ، قم بنقلها إلى لوحة الآجروز المغلفة التي تحتوي على محلول 3X Danieau ، واصطفها على طول وسط الطبق. استخدام زوج واحد من ملقط، عقدت مغلقة لتحقيق الاستقرار في الجنين، واستخدام الآخر لقطع من خلال blastoderm.
لقطع، والضغط بلطف على خلايا blastoderm مع زوج واحد من ملقط، ثم اتخاذ ملقط استقرار وتشغيلها على طول ملقط أخرى لشريحة في منتصف الطريق تقريبا عبر blastoderm. تدوير الجنين، ووضع ملقط في قطع القائمة ومن ثم قطع الكيسات المتبقية متعامدة إلى القطع الأول. الحفاظ على explants في حل 3X دانيو لمدة خمس دقائق على الأقل للشفاء، ومن ثم نقلها إلى بئر agarose المغلفة من لوحة من ستة آبار مليئة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام explant.
ضع لوحات الثقافة المضروبة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى النقطة الزمنية أو المرحلة المطلوبة. لقطع explants chimeric، استخدم طبق مع agarose مصبوب في 12 آبار ضحلة صغيرة باستخدام حبات الزجاج ملليمتر واحد. ملء لوحة مع حل 3X دانيو.
الاستعداد عن طريق إضافة 12 جنينا من النمط الجيني واحد أو شرط إلى الجانب الأيسر من لوحة، و 12 الأجنة من النمط الجيني الأخرى مشروطة إلى الجانب الأيمن من لوحة. نقل جنين واحد من كل حالة إلى مركز اللوحة بالقرب من أحد الآبار ال 12. باستخدام ملقط، وقطع explant من كل جنين كما هو موضح لنباتات الجنين واحد.
اضغط بسرعة على حواف قطع من اثنين من explants معا داخل البئر الضحلة باستخدام ملقط للسماح للنصفين للشفاء معا في explant واحد. استمر مع الآبار ال 12 المتبقية داخل اللوحة. بمجرد شفاء النباتات السابقة ، قم بنقلها إلى بئر الآغاروز المغلفة بلوحة من ستة آبار مليئة بأربعة ملليلترات من الوسائط المصفية.
كرر حتى يتم تحقيق العدد المطلوب من النباتات السابقة. النباتات المستزرعة في حاضنة 28.5 درجة مئوية حتى الأجنة الشقيقة سليمة وصلت إلى المرحلة المطلوبة. ظلت النباتات الملحقة للتحكم المقطوعة من الأجنة البرية غير المصابة أو تلك التي تم حقنها ب 50 صورة من الحمض النووي الريبي لترميز البروتين الفلوري الأخضر مدورة طوال فترة الثقافة ، وفشلت في التعبير عن علامات mesoderm أو endoderm أو neuroectoderm.
أصبحت النباتات المقطوعة من الأجنة التي تم حقنها ب 10 بيكوجرامات من ndr2 mRNA ممدودة للغاية بعد ثماني إلى تسع ساعات في الثقافة. وكشف التصوير الحي الفاصل زمنيا لهذه النباتات الخارجية عن طريق المجهر التبايني التفاضلي المتدخل أن الملحقات تبدأ في أو حوالي ثماني ساعات بعد الإخصاب. أظهرت النباتات من الأجنة التي تم حقنها ب 10 بيكوجرامات من ndr2 تعبيرا قويا عن علامات mesoderm ، tbxta ، noto ، tbx16 ، وعلامة neuroectoderm sox2.
من المهم جدا لخفض explants أعلى بكثير من الهامش الجنيني. وإلا فإن الطائرات الخارجية ستحتوي على إشارات داخلية من الهامش ولن تكون ساذجة. في هذه الطريقة، استخدمت النباتات السابقة لمعالجة دور الإشارات العقدية في مورفوجينيسيس gastrulation.
في المستقبل، يمكن للباحثين الآخرين استخدام هذا النهج لاختبار دور جزيئات الإشارات الإضافية، على سبيل المثال، في أي عدد من العمليات التنموية.
