Name: blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
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著者はモナヘロルドのサポートのためのPaaquaグラントとGWUルーサーライスフェローシップのサポートのためGWUハーラン·フェローシップを承認したいと思います。この作品は、全米科学財団助成MCB-1121711によってサポートされていました。

1。器具、培地や料理の準備<ol><li>アルミナ研磨フィルムを使用して4鉗子を強めています。チップサイズを監視するために解剖顕微鏡下でこれを行います。先端が処置中に損傷している場合には鉗子1組のバックアップとして機能します。すべての4つの鉗子をオートクレーブ滅菌した容器に保管してください。 </li><li> （; 15のレシピどちらMarcの修正リンガー[MMR]または改変バルトの生理食塩水[MBS]）とフィルター滅菌500ミリリットル0.1Xと1.0X培地のそれぞれを確認します。我々は日常的にMBSを（; 1のKCl、0.7 mMのCaCl 2、1mMののMgSO 4、5mMのHEPES [pHが7.8]、2.5 mMのNaHCO 3を 1X = 88 mMのNaCl）を使用します。ヶ月間の14から18℃で保存する。 </li><li>培養液中の2％アガロース溶液（スクリューキャップのガラスボトルで100ミリリットル1X培地で2グラム電気泳動グレードアガロース）を作る。アガロースを溶解するためにオートクレーブ。これは、月間4℃で保存し、それが次の必要なときにアガロースを液化するために電子レンジにすることができます。 </li><li>アガロースは液体ですが、滅菌24穴培養プレートの各ウェルの底に約0.5ミリリットルを注ぐ。これはプラスチックに付着する外植片を防ぐことができます。 </li><li>アガロースは液体ですが、二から三60ミリメートルペトリ皿の底に約2-3ミリリットルを注ぎ、そして渦巻きは優しく底が覆われていることを確認する。これらは、解剖皿となるとその膜が除去された後、アガロースは、プラスチックに付着胚を防ぎます。 </li><li>アガロースを冷却し、硬化、火炎6 &quot;パスツールピペットの先端を、それがボールに溶けるまで、軽く培養プレートの各ウェルにおけるアガロースの表面に接触させてください。これは、先の浅いうつ病が作成されたとき植が配置されます。 </li><li> 1X無菌培養培地で培養プレートの各ウェルを埋める。 </li><li>アガロースが冷却し、硬化したときに、割球分離を容易にするために希釈された培養液（0.1X MMRまたは0.1X MBS）と解剖皿を埋める。 </lI&gt; </ol> 2。胚の選択<ol><li>受精卵を取得し、標準的なプロトコル15に従ってゼリーコートを除去する。 100ミリメートルペトリ皿に0.5X培地に移す。 </li><li>胚は2細胞期に達すると、最初の分裂溝が別の皿に動物半球（ 図1）で軽く色素沈着面積を二等分したものをソートする。これらは、外植片のドナーになります。外植片を上演する兄弟コントロールとして機能するための手順を通してドナー胚の隣に別の皿に残りの2細胞期胚を保管してください。 </li></ol> 3。外植片の作製<ol><li>解剖皿に5月10日胚を置くのではなく、一度に1つの胚に取り組んでいます。 </li><li>透明卵黄膜が見られるように、最初の胚を置き、それは、胚の動物極の表面上に透明な空間（腔）で区切られています。尖った力を利用して1のサブドミナントの手（1が右利きされている場合は左手）のps、腔上記の卵黄膜を把握する。一方で削った鉗子を使用して、最初の鉗子先端に近い膜を持ち、静か膜剥がれ反対方向に引っ張る。標的細胞は、膜の除去の際に破損していないので、解剖するセルからの距離で初期把握を行います。一つは、胚が平らになるため、膜が除去されたことを伝えることができます。 </li><li>サブドミナント手にピンセットで1隣接セルをつかんで、解剖すべきセルが直接触れないように &quot;ハンドル&quot;としてこのセルを使用しています。一方で鉗子で、優しく希望の割球から離れて残りの隣接セルを引っ張る。同じ運命を共有して正中線細胞は、標的にされている場合は、それらがペアとして一緒に削除することができます。最後に、 &quot;ハンドル&quot;のセルを離れて解剖する。 </li><li>滅菌済みの割球（または割球ペア）、拾う、ガラスパスツールピペット、気泡や過度の吸引を避ける。ピペットは、細胞に損傷を与えることができますが、我々が日常的にこれをしないシャープなエッジを除去するために火を研磨することができる。外植片培養皿のウェル中の培地の表面の下にパスツールピペットの先端を置き、静かに割球を追放。それは、重力によって浅いくぼみにスライドしなければなりません。複数の胚から割球は、同じ単植に結合することができます。 </li><li>一つずつ、解剖皿の残りの胚では、この手順を繰り返します。約10胚の後、解剖皿細胞の残骸で満たされるでしょう。この現象が発生した場合、新鮮な解剖皿に変更します。 </li><li>すべての解剖が行われた後、外植片が浅いくぼみにあるかどうかを確認。しない場合、それらは静かに乾燥させ、70％エタノールと空気中で滅菌された毛のループを使ってうつ病に押し込むことができます。 </li><li>最後の郭清後の約一時間、デブリsurrouを削除滅菌、ガラスパスツールピペットで癒さ植片をnding。 </li><li>兄弟、制御の胚を含むペトリ皿に14から20°Cの隣での培養外植片の板を。兄弟の胚は、割球の外植片の発展段階を示すでしょう。 </li></ol> 4。分析のための収穫植<ol><li>兄弟姉妹が希望発達段階に到達したときに外植片を回収します。細胞の一部が崩壊した場合でも、これらの外植片はかなりうまく生き残る。文化の中で曇りの質量が十分に存在する場合、したがって、健康な植が内に埋設されているかどうかを判断するために毛のループまたは鉗子でそれを探る。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いて培養液を少量の外植片を拾うと、優しく行われるアッセイのための適切な固定剤または溶解バッファにそれらを追放する。 </li></ol>

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	<li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis.">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li><li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo.">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. 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Embryol. 182, 347-362 (1990).</li><li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis.">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li><li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+20+Early+events+in+frog+blastomere+fate+determination.">Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination.</a> Cell Fate and Lineage Determination. , 297-321 (1999).</li><li>Moore, K. B., Moody, S. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus.">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos.">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li><li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo.">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li><li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus.">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li><li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres.">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Development+of+Xenopus+laevis.">Early Development of Xenopus laevis.</a> A Laboratory Manual. , (2000).</li><li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=foxD5a,+a+Xenopus+winged+helix+gene,+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain.">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li><li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation.">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li><li>Vincent, J. -. P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs:+an+early+step+in+embryonic+axis+specification.">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li><li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appendix+A:+Solutions+and+Protocols.">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li><li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos.">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li><li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos.">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ほとんどの個々の割球の培養に成功するための重要なステップは次のとおりである：1）正常に関心の割球を識別する、2）滅菌した、健全な文化を維持すること、3）細胞周期の正しい部分の解剖細胞、​​4）必要なマニュアルを開発解剖や文化への転送だけでなく時の損傷を防止するための器用さ。 特定の割球を操作するには、カーディナルの軸を識別できることが不?...

アフリカツメガエルの胚は、その卵が顕微鏡のアプローチを可能にするのに十分な大きさであるため、胚細胞がその特定の運命を獲得するメカニズムを識別するために広く利用されてきた。各セルには固有エネルギーストアを提供卵黄血小板の豊富な細胞内の供給が含まれているため、さらに、彼らは、培地の栄養補給を必要とすることなく、外部から開発しています。 1、2、3、4、5、6 -細胞の運命が決定されるメカニズムを研究するための重要な資産は、（32セルステージ2〜から）卵割期の割球の運命マップの包括的なセットです。これらのマップは、組織が標識された子孫が移入され、開発の後半にある単一の識別可能な割球および監視に検出可能な分子をマイクロインジェクションすることにより構築した。胚の枢機卿軸は確実に多くのエンブリーで同定することができるため、一貫性のある運命のマップが可能ですOS。植物半球ではないのに対し、第一に、すべての野生型胚において動物半球は、色素沈着です。第二に、受精時の精子のエントリは、将来の腹側に向かって動物半球の色素沈着の収縮を引き起こし、多くの胚では色素沈着の差が故に背側と腹側の側面を区別するために使用することができます。第三に、第一分裂溝は、ほとんどの胚における半ば矢状面を近似し、その結果胚の左右を識別するために使用することができます。運命マップも胚の大規模な人口全体の各割球が識別できるように規則的なパターンで自然に受精卵が頻繁に開裂するという事実に依存しています。内および色素沈着および切断パターンに関する卵のクラッチの間にばらつきがあるが、本明細書に記載の選択手順を使用すると、所定の運命を有する細胞が約90％の精度で識別することができます。 細胞の運命が決定することができますいくつかのメカニズムで胚発生時の採掘。そのような差別的継承細胞質mRNAまたはタンパク質などの本質的な要因は、早期のパターニングのいくつかの側面に貢献しています。たとえば、特定の母性mRNAは細胞は、生殖系列に寄与する内胚葉になったり、背側体軸（7日）に寄与するかを決定します。胚の情報伝達の中心から隣接セル以上の遠縁でローカルに提供外因性の要因は、ほぼすべての臓器系の特定の組織の種類とパターン形成を誘導するための責任を負うものとします。シグナリングセンターの例には、神経外胚葉と中胚葉のパターンを誘発原腸胚におけるオーガナイザー/ノード、および肢芽のパターンは前後軸という活動を偏光の帯があります。運命マップが異なる器官の前駆体を識別し、正常な胚でその子孫によって取ら発達経路を明らかにするが、それらは本質的な区別はできませんそして、それらの細胞に外因性の影響。彼らはまた、子孫胚の複雑な信号環境において分化細胞の完全な発達の可能性を明らかにしない。で培養した胚に由来する細胞の除去または2）;小説胚の場所に）1細胞の移植：2つの実験的なアプローチは、細胞の運命は、内因性の要因によって決定されたか、後に外部の要因によって影響されているかどうかをテストすることができます外因性シグナルの不在。 細胞が手動で分離するのに十分な大きさであるため、両方の実験的なアプローチは、 アフリカツメガエルで実現可能となっている。たとえば、多くの研究は、運命の変更（7日、8、9）をテストするために宿主胚における新規の場所に胚（細胞間相互作用を変更する場合）または移植された細胞からの単一細胞を削除しました。さらに、胚の異なる領域から細胞の数が少ないexplantingの第二のアプローチIアフリカツメガエル胚の細胞は、細胞内の栄養素ストア、卵黄血小板で埋められるため、外因性因子の非存在下で誘導組織の相互作用を解明するNTOの培養が可能です。したがって、彼らは、培地の栄養や成長因子の補充なしで定義された塩培地で数日間培養することができる。私たちは、その背の動物の球が母性遺伝mRNAが10、11に起因する神経と背側中胚葉組織を生成するために自律的能力を持っており、他は32細胞割球と中胚葉の仕様では、内因性及び外因性情報12の両方に依存して認められた表示するには、このアプローチを使用していた。外植体として、細胞を培養することの利点は、媒体は、外植セル12、13、14の運命に影響を及ぼす可能性のある細胞間の通信経路を決定するために定義されたシグナル伝達因子を補充することができることである。また、1割球はPRを注入することができます内因性mRNAの翻訳を防止するために過剰発現するmRNAの遺伝子を持つ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​用いた文化にIOR。これらは、ゲインとロス·オブ·機能解析は、自律的に発現して運命のために必要とされる分子を識別することができます。外植片の運命を分析するには、特定の細胞種の同定は標準の遺伝子発現（ 例えば、in situハイブリダイゼーション 、RT-PCR）と免疫細胞化学的ア ​​ッセイにより行うことができる。このプロトコルは、胚細胞が特定の組織に発展する方法を制御内因性および外因性のメカニズムを区別するための簡単​​かつ強力な方法を提供します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-38 </td><td>鉗子先端部の大規模修繕のためのコース（12μm）であり、 </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-46 </td><td>鉗子先端のシャープ罰金のための媒体（3μm）を、 </td></tr><tr><td>アルミナ研磨フィルム</td><td>トーマス·サイエンティフィック</td><td> ＃6775E-54 </td><td>鉗子先端の研磨のためのファイン（0.3μm）を、 </td></tr><tr><td>鉗子：デュモン、Dumoxel Biologie＃5 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> ＃11252から30 </td><td>これらは、最初の購入時に鮮鋭化を必要としない微細なヒントがあります。耐腐食性、彼らがそうすることができるので、オートクレーブする。 </td></tr><tr><td>ゲンタマイシンソリューション</td><td>シグマ</td><td> G1397 </td><td>使用と同じ日に培地に入れる</td></tr></tbody></table>

blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development

胚の細胞のすべてをトレース系統から構築運命マップは、組織は、胚の各セルから派生しているが明らかになった。運命マップは臓器の前駆体を識別するための、子孫細胞は正常な胚に、その臓器を移植それによって発達経路を解明するために非常に有用であるが、それらは、前駆細胞の完全な発達の可能性を説明したりするメカニズムを特定することはありませんその運命が決定される。細胞運命のコミットメントをテストするためには、実験的操作後に発現したものと無傷の胚（運命マップ）に子孫の細胞の正常なレパートリーを比較します。細胞の運命は、周囲の細胞環境にかかわらず、（コミット）が固定され、またはそのネイバーが提供する外部要因によって、それに影響を与えていますか？ アフリカツメガエル胚の包括的な運命マップを使用して、我々が識別する方法について説明し、隔離し、文化の単一卵割期の前駆体、blasto呼ばミアズ。このアプローチは、1つは、これらの初期の細胞は、彼らがそれらの隣接細胞との相互作用を必要とし、無傷の胚内でそれらの通常の環境で取得運命にコミットしている、または他のタイプの信号にさらされた場合、代替の運命を表現するために影響を受ける可能性があるかどうかを評価することができます。

正確に細胞の発生能を評価するために、このアッセイの能力は運命マップ1、2、3、4、5、6に基づいて、適切な割球を解離に依存している。したがって、それは続いて、 図2に示すように、定期的な切断パターンに準拠し、 図1に示すように、2細胞期に正しい色素沈着パターンを持つ胚を選択することが重要です。一つは、彼らが必要な切断段階に達するよう?...

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Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

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15.2K ビュー.  The George Washington University. 個々の胚細胞の運命は継承分子および/または隣接するセルからの信号により影響を受ける可能性がある。卵割期アフリカツメガエル胚の運命マップを利用して、単一割球は、細胞間相互作用と継承された分子の寄与を評価するために分離して培養のために識別することができます。

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

発生生物学

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has quickly become a commonplace amongst researchers pursuing a wide variety of biological questions. Users most often employ the Cas9 protein derived from Streptococcus pyogenes in a complex with an easily reprogrammed guide RNA (gRNA). These components are introduced into cells, and through a base pairing with a complementary region of the double-stranded DNA (dsDNA) genome, the enzyme cleaves both strands to generate a double-strand break (DSB). Subsequent repair leads to either random insertion or deletion events (indels) or the incorporation of experimenter-provided DNA at the site of the break.
The use of a purified single-guide RNA and Cas9 protein, preassembled to form an RNP and delivered directly to cells, is a potent approach for achieving highly efficient gene editing. RNP editing particularly enhances the rate of gene insertion, an outcome that is often challenging to achieve. Compared to the delivery via a plasmid, the shorter persistence of the Cas9 RNP within the cell leads to fewer off-target events. 
Despite its advantages, many casual users of CRISPR gene editing are less familiar with this technique. To lower the barrier to entry, we outline detailed protocols for implementing the RNP strategy in a range of contexts, highlighting its distinct benefits and diverse applications. We cover editing in two types of primary human cells, T cells and hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs). We also show how Cas9 RNP editing enables the facile genetic manipulation of entire organisms, including the classic model roundworm Caenorhabditis elegans and the more recently introduced model crustacean, Parhyale hawaiensis.

Utilizing a preassembled Cas9 ribonucleoprotein complex (RNP) is a powerful method for precise, efficient genome editing. Here, we highlight its utility across a broad range of cells and organisms, including primary human cells and both classic and emerging model organisms.

強化されたゲノム細胞や生物の多様な Cas9 リボ核蛋白質と編集

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

遺伝学

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. This tissue complexity confounds the identification of causal link between extrinsic cues and cellular dynamics. A synthetically reconstituted multicellular system overcomes this problem by enabling researchers to test for a specific cue while eliminating others. Here, we present a method to reconstitute cell contact patterns with isolated Caenorhabditis elegans blastomere and adhesive polystyrene beads. The procedures involve eggshell removal, blastomere isolation by disrupting cell-cell adhesion, preparation of adhesive polystyrene beads, and reconstitution of cell-cell or cell-bead contact. Finally, we present the application of this method to investigate the orientation of cellular division axes that contributes to the regulation of spatial cellular patterning and cell fate specification in developing embryos. This robust, reproducible, and versatile in vitro method enables the study of direct relationships between spatial cell contact patterns and cellular responses.

In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads

Tissue complexities of multicellular systems confound the identification of causal relationship between extracellular cues and individual cellular behaviors. Here, we present a method to study the direct link between contact-dependent cues and division axes using C. elegans embryo blastomeres and adhesive polystyrene beads.

単離されたカエノラブディティス・エレガンス胚ブラストミアと接着剤ポリスチレンビーズを用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成

In multicellular systems, individual cells are surrounded by the various physical and chemical cues coming from neighboring cells and the environment. ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

生物学

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

ゼブラフィッシュ胚からのナイーブ・ブラストデム・エクスプラントの生成

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend on its ability to efficiently, timely, and faithfully recapitulate the sequences of blastocyst development (morphogenesis, specification, patterning), and to form cells reflecting the blastocyst stage. Here we show that na&#239;ve human pluripotent stem cells cultured in PXGL conditions and then triply inhibited for the Hippo, transforming growth factor- &#946;, and extracellular signal-regulated kinase pathways efficiently undergo morphogenesis to form blastoids (&gt;70%). Matching with developmental timing (~4 days), blastoids unroll the blastocyst sequence of specification by producing analogs of the trophoblast and epiblast, followed by the formation of analogs of the primitive endoderm and the polar trophoblasts. This results in the formation of cells transcriptionally similar to the blastocyst (&gt;96%) and a minority of post-implantation analogs. Blastoids efficiently pattern by forming the embryonic-abembryonic axis marked by the maturation of the polar region (NR2F2+), which acquires the specific potential to directionally attach to hormonally stimulated endometrial cells, as in utero. Such a human blastoid is a scalable, versatile, and ethical model to study human development and implantation in vitro.

A protocol outlining the formation of human blastoids that efficiently, timely, and sequentially generate blastocyst-like cells.

胚盤胞の開発と移植をモデル化するためのヒト芽球イドのプロトコル

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a promising model organism for laboratory studies of development, providing a useful outgroup comparison to the well studied arthropod model organism Drosophila melanogaster. In contrast to the syncytial cleavages of Drosophila, the early cleavages of Parhyale are holoblastic. Fate mapping using tracer dyes injected into early blastomeres have shown that all three germ layers and the germ line are established by the eight-cell stage. At this stage, three blastomeres are fated to give rise to the ectoderm, three are fated to give rise to the mesoderm, and the remaining two blastomeres are the precursors of the endoderm and germ line respectively. However, blastomere ablation experiments have shown that Parhyale embryos also possess significant regulatory capabilities, such that the fates of blastomeres ablated at the eight-cell stage can be taken over by the descendants of some of the remaining blastomeres. Blastomere ablation has previously been described by one of two methods: injection and subsequent activation of phototoxic dyes or manual ablation. However, photoablation kills blastomeres but does not remove the dead cell body from the embryo. Complete physical removal of specific blastomeres may therefore be a preferred method of ablation for some applications. Here we present a protocol for manual removal of single blastomeres from the eight-cell stage of Parhyale embryos, illustrating the instruments and manual procedures necessary for complete removal of the cell body while keeping the remaining blastomeres alive and intact. This protocol can be applied to any Parhyale cell at the eight-cell stage, or to blastomeres of other early cleavage stages. In addition, in principle this protocol could be applicable to early cleavage stage embryos of other holoblastically cleaving marine invertebrates.

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

The amphipod Parhyale hawaiensis is a promising model organism for studies of crustacean embryology and comparative arthropod development and evolution. This protocol describes a method for manual removal of single blastomeres from early cleavage stage embryos of Parhyale.

端脚甲殻類の8細胞胚から単セルのアブレーション<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

Fate Mapping

Fate mapping is a technique used to understand how embryonic cells divide, differentiate, and migrate during development. In classic fate mapping experiments, cells in different areas of an embryo are labeled with a chemical dye and then tracked to determine which tissues or structures they form. Technological improvements now allow for individual cells to be marked and traced throughout embryonic development and adulthood.
This video reviews the concepts behind fate mapping, and then details a fate mapping protocol in zebrafish using photoactivatable fluorescent proteins. Finally, specific applications and modifications of this unique technique are discussed.

胚発生時に細胞運命のコミットメントをテストするために割球植

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