وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق البحث للوقاية من العمى والمعاهد الوطنية للصحة منح EY10542.

1. إعداد شرائح الشبكية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة تجميع (تصميم موضح في الشكل 1). مكان اثنين حبات من الشحوم فراغ، متباعدة ~ 8-10 ملم وبصرف النظر، عبر غرفة تسجيل لتشكيل قناة لsuperfusate والتي لتضمين شرائح الشبكية. إضافة ثانية حبة من الشحوم بضعة ملليمترات أبعد ما وراء كل من هذه الخرز اثنين من الشحوم ليكون بمثابة السدود والحد من امتداد. ضع قطعة صغيرة من الثلاثي KimWipe في نهاية القاعة للتأكد من ملامسة السائل مع الإلكترود المرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط قطعة من غشاء النيتروسليلوز (~ 5 × 10 مم؛ 0.8 مسام ميكرون) شقة ضد شريحة المجهر والزجاج إلى قسمين حبات صغيرة من الشحوم فراغ. تجنب وضع الشحوم مباشرة تحت مركز للغشاء النيتروسليلوز، وهذا يمكن منع شبكية العين من الانضمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد تقطيع الأنسجة، وكسر مزدوج حافة شفرة الحلاقة إلى 4 قطع ونعلق واحد إلى الذراع تشريح. قطع شريحة رقيقة من nitrocellulبيئة نظام التشغيل غشاء لضمان أن طليعة من شفرة الحلاقة وضع مستو ضد غرفة تسجيل، وبالتالي خفض نظيفة من خلال غشاء النيتروسليلوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على كوب صغير من البرمائيات محلول ملحي (الجدول 1) على الجليد في محطة تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء السمندل بواسطة قطع الرأس. Hemisect رئيس sagitally وباب عن طريق الحبل الشوكي. مبلل مكان نصف من الرأس على قطعة من القطن بالمحلول الملحي البرمائيات فوق كتلة مشمع. النصف الآخر من الرأس يمكن أن تكون ملفوفة مع منشفة ورقية رطبة وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استأصل العين. باستخدام Vannas مقص صغير، قطع الجلد الذي يربط بين العين إلى المدار المحيطة بها. بعد تحرير الجزء الأمامي من العين من الأنسجة المحيطة المدارية، وسحب العين إلى الأمام ومرر مقص تحت العين لقطع طريق عضلات العين والعصب البصري، وتحرير العين من المدار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العين منزوعة النواة على سرير من القطن علىمشمع كتلة. تجاهل نصف الرأس. تقليم الدهون الزائدة المدارية من الجزء الخلفي من العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق صغير في وسط القرنية مع شفرة جراحية حادة. إزالة القرنية عن طريق تحريك Vannas غرامة مقص في شق وتوسيع نطاق خفض شعاعيا من نحو مشرشر ORA. قطع محيطي حول مشرشر ORA عن طريق تناوب كتلة مشمع أو القطن بين التخفيضات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد قطع كل الطريق حول العين، وإزالة القرنية والعدسة عن طريق سحبهم من جانب فنجان العين. نقل فنجان العين الناتجة على سطح صلب من كتلة مشمع مبلل بمحلول ملحي البرمائيات. قطع عليه في ثلثي بشفرة حلاقة حادة، وذلك باستخدام حركة النشر غرامة لضمان أن كنت قد قطعت كل الطريق من خلال الصلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد أو قطعتين من فنجان العين على غشاء النيتروسليلوز مع سطح الشبكية أسفل. غمر القطع المتبقية مع المياه المالحة إضافية ووضعها في الثلاجة في ~ 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شركة جنرال الكتريكاضغط ntly قطعة من فنجان العين ضد غشاء النيتروسليلوز مع ملقط غرامة. غمر غشاء النيتروسليلوز وقطعة فنجان العين مع عدة قطرات من المياه المالحة الباردة البرمائيات وصمة عار على حواف مع KimWipe لمساعدة شبكية العين على الانضمام. مرة أخرى، يغرق في فنجان العين وغشاء النيتروسليلوز مع عدة قطرات من محلول ملحي بارد البرمائيات وقشر بعيدا الصلبة / المشيمية / الشبكية الظهارة الصبغية الشبكية لعزل (والتي يمكن أن تظهر وردي بسبب وجود رودوبسين غير مقصور). إذا لزم الأمر، وقطع العصب البصري لتحرير شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لم تلتزم شبكية العين بإحكام، تستنزف المياه المالحة مع KimWipe لسحب شبكية العين أكثر بحزم أسفل على غشاء النيتروسليلوز. استبدال المالحة. أكرر، إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة مع البرد البرمائيات المالحة وتحويلها إلى مرحلة تقطيع الأنسجة. شريحة شبكية العين وغشاء النيتروسليلوز إلى شرائح رقيقة، والعمل من واحدة من نهاية إلى أخرى من خلال تحويل ميكرومتر رنيهفي 125 ميكرون الزيادات. اضغط على شفرة الحلاقة بلطف ولكن بحزم من خلال شبكية العين وغشاء النيتروسليلوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح الشبكية عن طريق تحريك شرائح من غشاء النيتروسليلوز إلى القناة الرئيسية للغرفة تسجيل. رفع شريط من غشاء الحرة ومن ثم الاحتفاظ بها في المكان في حين نقل غرفة تحتها، ويجري التأكد من الحفاظ على شرائح المغمورة. تضمين حواف الغشاء نتروسليلوز في شرائط من الشحوم فراغ، تناوب عليها 90 درجة لعرض طبقات الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على شقة غشاء النيتروسليلوز ضد سطح الزجاج. حتى إذا لم يكن هناك شبكية العين على كل قطعة، مكان شرائح من غشاء النيتروسليلوز على فترات منتظمة (~ 1 ملم بعيدا) على طول على طول القناة نضح للمساعدة في تفريق التوتر السطحي، وتحسين تدفق السوائل. </li></ol> 2. إقران تسجيلات خلية كاملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل الشرائح وقد تم نقل، نقل غرفة تسجيل لمرحلة تستقيم، الثابتةالمجهر مرحلة وإرفاق إشارة الرصاص القطب. التركيز على شرائح باستخدام مسافة طويلة في العمل، الغمر بالماء، 40-60X الهدف. يجب وضع المجهر على طاولة الهواء لتخفيف الاهتزازات والمغلقة في قفص فاراداي للحد من التدخل الكهربائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Superfuse شرائح مستمر بمعدل 1 مل / دقيقة مع محلول ملحي البرمائيات فقاعات مع 100٪ O 2. ربط شفط، والتأكد من أن تدفق وتدفق ومتوازن. تدفق يمكن أن ينظم عن طريق تناوب نهاية مشطوف من الإبرة شفط أو عن طريق تحريك KimWipe في نهاية الحجرة أقرب أو أبعد من الإبرة تدفق. ويمكن أن تظل التحضير في درجة حرارة الغرفة أو تبريد مع جهاز بلتيير أو ببساطة عن طريق وضع وضع كيس من الثلج على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص شرائح تحت ضوء خافت أو الأشعة تحت الحمراء وتحديد زوج من الخلايا - وهي مبصرة (قضيب أو مخروط) وخلية أفقي أو ثنائي القطب قريب - إلى هدف لتسجيل كامل الخلية. يمكن أن تكون قضبان أناdentified من قبل أجسادهم خلية كبيرة وقضيب مثل قطاعات بارزة الخارجي (الشكل 2A). المخاريط هي أصغر من قضبان ولها قطاعات الخارجي مدبب صغير. خلية ثنائي القطب وSOMAS خلية الأفقية هي في الصف الأبعد من أجسام الخلايا في الطبقة النووية الداخلية (INL؛ أرقام 2B و 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل إعداد شرائح، واستخدام مجتذب ماصة لتصنيع بال micropipettes من الزجاج البورسليكات (1.2 مم القطر الخارجي، 0.95 مم القطر الداخلي مع خيوط الزجاج). غيض من كل micropipette ينبغي أن يكون ~ 1-2 ميكرون في القطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة الحشوة غير المعدنية (مثل واحد مصنوعة من حقنة 1 سم مكعب أو MicroFil)، وملء الماصات مع الحل داخل الخلايا (الجدول 1) ونعلق على حامل قطب كهربائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الهدف المجهر قليلا. ضع ماصة مبصرة تحت الهدف ومن ثم خفضه بحيث غيض يتم وضع فقط فوق الشرائح. كرر مع خميسانه ماصة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط أي تعويض في مستوى خط الأساس الحالية على مكبر للصوت. تحقق المقاومة ماصة مع بالسيارات 5-10 إزالة إستقطاب النبض. نحن عادة استخدام ماصات التي تتراوح بين 10-15 MΩ، نتيجة تفتق طويلة من رمح والأسمولية منخفضة من الحلول ماصة البرمائيات. مع حلول الثدييات الأسمولية العالي، هذه الماصات نفسه يحمل قيم المقاومة من ~ 8-12 MΩ. في حين أننا قد استخدمت بأقطار طرف أكبر مع قيم المقاومة من 3-4 MΩ في الحلول البرمائيات، ويقابل المزايا التي تقدمها انخفاض المقاومة وصول صعوبة أكبر في ختم على أغشية الخلايا والمتهدمة أكثر سرعة التيارات الكالسيوم وغيرها من رسول الثاني حساسة للاستجابات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء تطبيق الضغط الايجابي طفيف، موقف ماصة بعد متشابك بحيث إنها تجري اتصالات مع خلايا الجسم الأفقي أو ثنائي القطب. ثم ضع ماصة قبل المشبكي بحيث إنها تجري اتصالات مع خلايا الجسم من قضيب أو مخروط مبصرة. تسجيلات APPEع أن تكون أكثر استقرارا عندما نصائح ماصة الاتصال الجزء الداخلي بدلا من سوما، خصوصا في المخاريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين رصد المقاومة، والإفراج عن الضغط الايجابي على ماصة بعد متشابك. في بعض الأحيان، والإفراج عن الضغط الايجابي هو كاف لتشكيل ختم gigaohm. إن لم يكن، وتطبيق الشفط لطيف مع 1 مل حقنة أو عن طريق الفم. بعد نمت المقاومة تلميح ل&gt; 100 MΩ، وتطبيق المحتمل عقد -60 بالسيارات. بعد الحصول على ختم gigaohm، فارغة من أي العابرين السعة ماصة وتكرار الإجراء الختم لمبصرة ماصة، وتطبيق المحتمل عقد -70 بالسيارات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمزق التصحيح باستخدام فمك أو حقنة لتطبيق الشفط إلى كل خلية بدورها. سوف قضبان، والأقماع، وخلايا القطبين عادة تمزق مع الشفط لطيف. الحصول على تكوين خلية كاملة مع خلية الأفقي قد تتطلب أكبر الشفط (أي مع حقنة سم مكعب 3) في تركيبة مع نبضات الجهد سريع قوي تسليمها مع &quot;ZAP&quot; جمعةeature من مكبر للصوت المشبك التصحيح. سوف تمزق الغشاء وإنشاء تكوين خلية كاملة يكون واضحا من خلال ظهور العابرين السعة خلية كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيد هوية الخلية بعد متشابك من الناحية الفسيولوجية عن طريق تطبيق ومضة ضوء وتقديم سلسلة من الخطوات الجهد من -120 إلى +40 بالسيارات في 20 زيادات بالسيارات (الشكلان 3 و 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم ما إذا كانت هناك علاقة بين زوج من الخلايا synaptically، وتقديم لمحة (25-100 ميللي ثانية)، 60 بالسيارات الاستقطاب خطوة إلى مبصرة (إلى -10 بالسيارات، بالقرب من ذروة L-نوع الكالسيوم الجهد بوابات الحالي) والبحث لتيارات ما بعد متشابك في الثانية الخلايا العصبية النظام (الشكل 5). خطوة إزالة إستقطاب قوي يجب استحضار سريع، عابر الداخل الحالي بعد متشابك في فترة ما بعد متشابك أفقي أو OFF خلية ثنائي القطب الناجمة عن موجة من إطلاق حويصلة من مخروط (الشكل 5). </li></ol>

<ol>
	<li>Ram&#242;n y Cajal, S., Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Structure of the Retina. , (1972).</li><li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+and+the+retina:+a+100-year+retrospective.">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li><li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina.">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li><li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina.">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina.">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li><li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses.">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li><li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+synaptic+ribbons:+how+they+are+built+and+what+they+do.">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li><li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1:+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li><li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse.">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li><li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).</li><li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation.">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina.">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina:+general+principles+and+species-specific+variations:+the+Friedenwald+lecture.">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li><li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina.">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li><li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors.">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li><li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells:+current+vs.+voltage.">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li><li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors.">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li><li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization.">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li><li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation.">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد ثبت إعداد شريحة الشبكية مفيدة جدا لتحليل الدوائر والآليات التي تستخدمها في شبكية العين لمعالجة المعلومات البصرية. كانت القدرة على الحصول على تسجيلات خلية كاملة في وقت واحد من الخلايا العصبية قبل وبعد متشابك مفيدة بشكل خاص في هذا المسعى. إقران تسجيلات خلية كاملة هي أسهل بكثير لتحقيق مع شرائح من شبكية العين مع الاستعدادات مسطحة جبل لأن يتعرض لها طبقات الشبكية المختلفة. وعلاوة على ذلك، لأن من الخلايا العصبية في شبكية العين الخاصة بهم كبيرة، السلمندر لها تاريخ طويل تمهيدا الشبكية، وبالتالي توفير نظام نموذجي خاصة تتميز جيدا. مع الممارسة، وشرائح صحية من السمندل شبكية العين يمكن أن تكون مستعدة بشكل منتظم. ويمكن لبعض الخطوات الرئيسية يجعل الفرق بين النجاح والفشل. 1) تأكد من هي التي شنت على شفرة الحلاقة على تقطيع اللحم والأنسجة بحيث يضع شقة ضد سطح الزجاج وشرائح نظيفة على الرغم من كل الأنسجة وunderlyiنانوغرام غشاء النيتروسليلوز. إذا كنت قد قدمت خفض نظيفة من خلال غشاء النيتروسليلوز، يجب أن تسمع بنقرة وخافت مثل شفرة حلاقة الضربات سطح شريحة زجاجية. 2) تأكد من التزمت الشبكية إلى غشاء النيتروسليلوز. خلاف ذلك، يمكن أن شبكية العين تطفو بعيدا عن غشاء خلال أي مرحلة من مراحل الإجراءات. 3) لا تعرض قطع شرائح في الهواء، حيث سيؤدي ذلك إلى تلف العديد من الخلايا السطحية. 4) تأكد من أن شرائح وغشاء النيتروسليلوز شقة تقع ضد شريحة زجاجية بحيث طبقات الشبكية واضحة تحت المجهر تشريح. 5) تحقيق التوازن بين معدلات تدفق superfusate وتدفق من أجل تجنب تفيض غرفة تسجيل. هذا يمنع التغيرات المفاجئة في مستويات الحل، الذي يمكن أن يسبب حركات الأنسجة المفاجئ. 6) اختيار زوج صحية من الخلايا قريبة من بعضها البعض. الخلايا التي تحتوي السيتوبلازم على نحو سلس وأكثر صحة من الخلايا مع السيتوبلازم محبب. الخلايا أعمق في شريحة هم أكثر عرضة للاحتفاظ يخدع متشابك سليمةالكياسة. 7) تأكد من غيض ماصة لم يكسر أو نحى ضد الأنسجة الأخرى أو الحطام على طول الطريق وصولا إلى الخلايا. 8) للتحقق من مقاومة ماصة لضمان عدم انسداد مع الحطام أو فقاعة، وكلاهما يمكن أن تجعل من الصعب الحصول على تسجيل كامل الخلية الجودة. بدلا من ربط شبكية العين على الورق مرشح النيتروسليلوز، تضمين بعض المحققين شبكية العين في كتلة من أجار واستخدام vibratome لخفض شرائح الشبكية. على الرغم من أننا لم يحاكم هذا النهج، كيم وآخرون. 11 مناقشة مزايا كلا النهجين. في تجربتهم، النهج القائم على أجار يوفر العائد أكثر اتساقا من شرائح مسطحة مع طبقات الشبكية-يرسم بشكل جيد ولكن النهج القائم على الورق مرشح ينتج خلايا مستقبلة للضوء أكثر صحة. قضبان ومخاريط هي المسؤولة عن transducing الضوء إلى تغيرات في غشاء المحتملة. مع تسجيلات المقترنة، لا يمكن للغشاء المحتملة من قضبان أو الأقماع يكون manipulانبعاث العوادم مباشرة وبالتالي فإن القدرة على توليد استجابات ضوء، في حين مفيدة لتحديد أنواع الخلايا، قد لا تكون ضرورية. ولذلك فإننا كثيرا ما تعد شرائح في الضوء الأبيض. ومع ذلك، حتى عندما أعدت تحت إضاءة ساطعة، يمكن السمندل الخلايا العصبية للشبكية توليد استجابات ضوء كبيرة كما يتضح من الردود في الشكل. 3. ويرجع ذلك جزئيا إلى خزان كبير نسبيا من حامل اللون في حجم كبير الجزء الخارجي ولكنها قد تعكس أيضا قدرة الخلايا على تجديد مولر 11-CIS-الشبكية لالأقماع 12. للحصول على كامل الردود ضوء الظلام مكيفة، يمكن للمرء أن إعداد الشرائح تحت إضاءة الأشعة تحت الحمراء. لتشريح تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء، ونحن نعلق GENIII صورة مكثفات (Nitemate NAV3، ليتون إندستريز، تمب، من الألف إلى الياء) لمن خلال oculars المجهر تشريح وإلقاء الضوء على الأنسجة مع مصباح يدوي LED الأشعة تحت الحمراء. لتقطيع وغيرها من الإجراءات التي لا تجري تحت مجهر تشريح، ونحن توظيف IMA رئيس محمولةGE تكثيف. لوضع ماصات التصحيح، ونحن تصور شرائح باستخدام كاميرا CCD حساس الأشعة تحت الحمراء (على سبيل المثال WATEC 502H، WATEC شركة، ميدلتاون، NY) لنصرة تستقيم، المجهر مرحلة ثابتة. مع هذه الاحتياطات، يمكن للمرء الحصول على ردود قضيب واظهار حساسية فوتون واحد 6 و 13. واحد الحد من العمل في شرائح الشبكية هو أن العمليات الخلوية طويلة من الخلايا العصبية حقل كبير الشبكية قد تفقد العديد من التشعبات من خلال إجراء تشريح. ولذلك الاستعدادات شريحة الشبكية هي أكثر فائدة لدراسة علم وظائف الأعضاء من الخلايا فيه اتصالات متشابك تنطوي على عمليات بالقرب من خلايا الجسم. شبكية العين البرمائيات والثدييات تشترك في العديد من أنواع الخلايا نفسها، والاستفادة من آليات فسيولوجية مماثلة 14-16. بينما السمندل شبكية العين هو نموذج جيد لكثير من جوانب شبكية الثدييات، فارق واحد مهم ويبدو أن وجود مسار مخصص قضيب في الثدييات التي INVOالتلاميذ اتصالات من الخلايا المتخصصة قضيب القطبين على AII خلايا عديم الاستطالات 14. على قيد إضافي من شبكية العين السمندل هو عدد قليل من الأدوات الوراثية وضعت خصيصا لهذه الأنواع. ومع ذلك، والأجسام المضادة والكواشف shRNA التي تستهدف المناطق المحمية جيدا في الأنواع الأخرى يمكن أن تستخدم بنجاح في السمندل، كما يمكن العديد من مثبطات جزيء صغير والكواشف الببتيد. بالإضافة إلى ذلك، مع بضعة تعديلات في تقنية، يمكن إعداد شرائح الشبكية من الأنواع الأخرى التي بعض من هذه الأدوات هي أكثر توافرا. وراء فائدتها لإقران تسجيل كامل الخلية، وإعداد شريحة الشبكية السمندل هو أيضا قابلة لمجموعة متنوعة من المناهج الأخرى. كما نوقش أعلاه، شرائح الشبكية يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات ضوء في تركيبة مع مختلف البروتوكولات المشبك الجهد 17. ويمكن أيضا أن يتم تحميل الخلايا العصبية للشبكية مع الأصباغ الفلورية حساسة للكا 2 +، الكلورين -، أو نا+ قدم من خلال ماصة التصحيح أو بواسطة حمام تطبيق 15،18-20. ويمكن إدخال A الببتيد الفلورسنت التي تربط إلى الوشاح متشابك 21 من خلال ماصة التصحيح وتستخدم للتصوير الشريط أو 10، عندما مترافق إلى فلوريسئين، لحاد وإلحاق أضرار انتقائي الشريط 22. وقد استخدمنا أيضا شرائح الشبكية في تركيبة مع نقاط الكم لرصد تحركات قنوات الكالسيوم الفردية في قضيب ومخروط المحطات متشابك 23. وهكذا، فإن شريحة الشبكية العمودي هو إعداد التجريبية تنوعا لدراسة آليات متشابك الأساسية وظائف معالجة فريدة من نوعها أجريت في المشبك الأولى في مسار الإشارات البصرية.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

واحدة من المهام المركزية في علم الأعصاب الشبكية هو فهم الدوائر من الخلايا العصبية للشبكية، وكيف تلك الاتصالات هي المسؤولة عن تشكيل الاشارات المرسلة الى المخ. تم الكشف عن الفوتونات في شبكية العين بواسطة قضيب ومخروط خلايا مستقبلة للضوء، التي تحول تلك الطاقة إلى إشارة كهربائية، نقلها إلى الخلايا العصبية للشبكية أخرى، حيث تتم معالجتها وإرسالها إلى الأهداف المركزية في المخ عبر العصب البصري. جاء في وقت مبكر رؤى هامة في الدوائر الشبكية وتجهيز مرئي من الدراسات النسيجية من 1،2 كاجال و، في وقت لاحق، من التسجيلات الكهربية من النشاط ارتفاعه من خلايا الشبكية العقدة - خلايا شبكية العين الناتج من 3،4. فهم مفصل من المعالجة البصرية في شبكية العين يتطلب فهم الإشارات في كل خطوة في مسار من مبصرة إلى الخلايا العقدية للشبكية. ومع ذلك، العديد من أنواع الخلايا في شبكية العين هي برالعبوات الناسفة عميق في الأنسجة وبالتالي لا يمكن الوصول إليها نسبيا لتسجيل الكهربية. هذا القيد يمكن التغلب عليها من خلال العمل مع شرائح عمودية، في الخلايا التي المقيمين داخل كل طبقة من طبقات شبكية العين هي واضحة للعيان ويمكن الوصول إليها لتسجيل الكهربية. هنا، نحن تصف طريقة لصنع المقاطع الرأسية من شبكية العين من اليرقات نمر السلمندر (Ambystoma tigrinum). في حين تم تطوير هذا المستحضر في الأصل للتسجيلات مع microelectrodes حادة 5،6، ونحن تصف طريقة لثنائي كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد من خلايا مستقبلة للضوء والخلايا الأفقية وثنائي القطب من الدرجة الثانية التي نعمل التلاعب المحتملة غشاء مبصرة في حين تم تسجيل في وقت واحد بعد ردود متشابك في الخلايا الأفقية أو ثنائي القطب. مبصرات من نمور التاميل السمندل هي أكبر بكثير من تلك الأنواع من الثدييات، مما يجعل هذا الإعداد المثالي ليتخذوا فيه تينهجه التجريبية تحديا تقنيا. ويرد وصف هذه التجارب مع العين في اتجاه يحقق في خصائص اشارة من الشريط متشابك - هيكل متشابك المتخصصة وجدت في عدد قليل فقط من الخلايا العصبية، بما في ذلك قضيب ومخروط مبصرات، التي هي مناسبة تماما للحفاظ على نسبة عالية من منشط الافراج عن العصبي 7 ، 8 - وكيف أنه يساهم في خصائص اشارة فريدة من نوعها من هذا أولا المشبك الشبكية.

وتظهر آثار ممثل الردود ضوء من الخلايا العصبية في شرائح عمودية من السمندل شبكية العين في الشكل 3. المخروط، خلية الأفقي، وOFF خلية ثنائي القطب كل عرض على الخارج الحالية استجابة لظهور ضوء. ويتسبب بارز نحو الداخل في الوقت الحالي بعد ومضة ضوء في التسجيلات الخلية الأفقي وثنائي القطب في زيادة الافراج عن الغلوتامات من مبصرات كما يزيل الاستقطاب في الضوء الإزاحة. وON خلية ثنائي القطب يستجيب مع تيار الداخل في بداية ضوء الناتجة عن الغلوتامات metabotropic تسجيل الدخول قلب مستقبلات الإشارات تتالي وتفعيل قنوات TRPM1 9. الخلايا الأفقية وخلايا القطبين يمكن تمييزها عن بعضها البعض من خلال العلاقات الرابع منها (الشكل 4). الخلايا الأفقية وعادة ما يكون خطي أو تصحيح باطنه الرابع وانخفاض مقاومة المدخلات (&lt;500 MΩ؛ الشكل 4A) في حين أن الخلايا القطبين لديها مقاومة عالية المدخلات(0.5-2 GΩ) وظاهريا-تصحيح I - V (الشكل 4B) الشكل 5 يظهر نتائج ممثلة من التسجيلات من زوج خلية مخروطية الأفقي (الشكل 5A) ومخروط-OFF ثنائي القطب الزوج الخلية (الشكل 5B). في كل منهما، إزالة إستقطاب للمخروط إلى -10 بالسيارات من المحتمل عقد -70 بالسيارات أثار الكالسيوم الجهد بوابات الحالية في مخروط وEPSC إلى الداخل بسرعة في الخلية أفقيا أو ثنائي القطب. هذا حافزا قويا يكفي لتفريغ تجمع بسهولة، المنطلقة من ~ 20 الحويصلات من كل الشريط متشابك، مما أسفر عن EPSC من ~ 47 باسكال / الشريط 10. كان EPSC خلية الأفقي في الشكل 5A 232 السلطة الفلسطينية، مما يشير إلى أنها تلقت اتصالات الشريط 5 من مخروط قبل المشبكي. هذا يوحي تقدير مماثل من 178 باسكال EPSC في الخلية القطبين قبالة (الشكل 5B) أنها تلقت اتصالات الشريط 4 من مخروط قبل المشبكي. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td><sترونج&gt; البرمائيات المالحة </td><td> ماصة قبل المشبكي </td><td> ماصة بعد المشبكي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 116 ملي </td><td> 3.5 ملم </td><td> 3.5 ملم </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> 2.5 ملم </td><td></td><td></td></tr><tr><td> و CaCl 2 </td><td> 1.8 ملي </td><td> 1 ملم </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0.5 ملي </td><td> 1 ملم </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 ملي </td><td> 10 ملي </td><td> 10 ملي </td></tr><tr><td> جلوكوز </td><td> 5 ملي </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CS-الغلوتامات * </td><td></td><td> 40 ملم </td><td></td></tr><tr><td> CS-غلوكونات ** </td><td></td><td> 50 ملي </td><td> 90 ملم </td></tr><tr><td> كلوريد رباعي إيثيل الأمونيوم </td><td></td><td> 10 ملي </td><td> 10 ملي </td></tr><tR&gt; <td> ATP-المغنيسيوم </td><td></td><td> 9 ملم </td><td> 9 ملم </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0.5 ملي </td><td> 0.5 ملي </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 ملي </td><td> 5 ملي </td></tr><tr><td> درجة الحموضة *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> الأسمولية **** </td><td> 245 الميلي أسمول </td><td> 240 الميلي أسمول </td><td> 240 الميلي أسمول </td></tr></tbody></table> يرصد * CS-الغلوتامات من خلال تحييد 40 ملم حمض الجلوتاميك مع L-40 CsOH ملي في حل ماصة. * ويرصد A 1 M الأوراق المالية من CS-غلوكونات من خلال تحييد حل CsOH مع 45-50٪ حمض D-الغلوكونيك. *** يجب تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم لحل خارج الخلية وCsOH لحلول ماصة. **** الحفاظ على الأسمولية من الحلول ماصة أدناه فقط أن من الحل خارج الخلية يمنع تورم الخلية ويعزز طول العمر للتسجيل. جدول1. مكونات والمعلمات من أجل إيجاد حلول داخل وخارج الخلية القياسية المستخدمة في هذا البروتوكول. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> الشكل 1. تسجيل تصميم غرفة. (AC) الأعلى، الجانب، ومناظر لقطة اعتراضية للغرفة تسجيل تظهر الأبعاد. ويتم تشكيله غرفة من قطعة سميكة 2 ملم من الاكريليك. (D) غرفة تجميعها. Superfusate يدخل غرفة من خلال 10 سم طول من تفلون أنابيب (أنابيب تدفق؛ نوع 24LW). تتم إزالة Superfusate من خلال تطبيق شفط خفيف إلى مشطوف قياس 20 أنبوب معدني في الجانب الآخر من الغرفة. المتاخمة لهذا الأنبوب الناتج هو حج / أجكل بيليه الإلكترود المرجعي. يتم توصيل الرصاص من هذا القطب إشارة إلى إشارة المدخلات من headstage. مثلث صغير من KimWipeوضعت فوق القطب إشارة إلى إبقائه على اتصال مع الحل وتنظيم تدفق الحل في أنبوب تدفق. يتم تشكيل قاعدة للغرفة عن طريق وضع شريحة المجهر والزجاج في حواف راحة للغرفة. يقام الشريحة في مكان مع حبة من الشحوم فراغ. هي جزء لا يتجزأ من شرائح غشاء النيتروسليلوز مع شرائح الشبكية في حبات من الشحوم فراغ التي تشكل قناة للحل لتدفق. قبل اتخاذ شرائح، يتم اضافته ل5 × 10 مم قطعة من غشاء النيتروسليلوز إلى غرفة مع اثنين من حبات صغيرة من الشحوم فراغ. يتم وضع قطعة من الجانب فنجان العين الزجاجية أسفل على هذا الغشاء نتروسليلوز ورفع بعيدا بمجرد أن تلتزم شبكية العين. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">انقر هنا لعرض أكبر شخصية</a> . <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> الشكل 2. أزواج الخلية صبغ مليئة في هاءإعداد شريحة rtical. A) صور من قضيب أفقي والخلايا synaptically يقترن التي كانت مليئة المتناقضة الأصباغ الفلورية التي أدرجت عن طريق ماصة التصحيح خلال وقت واحد تسجيل كامل الخلية. أدرج وسيفر الأصفر (2 ملغ / مل) في حل ماصة قضيب (الصفراء) وsulfarhodamine B (1 ملغ / مل) أدرج في أفقي خلية حل ماصة (البنفسجية). تم القبض على الصور الفلورسنت باستخدام قرص الغزل المجهر متحد البؤر (بيركن إلمر Ultraview LCI) مجهزة بكاميرا CCD تبريد (أوركا ER) والتي شنت على المجهر مرحلة ثابتة (نيكون E600 FN مع 60X، 1.0 NA الهدف الغمر بالماء). تم مضافين هذه الصور على الصور مجال مشرق من شرائح الشبكية المقابلة باستخدام أدوبي فوتوشوب. B) الصور من مخروط وsynaptically يقترن OFF خلية ثنائي القطب. بين القطبين خلية محوار محطة ramifies في الأبعد (S1) sublamina من طبقة ضفيري الداخلية بالقرب من الحدود مع الطبقة النووية الداخلية. <strong&gt; C) الصور من مخروط والخلايا الأفقية synaptically يقترن. لاحظ أن محطات مخروط هي أكبر بكثير من محطة محوار للقضيب. على الرغم من أن الخلايا الأفقية يمكن تحديدها عن طريق شكل مستطيل من أجسام الخلايا، والهيئات خلية من ON-OFF القطبين والخلايا من نوع في INL لا يمكن تمييزها بسهولة قبل التسجيل. ومع ذلك، يمكن للمرء أن الهدف المشردين يحركها مخروط OFF خلايا ثنائية القطب والتي لها أجسام الخلايا في ONL ويمكن تمييزها عن مخاريط من عدم وجود قطاعات الداخلية والخارجية. شريط النطاق هو 20 ميكرون. <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> الشكل (3). التيارات المسجلة تحت المشبك الجهد من أربعة الخلايا العصبية للشبكية مختلفة ردا على مشرق 500 ميللي ثانية مضة من الضوء الأبيض ضوء أثار. ومخروط (A)، خلية الأفقي <stronز&gt; (B)، وخارج الخلية ثنائي القطب (C) الاستجابة لجميع للضوء مع الخارج الحالية. (D) وردت القطبين الخلية إلى نفس التحفيز ضوء مع الداخل الحالي. ضجيج خط الأساس التي أظهرتها الخلية القطبين قبالة (C)، ويعكس إطلاق مستمر من الحويصلات متشابك في الظلام الذي يقلل عندما hyperpolarize المستقبلات الضوئية في الضوء. تم الحصول على ردود من هذه الخلايا أربعة في التسجيلات منفصلة باستخدام شرائح أعدت تحت الضوء الأبيض. شدة التحفيز الضوء الأبيض المستخدمة في هذه الأمثلة تنتج الاستجابات في الخلايا الأفقية والقطبين يعادل 580 نانومتر تدفق الفوتون من 1 × 10 5 الفوتونات / ثانية / ميكرون 2. <img alt="الشكل 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> الشكل 4. الحالية ذات الجهد (IV) علاقات حالخلايا القطبين orizontal وخارجها. (A) لوحة الأعلى، والتيارات التي حركها غشاء سلسلة من 150 ميللي ثانية الخطوات الجهد من -120 إلى +40 بالسيارات تطبيقها في 20 زيادات بالسيارات (اللوحة السفلية) إلى خلية الأفقي. الخلايا الأفقية وعادة ما يكون مقاومة المدخلات المنخفضة والعلاقات الرابع خطي أو تصحيح باطنه. (B) علاقة الرابع من خلية ثنائي القطب قبالة ردا على سلسلة من الخطوات الجهد. الخلايا القطبين لديها أعلى المقاومة الإدخال والرابع تصحيح ظاهريا، ويرجع ذلك إلى تفعيل التيارات البوتاسيوم الجهد مسور. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> الشكل 5. أمثلة من تسجيل البيانات المقترنة. (A) تسجيل من مخروط الجهد بوابات الكالسيوم الحالي (المخروط أنا كا </sUB&gt;) ردا على خطوة ميللي ثانية 100 إلى -10 بالسيارات من المحتمل عقد -70 بالسيارات (المخروط V م). تم طرح التسرب والسعة العابرين باستخدام تسرب الطرح بروتوكول P / 8. A سريع مثير آخر متشابك الحالية (EPSC؛ HC PSC) تم تسجيلها في وقت واحد من خلية الأفقي، وتبين أن هذه الخلايا اثنين تقترن synaptically (B) وقد سجل EPSC في خلية ثنائي القطب قبالة ردا على نفس الحوافز في بلد آخر. مخروط.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation at JoVE.com

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) وشرح كيفية استخدام هذه الشرائح لدراسة تجهيز متشابك في شبكية العين عن طريق الحصول مزدوج كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد من خلايا مستقبلة للضوء والخلايا الأفقية وثنائي القطب من الدرجة الثانية.

في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of Nebraska Medical Center. نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر ( Ambystoma tigrinum) وشرح كيفية استخدام هذه الشرائح لدراسة تجهيز متشابك في شبكية العين عن طريق الحصول مزدوج كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد من خلايا مستقبلة للضوء والخلايا الأفقية وثنائي القطب من الد...

Video: Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

الدماغ شريحة Biotinylation: و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; النهج لقياس منطقة محددة بلازما بروتين غشاء الاتجار الكبار الخلايا العصبية

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

خلية كاملة تسجيلات التصحيح، المشبك من Morphologically- وحددت Neurochemically-الحصين Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

تقرن تسجيلات خلية كاملة في عضوي شرائح الحصين

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

الطريقة الكهربية لالردود تسجيل بين الخلايا الجهد ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء وInterneurons إلى النور المحفزات<em&gt; في فيفو</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...