وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (WE849/16 1 / 2 الى دينار وRW). ونحن ممتنون ليولر توماس (Töbingen والمانيا) لتحفيز QDS البرامج الخفيفة.

الوصف التالي يفترض أن لديه فهم المجرب الأساسية للبنية شبكية العين ، وتسجيل التصحيح ، المشبك ، والفحص المجهري لمدة الفوتون. للحصول على معلومات مفيدة حول إنشاء وتشغيل الإعداد التصحيح ، المشبك واثنين من الفوتون نظام التصوير نرى الحكام [7-12]. 1. الأنسجة الحيوانية وإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الماوس مظلمة مكيفة لا يقل عن 3 ساعة في غضون ذلك ، وإعداد 1-2 لتر من حل خارج الخلية التي تتكون من (مم) 125 كلوريد الصوديوم ، و 2.5 بوكل ، 1 CaCl 2 و 1.6 MgCl 2 و 25 NaHCO 3 و 10 مد الجلوكوز ويوازن إلى 7.4 درجة الحموضة بالغاز مع كربوجين (CO 2 5 ٪ في O 2) في درجة حرارة الغرفة. </li> a <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس في غرفة محكمة الغلق بواسطة جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون 2 تليها خلع عنق الرحم. يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء ، والخطوات التالية في الظلام. استخدام خافت الإضاءة طويلة الموجة (نحن كتلة موجات قصيرة من مصدر ضوء بارد من قبل 690 نانومتر longpasفلتر) لدعم رؤية شخصية مع الحفاظ على أعين الحيوان مظلمة مكيفة (الفئران لا تملك إلا ضعف البصر في الجزء الأحمر من الطيف الضوء). لاستكمال العمل في إنارة الظلام استخدام الأشعة تحت الحمراء (&gt; 800 نانومتر) ، وارتداء نظارات للرؤية الليلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عيون استأصل مع زوج من مقص القزحية المنحنية ونقلها إلى طبق من حل خارج الخلية وضعت تحت مجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القرنية والجسم الهدبي من خلال فتح العين على طول لمبة أورا مشرشر (على الحدود بين الشبكية والجسم الهدبي) مع زوج من مقص الربيع (التي نستخدمها لأول مرة لانسيت اختراق نقطة انطلاق لعدة قطاعات). تأخذ بها العدسة والشبكية منفصلة بعناية من الظهارة الصبغية. إذا كان التوجه للشبكية أمر حاسم لدراستك ، تشير إلى أنه في مثل المرجع [12]. قطع العصب البصري بين شبكية العين والبشرة وإزالة صبغة الشبكية من فنجان العين. لاحظ اتجاه الأسطح الشبكية : داخل الشبكية كرة لولبية من المتابعة هو ganglايون الجانب الخلية ؛ الخارج هو الجانب مبصرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجسم الزجاجي من سطح الشبكية الداخلية عن طريق سحب بلطف تشغيله مع المعونة من مسواك خشبي. لهذا الغرض ، واستخدام وحدة تخزين صغيرة من حل خارج الخلية التي تغطي فقط في شبكية العين. ويمكن سحب العصي الزجاجي إلى مسواك وcentrifugally قبالة الشبكية. ثم ، وتطبيق شقوق قصيرة على طول محيط الشبكية لتسهيل التسوية من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكية الى غرفة تسجيل مبصرة ، الجانب السلبي ، تنتشر بها على أسفل الزجاج (نستخدم فرشاة غرامة) ، وذلك مع شل النايلون موتر إطار من الفولاذ المقاوم للصدأ. تعد الثانية في شبكية العين بنفس الطريقة وابقائه في الظلام مكيفة حل carboxygenated خارج الخلية لاستخدامها لاحقا. </li></ol> 2. التسجيلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت غرفة تسجيل في الظلام تحت مجهر المسح الضوئي والليزر تستقيم superfuse إعداد الشبكية باستمرار (لا تقل عن 5 مل / ميلن) مع الحل خارج الخلية carboxygenated تسخينها إلى 35 درجة مئوية. يقع المجهر (مجهزة أيضا مع كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء الحساسة CCD) على امتصاص الصدمات الجدول الهواء داخل قفص فاراداي لالتدريع الالكترونية. تغطية القفص مع ستارة غير شفافة للحفاظ على إعدادها في الظلام. نحن أيضا إيقاف شاشة الضوء من شاشات الكمبيوتر التي فيلم شفافة حمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف ليزر الأشعة تحت الحمراء ل850-870 نانومتر أو الموجات الأطول ، والتحول إلى وضع شرط تأمين ، واستخدام اثنين من الفوتون الإثارة لتصور GFP ، معربا عن الخلايا. التخفيف من انتاج الليزر باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة التي تسيطر عليها الليزر برنامج المسح وصولا الى درجة غير كافية لمجرد اعتراف واضح من الخلية الفلورسنت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن التصحيح ، المشبك التسجيلات الجاري في وضع الزجاج المشبك micropipettes استخدام (البورسليكات نستخدم أنابيب زجاجية قطرها 1.5 مم الخارجي ، وسمك الجدار 0.225 ملم) مليئة حل الخلايا التي تتكون من (مم) 125 K - غلوكونات ، 10 بوكل ، 0.5 EGTA ، 10 HEPES ، معاير لدرجة الحموضة 7.4 مع KOH (إعطاء المقاومة ماصة من حوالي 5 MΩ). علما أن ظروف تجريبية أخرى مثل الجهد المشبك تسجيل تتطلب حلا مختلفا. إذا المطلوب حقن الصبغة ، إضافة مسبار فلوري (10 ملي نستخدم اليكسا فلور 594) أو جزيء التتبع (3 ٪ Neurobiotin). إدراج micropipette في ماسك وتأكد من أن الإلكترود المرجعي (المكلورة الأسلاك الفضية) في اتصال مع حل خارج الخلية في غرفة تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضغط على micropipette واستهداف GFP ، معربا عن الخلية (نستخدم الغمر بالماء 40 أضعاف الهدف ؛ NA 1.25). وتقع أجسام الخلايا عديم الاستطالات في طبقة الخلايا العقدية (تحت السطح مباشرة في التوجه الحالي في شبكية العين) وكذلك في الجزء القريب من الطبقة النووية الداخلية (حوالي 55-75 ميكرومتر في أعماق الإعداد). قبل micropipette الاتصال مع الخلية المستهدفة ، ويحد من الغشاء الداخلي (غمد مصنوع من endfeet الدبقية) في شبكية العينالسطح يجب أن يكون اخترق. ومن المسلم به الاختراق الناجحة التي قام بها حل الخلايا التي يتم طردهم من طرف micropipette ويفصل الغشاء الداخلي يحد من أنسجة الشبكية الأساسية كما يمكن ملاحظتها على صورة انتقال الأشعة تحت الحمراء التي تلتقطها كاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهج الخلية المطلوبة من خلال مقارنة موقف سوما من صورة ثنائية الفوتون مع صورة للكاميرا الأشعة تحت الحمراء لاتفاقية مكافحة التصحر التي تبين موقف micropipette التسجيل. علما بأن هذه الخطوة لا يتحقق بسهولة ، ويتطلب بعض الممارسة ، لأن الخلية GFP ، معربا عن أن تكون معترف بها في نقل صورة الأشعة تحت الحمراء من أجل توجيه micropipette تجاهها. ويتم تحقيق الاستهداف الصحيح عند الحافة micropipette الأسباب التنقير من سطح الخلية والتي يمكن مشاهدتها في صورة ثنائية الفوتون. بديل لهذا الإجراء ، واستخدام صبغة الفلورسنت (مثل اليكسا فلور 594 ، 100 ميكرون) في حل الخلايا للكشف عن موقف micropipette في صورة ثنائية الفوتون. ثنائي الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء يسمح مضان كافية من هذه الصبغة لجعل micropipette ملحوظ. لهذا الغرض ، وضبط نطاق الكشف في برنامج المسح بالليزر ليشمل أيضا مضان أحمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن ضغوط من micropipette والحصول على كامل الخلية التصحيح ، المشبك التكوين في وضع المشبك الجاري. وينبغي أن تعطي تسجيل صالحة للاستعمال إمكانات غشاء -50 إلى -55 بالسيارات ومشاركة ما لا يقل عن 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المثيرات البصرية الحالية إنشاؤها بواسطة برنامج التحفيز (نستخدم QDS التي يولر توماس ، من جامعة توبنغن ، ألمانيا) 11 على جهاز الكمبيوتر. ضبط الموضع المكاني للتحفيز أن تركز على الخلية المسجلة : مارك موقف الخلية تظهر على الشاشة صورة انتقال الكاميرا IR - CCD ومركز حافزا الموضعية مثل على ذلك. ضبط كثافة التحفيز عن طريق إدراج مرشحات الكثافة محايدة في مسار الشعاع. لمعايرة رصد الطيف وكثافة انظر المرجع [14]. اختيار prolongeد interstimulus الفاصل الزمني (على سبيل المثال 15 ق) لتجنب التكيف. وتشمل الضوئي ضمن مسار شعاع للحفاظ على سجل توقيت التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بروتوكول بدء التحفيز وتسجيل ردود الخفيفة (نستخدم معدل أخذ العينات من 10 كيلوهرتز مع تصفية عند 5 كيلو هرتز لغير التشويك الخلايا ؛ لتسجيل ارتفاع ينصح ارتفاع معدل أخذ العينات مثل 20 كيلو هرتز). استخدام برنامج التحفيز ضوء لتشغيل برنامج تسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصبغ ملء السماح للعامل الفلورسنت منتشر في الخلية المسجلة ل30-45 دقيقة قبل أن يتراجع بعناية micropipette من الخلية. الحرص على عدم سحب خلايا الجسم. إذا تم استخدام غير الفلورسنت Neurobiotin التتبع ، فإنها بحاجة إلى التصور من قبل ملزمة لstreptavidin مترافق إلى fluorophore (نستخدم streptavidin - Cy3 ، 1:400 أكثر من ليلة عند 4 درجة مئوية بعد 20 دقيقة من التثبيت بارافورمالدهيد الشبكية ؛ لاقتران صباغة ويمكن إطالة الدراسات streptavidin الحضانة إلى 3 د). بدلا من ذلك ، يمكن أيضا أن يؤديها مع الحقنأقطاب حادة (&gt; 100 MΩ) عندما يتم دفع الصبغة iontophoretically في الخلية مخوزق (البقول مستطيلة : ،25-1 NA ، و 100 مللي ، 100 مللي الفاصل ، مجموع الوقت 3-6 دقائق). </li></ol> 3. ممثل النتائج : النتائج التالية تنشأ من الدراسة على الماوس التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت مروج للهيدروكسيلاز التيروزين 13،14 ، الانزيم تحفيز معدل الحد خطوة في التوليف الكاتيكولامينات (TH : GFP الماوس). استنادا إلى سطوع GFP اشارة المجموعتان خلية متميزة ومميزة (الشكل 2A). خلايا التعبير عن المستوى العالي GFP تمتلك أجسام الخلايا الموجودة في الطبقة النووية الداخلية (INL ، الشكل 2A) أو المشردين في طبقة الخلايا العقدية (GCL ، الشكل 2B) وتطبق في منتصف طبقة ضفيري الداخلية (IPL ، الشكل 2C) . وحددت على أنها خلايا من النوع 2 14-16 ويمكن أن تدرس بشكل منهجي فيما يتعلق مورفولوجيا (الشكل 3) والمنتخبالنشاط rical (الشكل 4) على الرغم من كثافة سكانها سوى مبالغ إلى 250 خلية / مم 2. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig1.jpg" /> الشكل 1. التمثيل التخطيطي من الإعداد التجريبية. ثنائي الفوتون الإثارة (أحمر مسار الضوء منقط) من fluorophore - معربا عن الخلايا في شبكية العين سليمة تمكن البصرية التي تستهدف من قبل micropipette (مسار الضوء الأخضر الانبعاثات). يتعرض للمؤثرات البصرية الشبكية عبر المكثف المتوقع من المجهر (أصفر مسار الضوء) ، وتسجل ردود ضوء الخلوية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig2.jpg" /> الشكل 2. GFP ، معربا عن الخلايا في شبكية العين من flatmount TH : GFP الماوس. ويمكن التمييز بين اثنين من السكان من قبل سطوع الإشارات GFP : 1 نوع الخلايا (خلايا DA) الموجود في INL تظهر مضان ضعيفة (A ، انظر السهام) ونوع الخلايا المسمى مكثف 2مع الهيئات الخلية إما في INL (A ، انظر سهام) أو المشردين في GCL (B) والتراتب شجيري في S3 الطبقة من الشعيرات (C). أشرطة النطاق ، 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig3.jpg" /> الشكل 3. المورفولوجيا خلية من النوع 2 حقنوا Neurobiotin التتبع. كان تصور التتبع لاحقا من قبل streptavidin - Cy3 ملزمة (قرمزي). ومجهرية ، وهو يصور أيضا إشارة GFP (أخضر) ، هو الإسقاط من مداخن صورة تغطي GCL والشعيرات. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3457/3457fig4.jpg" /> الشكل 4. ردود ضوء خلية من النوع 2 الموجود في GCL. نمط الاستجابة إلى الأبيض إنارة كامل الحقل ضوء الكثافة المتزايدة في مجموعة ظلامية. ويرد في كثافة التحفيز photoisomerizations في قضيب في الثانية الواحدة (ره * / قضيب / ثانية). تم استخدام التحفيز لفترات طويلة من 3 ليالي لأفضل متميزةايون من مكونات الاستجابة عند بدء التحفيز (ON الاستجابة) ويقابلها (إيقاف الاستجابة).

<ol>
	<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+plan+of+the+retina.">The fundamental plan of the retina.</a> Nat. Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li><li>Baccus, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+computation+in+inner+retinal+circuitry.">Timing and computation in inner retinal circuitry.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 271-290 (2007).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wässle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Siegert, S., Gross-Scherf, B., Del Punta, K., Didkovsky, N., Heintz, N., Roska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat. Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Euler, T., Detwiler, P. W., Denk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directionally+selective+calcium+signals+in+dendrites+of+starburst+amacrine+cells.">Directionally selective calcium signals in dendrites of starburst amacrine cells.</a> Nature. 418, 845-852 (2002).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (1995).</li><li>Jackson, M. B., Gerfen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+voltage+clamp+recording.">Whole-cell voltage clamp recording.</a> Current Protocols in Neuroscience. , (1997).</li><li>Majewska, A., Yiu, G., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system.">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pf&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 441, 398-408 (2000).</li><li>Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> maging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , (2005).</li><li>Euler, T., Hausselt, S. E., Margolis, D. J., Breuninger, T., Castell, X., Detwiler, P. B., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyecup+scope+-+optical+recordings+of+light+stimulus-evoked+fluorescence+signals+in+the+retina.">Eyecup scope - optical recordings of light stimulus-evoked fluorescence signals in the retina.</a> Pfl&#252;gers Arch. - Eur. J. Physiol. 457, 1393-1414 (2009).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat. Protoc. 5, 1347-1352 (2010).</li><li>Matsushita, N., Okada, H., Yasoshima, Y., Takahashi, N., Kiuchi, K., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+tyrosine+hydroxylase+promoter+activity+during+midbrain+dopaminergic+neuron+development.">Dynamics of tyrosine hydroxylase promoter activity during midbrain dopaminergic neuron development.</a> J. Neurochem. 82, 295-304 (2002).</li><li>Knop, G. C., Feigenspan, A., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+underlying+the+ON-OFF+light+responses+of+type+2+wide-field+amacrine+cells+in+TH-GFP+mice.">Inputs underlying the ON-OFF light responses of type 2 wide-field amacrine cells in TH-GFP mice.</a> J. Neurosci. 31, 4780-4791 (2011).</li><li>Zhang, D. Q., Stone, J. F., Zhou, T., Ohta, H., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+genetically+labeled+catecholamine+neurons+in+the+mouse+retina.">Characterization of genetically labeled catecholamine neurons in the mouse retina.</a> Neuroreport. 15, 1761-1765 (2004).</li><li>Contini, M., Lin, B., Kobayashi, K., Okano, H., Masland, R. H., Raviola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+input+to+ON-biploar+cells+onto+the+dopaminergic+neurons+of+the+mouse+retina.">Synaptic input to ON-biploar cells onto the dopaminergic neurons of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 518, 2035-2050 (2010).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).</li><li>Dedek, K., Breuninger, T., de Sevilla M&#252;ller, L. P., Maxeiner, S., Schultz, K., Janssen-Bienhold, U., Willecke, K., Euler, T., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+type+of+interplexiform+amacrine+cell+in+the+mouse+retina.">A novel type of interplexiform amacrine cell in the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 30, 217-228 (2009).</li><li>Denk, W., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+light-evoked+calcium+signals+in+the+functionally+intact+retina.">Optical recording of light-evoked calcium signals in the functionally intact retina.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 7035-7040 (1999).</li></ol>

وقد تم التعامل مع الفئران والموت الرحيم وفقا لمبادئ توجيهية مؤسسية لرعاية الحيوان والقوانين المتعلقة التجارب على الحيوانات التي تصدرها الحكومة الألمانية.

هذا الأسلوب يتيح إمكانية لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا العصبية المحددة في الشبكية سليمة تحت إشراف البصرية دون التأثير على حالة adaptational الشبكية. هي مناسبة خاصة وأنها لتوصيف الخلايا التي هي في الوقت الحاضر بدلا درس سيئة بسبب الكثافة السكانية المنخفضة مثل معظم السكان من الخلايا عديم الاستطالات. ثنائي الفوتون الإثارة تصاريح التصوير عالية الدقة وعالية التباين ، وحتى من أعمق أجزاء من الأنسجة 17 ، شرطا مسبقا لاستهداف دقيقة وناجحة التصحيح - لقط من خلايا خاصة في INL مع كثافة عالية من الهيئات الخلية. شبكية العين هي معزولة الماوس قابلة للح 3-4 في ظل الظروف التجريبية. إذا تم تخزين شبكية العين الثانية في ظلام دامس تحت بالغاز كربوجين مستمرة ، فإنه يحتفظ اللون الأرجواني من صباغ متبدل بالضوء غير المبيض ، ويمكن استخدامها بعد الانتهاء من التجارب على شبكية العين الأولى. في البداية ، واستهدافالخلية المحددة مع micropipette wholemount في شبكية العين قليلا تحديا ويتطلب بعض الممارسة ، وخصوصا عندما تعمل في الظلام. يمكن بما في ذلك صبغة الفلورسنت في micropipette تبسيط الإجراءات ، وذلك لأن الخلية وmicropipette مرئية تحت ثنائية الفوتون الإثارة في نفس الوقت. ومع ذلك ، قد إضافة مكونات إلى حل بين الخلايا يعرقل تشكيل gigaseal أو التسبب في جودة التسجيل للمعاناة. مرة واحدة حققت بنجاح ، يمكن تسجيل جيدة للمشاركة حوالي 1 ساعة. في حين أن ضوء الأشعة تحت الحمراء هي سيئة الإثارة فقط استوعبت نفسها مبصرات الشبكية ، متحمس GFP - معربا عن الخلايا ينبعث الضوء في الجزء المرئي من الطيف. ومع ذلك ، نحن متحمسون fluorophores فقط في حجم تنسيق والصغيرة التي ليس من المرجح أن تغير الشرط adaptational من شبكية العين. وهناك حاجة فقط عن أكثر ، والإثارة لاستهداف ويمكن مغلقا خلال تسجيل الاستجابات الخفيفة. وusefulnويتجلى بالفعل وفاق سطيف لهذا النهج من الدراسات على فئات معينة من السكان من الخلايا التي عديم الاستطالات 14،18 من التسجيلات الكهربية لولاها لكان ممكنا فقط عن طريق الصدفة 12. أخيرا ، يمكن أيضا أن تكون هذه التقنية القوية التي تقدمها بما في ذلك اتباع نهج الدوائية 14 ، كا 2 + 19 أو التصوير باستخدام خلايا حقن للدراسات immunocytochemical أو المجهر الإلكتروني. بهذه الطريقة ، يمكن كشف موقف الوظيفية من نوع خلية معينة في الدوائر الشبكية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> كاشف / جهز السالح </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> نظارات للرؤية الليلية </td><td> Gutzeit محدودة ، Warthausen وألمانيا </td><td> Xtron F1 </td><td> يتضمن مصدر الضوء 800 نانومتر </td></tr><tr><td> تصفية البصرية </td><td> شوت ، ماينز ، ألمانيا </td><td> RG9 </td><td> longpass فلتر مع قطع تبلغ 690 نانومتر </td></tr><tr><td> مقص القزحية </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 14061-09 </td><td> منحني مع النصل 22 مم </td></tr><tr><td> مقص الربيع </td><td> أدوات العلوم غرامة </td><td> 15000-00 </td><td> مستقيم مع شفرة 3 ملم </td></tr><tr><td> غرفة تسجيل </td><td> وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا </td><td> 200-100 500 0180 نوع A (TC) </td><td> تفلون مع غرفة أسفل محمولة على الزجاج زلة تغطية (حوالي 0.15 ملم ، 500 رقم 0182 200-100) </td></tr><tr><td> تدفق سخان </td><td> نظم متعددة ، ريوتلنجن وألمانيا </td><td> PH01 ، TC01 </td><td> مع صفيحة تسخين قنية التروية مع درجة الحرارة لياليودرجة الحرارة وحدة تحكم إنسور </td></tr><tr><td> مجهر المسح الضوئي ليزر </td><td> لايكا مايكروسيستمز </td><td> DM LFS </td><td> متحد البؤر التي تسيطر عليها برامج لايكا </td></tr><tr><td> الجدول الهواء </td><td> نيوبورت </td><td> VH - 3036W الأراضي الفلسطينية المحتلة </td><td></td></tr><tr><td> الليزر </td><td> الأطياف ، الفيزياء </td><td></td><td> الوضع غير الساحلية تسونامي تي : ليزر الياقوت </td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> AG PCO ، Kelheim وألمانيا </td><td> PixelFly QE </td><td> بما في ذلك البرمجيات السيطرة </td></tr><tr><td> Micropipette الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> Hilgenberg ، Malsfeld وألمانيا </td><td> 1408411 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette مجتذب </td><td> سوتر الصك </td><td> P - 97 </td><td></td></tr><tr><td> الكسا فلور 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A - 20004 </td><td> صبغة الفلورسنت </td></tr><tr><td> Neurobiotin </td><td> Axxora </td><td> VC - SP - 1120 - M050 </td><td> غير الفلورسنت التتبع </td></tr><tr><td> Streptavidin - Cy3 </td><td> Dianova </td><td> 016-160-084 </td><td></td></tr><tr><td> هيئة التصنيع العسكريromanipulator </td><td> وLuigs نيومان محدودة ، Ratingen ، ألمانيا </td><td> 210-100 000 0010 </td><td> بمحركات Mini25 حدة تتلاعب مع عرض SM - 5 </td></tr><tr><td> التصحيح ، المشبك مكبر للصوت </td><td> NPI الإلكترونية محدودة ، تام ، ألمانيا </td><td> SEC - 05LX NPI </td><td></td></tr><tr><td> التحويل الرقمي </td><td> الصكوك الوطنية </td><td> BNC - 2090 </td><td></td></tr><tr><td> الحصول على البيانات البرمجيات WinWCP </td><td> جون ديمبستر ، جامعة اسكتلندا ، غلاسكو ، المملكة المتحدة </td><td></td><td> http://spider.science.strath. ac.uk / sipbs / software.htm </td></tr><tr><td> QDS التحفيز البصري مولد </td><td> توماس أويلر ، جامعة توبنغن في ألمانيا </td><td></td><td> يجب أن تعمل على كمبيوتر منفصل التحكم 2 مراقبين (واجهة المستخدم ، ورصد الحوافز) </td></tr><tr><td> مرشحات الكثافة محايدة </td><td> ITOS ، ماينز ، ألمانيا </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electrophysiological characterization of gfp-expressing cell populations in the intact retina

دراسة الخصائص الفيزيولوجية واتصالات متشابك معينة من الخلايا العصبية في أنسجة سليمة يشكل تحديا لتلك الخلايا التي تفتقر إلى السمات المورفولوجية واضح أو إظهار كثافة السكانية المنخفضة. هذا ينطبق بشكل خاص على الخلايا الشبكية عديم الاستطالات ، وهي فئة استثنائية في interneurons المتعددة الأشكال والتي تضم ما يقرب من 30 في الثدييات فرعية 1. على الرغم من كونها جزءا مهما من معالجة البصرية من خلال وضع الإخراج الشبكية 2 ، لم تكن معظم هذه الأنواع الفرعية درست حتى الآن في سياق وظيفي لمواجهة هذه الخلايا مع القطب تسجيل هو حدث نادر. في الآونة الأخيرة ، عدد كبير من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تتوفر علامات التعبير عن بروتين فلوري مثل الفلورسنت الأخضر (GFP) تحت سيطرة المروجين لمستقبلات الغشاء أو الانزيمات التي هي محددة لمجموعة فرعية فقط من الخلايا العصبية في نسيج معين 3،4. هذه الخلايا ما قبل المسمى بالتالي فهي accessibl<html> ه لتوجيه microelectrode استهداف تحت السيطرة المجهرية ، والسماح للدراسة منهجية خصائصها الفسيولوجية في الموقع. ومع ذلك ، ويرافق إثارة علامات الفلورسنت من خطر الضيائية للأنسجة الحية. في شبكية العين ، ويعوق هذا النهج بالإضافة إلى المشكلة التي تسبب الإثارة ضوء التحفيز المناسب للمبصرات مما كبد صباغ متبدل بالضوء تبيض ونقل الدوائر الشبكية في حالة الضوء مكيفة. يتم التغلب على هذه العوائق باستخدام الأشعة تحت الحمراء الإثارة التي تقدمها ليزر وضع تخوض نبضات قصيرة من نطاق الفيمتو ثانية. الإثارة ثنائي الفوتون يوفر طاقة كافية لاستثارة fluorophore ، وفي الوقت نفسه يحد من الإثارة إلى وحدة تخزين صغيرة الأنسجة التقليل من مخاطر photodamage 5. أيضا ، فإنه يترك الشبكية تستجيب لمحفزات بصرية منذ ضوء الأشعة تحت الحمراء (&gt; 850 نانومتر) هو ضعيف فقط تمتصه photopigments 6. ق = &quot;jove_content&quot;&gt; نحن في هذه المقالة لشرح استخدام الفأرة في شبكية العين وراثيا لتحقيق الكهربية في تسجيلات الموقع من GFP ، معربا عن الخلايا التي يتم استهداف بصريا من قبل اثنين من الفوتون الإثارة. مستعدة شبكية العين والمحافظة عليها في الظلام ويمكن أن يتعرض للمؤثرات الضوئية التي يتوقع عبر المكثف من المجهر (الشكل 1). ويمكن الجمع بين التصحيح ، المشبك تسجيل الاستجابات ضوء صبغ مع ملء الكشف عن التشكل وصبغ للتحقق من مفرق بوساطة الفجوة اقتران إلى الخلايا المجاورة ، بحيث يمكن دراستها من قبل الخلية الهدف على مستويات مختلفة التجريبية.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina at JoVE.com

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتشكل.

توصيف بالسكان خلية كهربية من GFP - يعرب عن السليمة في الشبكية

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

electrophysiological-characterization-gfp-expressing-cell-populations

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  University of Oldenburg. هذا المقال يصور تسجيل الخلايا العصبية الفردية من السكان الموسومة fluorescently في الشبكية الماوس سليمة. باستخدام اثنين الفوتون الإثارة الأشعة تحت الحمراء تم استهداف الخلايا المسمى transgenetically عن التصحيح ، المشبك تسجيل لدراسة ردودهم الخفيفة ، وخصائص الحقل تقبلا ، والتش...

Video: Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Developmental Biology

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

Electroporation في الجسم الحي وخارج الرحم للتعبير الجينات في خلايا الشبكية العقدة ماوس

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Biology

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

طرق التصوير المناعى والكالسيوم في Wholemount الجرذ الشبكية

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

خلية واحدة من الحمض النووي الريبي-سيك من مجموعات فرعية محددة من خلايا العقدة الشبكية

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

تقييم نشاط الكالسيوم في طبقة خلايا العقدة الشبكية

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the impaired light-sensing photoreceptor cells in the degenerated retina, aiming to partially restore vision by inducing visual percepts. One common avenue of investigation involves the design and production of implantable devices with a flexible physical structure, housing a high number of electrodes. This enables the efficient and precise generation of visual percepts. However, with each technological advancement, there arises a need for a reliable and manageable ex vivo method to verify the functionality of the device before progressing to in vivo experiments, where factors beyond the device's performance come into play. This article presents a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer (GCL) following electrical stimulation. Specifically, the following steps are outlined: (1) fluorescently labeling the rat retina using genetically encoded calcium indicators, (2) capturing the fluorescence signal using an inverted fluorescence microscope while applying distinct patterns of electrical stimulation, and (3) extracting and analyzing the calcium traces from individual cells within the GCL. By following this procedure, researchers can efficiently test new stimulation protocols prior to conducting in vivo experiments.

تسليط الضوء على المؤلف: نهج مبتكر للتحفيز الكهربائي العصبي باستخدام تصوير الكالسيوم 

Retinal prostheses have the ability to generate visual perceptions. To advance the development of new prostheses, ex vivo methods are needed to test devices before implantation. This article provides a comprehensive protocol for studying calcium activity in the retinal ganglion cell layer when subjected to electrical stimulation.

تصوير الكالسيوم في شبكية العين المسطحة المحفزة كهربائيا

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...