This work was supported by NIH R01 EY020533, WSU Startup Fund, and RPB grants.

بيان الأخلاق: إجراءات التي تجرى على الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة واين ستيت. 1. إعداد الحل التجريبي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تشريح 1 يوم ل1 قبل أسبوع من التجربة الفعلية. استخدام حل العازلة HEPES للتشريح في شبكية العين بسبب قدرته التخزين المؤقت قوية في درجات حرارة منخفضة 16. تخلط جميع المواد الكيميائية على النحو التالي (مم): 115 كلوريد الصوديوم، و 2.5 بوكل، 2.5 CaCl 2، 1.0 MgCl 2، 10 HEPES، 28 الجلوكوز. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. إبقاء الحل في الثلاجة تصل إلى 1 في الاسبوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل هو تسجيل أميس &quot;المتوسطة، وهو السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF) مصممة لالاستعدادات الشبكية 17. قبل يوم من التجربة، تزن من مسحوق أميس &quot;(4.4 ز ل 500 مل من محلول) في أنبوب. أيضا، تزن من NaHCO 3 (0.95 ز ل 500 مل من محلول) وتخلط مع Aمسحوق زارة التربية والعلم &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ماصة داخل الخلايا للتسجيلات المشبك التصحيح من قبل يوم من التجربة. تخلط جميع المواد الكيميائية على النحو التالي (مم): 111 K-غلوكونات، 1.0 CaCl 2، 10 HEPES، 1.1 EGTA، 10 كلوريد الصوديوم، 1.0 MgCl 2، 5 ATP-المغنيسيوم، و 1.0 GTP-نا. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع KOH. تصفية الحل ماصة مع فلتر حقنة التقليدي. جعل ~ 500 مكل وتخزينها في الثلاجة أو الفريزر العميق. </li></ol> 2. إعداد لليوم للتجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الليلة التي سبقت التجربة، ضع الماوس في قفص (C57BL / 6J أو خلفية مماثلة، من 4 - 8 أسابيع من العمر، من الذكور) في مكان مظلم لO / N التكيف مع الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادا لتشريح: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء تشريح الحل (100-200 مل) في كوب من الزجاج، وضعه على الجليد، وفقاعة مع الأكسجين لمدة 10 دقيقة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الأوكسجين من مربع مظلم لتخزين إعداد الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد coverslips من البلاستيك مع القضبان الشحوم لإعادةالاستعدادات شريحة tinal ووضع كل منهم في طبق من البلاستيك 35 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق شفرة حلاقة جديدة إلى المروحية (تقطيع الأنسجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع غشاء مرشح إلى نصفين. هذا هو لتشريح شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة أدوات تشريح والماصات نقل قرب المجهر تشريح. يجب تنظيم منطقة العمل جيدا بحيث يكون لكل أداة يمكن الوصول إليها بسهولة في الظلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعدادا لتسجيلات المشبك التصحيح: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل مسحوق أميس &quot;وNaHCO 3 في الماء المقطر (أميس 4.4 غرام وNaHCO 3 0.95g / 500 مل DDH 2 O). متوسطة فقاعة أميس &quot;مع الأكسجين المختلط (95٪ O 2 و 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة على الأقل بينما التدفئة إلى مستوى درجة حرارة تسجيل (~ 35 ° C). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع NaHCO 3 في حين لا يزال محتدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الحل ماصة الداخلي أثناء تشريح. بعد إذابة ذلك، إضافة 0.01٪ sulforhodamine B لتلطيخ الخلايا. </li></ol></li></ol> 3. الشبكية تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة مظلمة، الموت ببطء الماوس باستخدام ثاني أكسيد الكربون واسترواح الصدر الثنائي. بعد 2-3 دقائق من استخدام ثاني أكسيد الكربون، فإن الماوس يفقد وعيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الماوس لم يعد يستجيب لقرصة الذيل، واستأصل بسرعة عيون ووضعها في محلول تشريح الباردة في طبق من البلاستيك. أداء استرواح الصدر الثنائي لضمان موت الحيوان. تخزين بسرعة العين في طبق في مربع مظلم. استخدام المشاهد الأشعة تحت الحمراء لاجراء العملية في الظلام. ملاحظة: بدلا من ذلك، الأيزوفلورين، قطع الرأس، أو خلع عنق الرحم يمكن أن تستخدم للقتل الرحيم. طريقة القتل الرحيم ينبغي أن يتبع المبادئ التوجيهية للمعهد الوطني للصحة (NIH) و / أو لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة مظلمة، وضبط مجهر تشريح وإضاءة الأشعة تحت الحمراء. تحت المجهر، ونقل العين من طبق لها في طبق من البلاستيك 10 سم ثإيث الحل تشريح تبرد. باستمرار الأكسجين فقاعة من خلال أنابيب توضع على الجزء السفلي من صحن بلاستيكي. ضبط حجم التدفق حتى لا يكون منخفضا جدا، ولكن تأكد من أنها ليست عالية بما يكفي لتعكير صفو تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القرنية والعدسة إزالة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في الجزء العلوي من القرنية بسكين الجراحية الصغرى. عقد العصب البصري في الطرف الآخر من مقلة العين يمنع العين من التحرك. تمديد خفض باستخدام زوج من مقص جراحي. قطع القرنية مع بعض الصلبة من حوله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على العدسة مع ملقط غرامة وسحب ببطء عدسة بها. إذا كان الجسم الزجاجي لزجة جدا لإزالة العدسة، وقطع الجسم الزجاجي مع زوج من مقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم العين كوب، صب بلطف البارد، حل تشريح المؤكسج إلى فنجان العين مع ماصة نقل صغيرة. ملاحظة: إن مقلة العين تفرغ بسرعة بعد يتم إجراء شق في القرنية. فمن المهم للحفاظ على شكل العين كما التشويه العين خلال هذه المواليةسوف التعريف الشخصي إجراءات تلف شبكية العين ويسبب انفصال الشبكية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعرف على الجانبين الظهرية والبطنية من شبكية العين: ملاحظة: بسبب التوزيع غير المتكافئ للالأخضر والأشعة فوق البنفسجية (UV) والأقماع 18، وتحديد منطقة الشبكية محددة أمر مهم للتسجيلات استجابة الخفيفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد خط الذهاب عبر كوب العين الشبكية يمر بالقرب من رأس العصب البصري. هذا الخط يمر معظمها عبر الجانب البطني العصب البصري. الجانب بما في ذلك العصب البصري هو الجانب الظهري، في حين أن الآخر هو بطني 19. رؤية هذا المعلم بوضوح تحت المشاهدين الأشعة تحت الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على الغرض من التجربة، اجراء خفض على الجانب لا داعي لها. هذا وسوف يكون من المفيد بعد عزل شبكية العين من الكأس العين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة زجاجي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، واحتضان العين كوب مع هيالورونيداز (0.5 ملغ / مل) لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجسم الزجاجي مع ملقط خارج غرامة. الجسم الزجاجي هو أساساتعلق على الجزء السفلي والحافة الخارجية للعين كوب. بلطف إزالته دون لمس أو بدس شبكية العين. كما يمكن أن تعلق زجاجي محكم لفنجان العين، وإزالة بلطف لتجنب انفصال الشبكية من العين الكأس. مواصلة سحب حتى يشعر أي توتر. ملاحظة: هذه الخطوة مهمة بشكل خاص لتشريح شبكية العين الماوس؛ ومع ذلك، فإنه ليست مشكلة لشبكية العين من الأنواع الأخرى مثل الفئران أو السمندل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل شبكية العين من العين الكأس. انتزاع الصلبة وتقشر بلطف شبكية العين باستخدام مساعدات من الملقط. ملاحظة: الجامع جبل الاستعدادات الشبكية يمكن أن تكون مصنوعة من شبكية العين معزولة. جعل 3-4 تخفيضات على حواف وتتسطح في شبكية العين، أو قطع الشبكية إلى عدة قطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم شبكية العين وتجاهل النصف غير الضروري للشبكية العين (الخطوة 3.5). في نفس طبق من البلاستيك، وقطع في الشبكية المتبقية إلى قطعتين. لكل قطعة من شبكية العين، وقطع الحواف لجعللوح شبكية العين، وتقليم حواف للطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل لوح شبكية العين على طبق من ذهب الزجاج باستخدام ماصة نقل كبيرة (~ 2 مل). تمتص الحل الزائد مع ماصة صغيرة، استخدام قطعة من ورق الترشيح لشد بلاطة، وبعد ذلك وضعت بسرعة قطعة من الغشاء المرشح على رأس الأنسجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة نقل صغيرة، ضع قطرة من تشريح حل على غشاء التصفية. الانتظار ~ 15 ثانية حتى ينتشر الحل عبر الغشاء. خلال هذا الوقت، فإن أنسجة الشبكية التمسك غشاء التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب حل تشريح أكثر البارد تحت وحول المرشح. سوف الأنسجة الشبكية مع غشاء فلتر تطفو. الاستيلاء على غشاء التصفية مع ملقط ووضعه في غرفة تشريح. صب تشريح حل على الأنسجة، وتخزين إعداد في مربع مظلم. ملاحظة: الإجراء الموضح هنا أمر بالغ الأهمية. من المهم أن تنفيذ هذه الخطوات بسرعة لضمان أن العصي أنسجة الشبكية إلى ذاكرة فلتر<html> الغشاء ولا تجف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المروحية، وقطع الأنسجة الشبكية إلى شرائح. حوالي 200 ميكرون سمك هو ممكن للدراسات المشبك التصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة البلاستيك مع القضبان الشحوم في غرفة تشريح. نقل شريحة الشبكية على رأس القضبان الشحوم على ساترة البلاستيكية. تدوير شريحة 90 درجة بحيث المقطع العرضي مرئيا. اضغط على غشاء فلتر أسفل على ساترة، ثم، وتغطي الجانبين من ورقة الترشيح مع الشحوم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يجمد شريحة على ساترة البلاستيك، والاستيلاء على ساترة وتحويلها إلى طبق من البلاستيك 35 ملم. صب حل تشريح الباردة على إعداد الشبكية وغمر التحضير. تخزين كل طبق في مربع مظلم، التي ينبغي أن المؤكسج بشكل مستمر. ملاحظة: يحتاج هذا الإجراء بأكمله إلى أن يتم بعناية بحيث لا تشوه غشاء التصفية. خلاف ذلك، فإن شريحة الشبكية يفصل بسهولة من غشاء التصفية. </li></ol></li></ol>ق ق = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. تسجيلات المشبك من تصحيح الشبكية شريحة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل إعداد: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس وأنابيب نضح مع أميس &quot;المتوسطة. السماح لجميع فقاعات بالمرور عند ملء الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الماصات تسجيل المشبك التصحيح مع مجتذب. لملء ماصة مع الحل ماصة، وتراجع في المؤخر من ماصة لمدة 1 دقيقة حتى يتم ردم طرف ماصة. التالي، وملء ~ 1/3 من ماصة باستخدام حشو ماصة الدقيقة. تخزين كل ماصة في مربع ماصة رطبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل المعدات اللازمة لتسجيلات المشبك التصحيح. بما في ذلك الكمبيوتر، مكبر للصوت، وكاميرا CCD، والمجهر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق ضوء الغرفة. وضع إعداد شريحة الشبكية على غرفة مرحلة المجهر باستخدام المشاهد الأشعة تحت الحمراء. بعد ثبتوا عليه، والبدء نضح المستمر. ضبط درجة الحرارة نضح عند 33 إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض سطح شريحة مع كاميرا CCD. التركيز على موقع الهدف حيث الهدف مأنواع ليرة لبنانية يقيمون. حدد خلية صحية-تبحث عن التصحيح تسجيل المشبك (أي ينبغي أن يكون على نحو سلس المظهر السطحي وشكل خلية جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ماصة تسجيل في حامل ماصة. دفع ماصة لإعداد شريحة. عندما يكون على مقربة من إعداد شريحة (~ 2 مم أعلاه)، والعثور على غيض من ماصة مع المجهر. مرة واحدة طرف ماصة غير مرئية تحت المجهر، نقل معلومات سرية إلى أسفل نحو الخلية المستهدفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مكبر للصوت. ضبط ماصة في 0 بالسيارات / 0 باسكال (التصفير) وبدء النبض الكهربائي المستمر لل~ 5 بالسيارات في ~ 10 هرتز. تحقق المقاومة ماصة. المقاومة المثالية هي ما بين 5 و 10 MΩ لمعظم الخلايا العصبية للشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تطاير من غيض. استخدام بوق، أو استخدام حقنة، لتطبيق الضغط الايجابي عند الانخفاضات ماصة في حل حمام. تفجير باستمرار من الحل الداخلي حتى غيض هو على سطح الخلية المستهدفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يجعل ضغط إيجابي الدمل صغير على السطح الخلية الإلكترونية، ودفع الطرف قليلا ووقف تطاير. تحقق المقاومة ماصة، والتي ينبغي زيادة. إذا كان يتزايد باستمرار، وترك الأمر ورصد المقاومة حتى يصل&gt; 1 GΩ (gigaseal). إذا لا يزيد من مقاومة من تلقاء أنفسهم، وتطبيق بلطف ضغط سلبي حتى يصبح gigaseal. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يتحقق gigaseal، تغيير إمكانية عقد ل-70 بالسيارات. ثم، وتطبيق متقطع الضغط السلبي للتمزق الغشاء داخل طرف ماصة. عندما يتم تكوين خلية كاملة، لا يمكن للمقاومة ماصة ما بين 500 MΩ و1 GΩ، وينظر إلى بالسعة الحالية. أحيانا يمكن ملاحظتها التيارات بعد المشبكي عفوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل العلاقة الرابع من -80 إلى +40 بالسيارات. نشطت أنواع مختلفة من قنوات الجهد بوابات اعتمادا على نوع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثار ضوء سجل التيارات متشابك أو الفولتية. </li></ol>

<ol>
	<li>Werblin, F. S., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+retina+of+the+mudpuppy,+Necturus+maculosus+II.+Intracellular+recording.">Organization of the retina of the mudpuppy, Necturus maculosus II. Intracellular recording.</a> J Neurophysiol. 32 (3), 339-355 (1969).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Lukasiewicz, P., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+slowly+inactivating+potassium+current+truncates+spike+activity+in+ganglion+cells+of+the+tiger+salamander+retina.">A slowly inactivating potassium current truncates spike activity in ganglion cells of the tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 8 (12), 4470-4481 (1988).</li><li>Kaneko, A., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+L-glutamate+on+the+anomalous+rectifier+potassium+current+in+horizontal+cells+of+Carassius+auratus+retina.">Effects of L-glutamate on the anomalous rectifier potassium current in horizontal cells of Carassius auratus retina.</a> J Physiol. 358, 169-182 (1985).</li><li>Kamermans, M., Werblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA-mediated+positive+autofeedback+loop+controls+horizontal+cell+kinetics+in+tiger+salamander+retina.">GABA-mediated positive autofeedback loop controls horizontal cell kinetics in tiger salamander retina.</a> J Neurosci. 12 (7), 2451-2463 (1992).</li><li>Cook, P. B., McReynolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+inhibition+in+the+inner+retina+is+important+for+spatial+tuning+of+ganglion+cells.">Lateral inhibition in the inner retina is important for spatial tuning of ganglion cells.</a> Nat Neurosci. 1 (8), 714-719 (1998).</li><li>Pang, J. J., Gao, F., Wu , J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+current+responses+in+rod+bipolar+cells,+cone+depolarizing+bipolar+cells+and+AII+amacrine+cells+in+dark-adapted+mouse+retina.">Light-evoked current responses in rod bipolar cells, cone depolarizing bipolar cells and AII amacrine cells in dark-adapted mouse retina.</a> J Physiol. 558 (Pt. 558 (Pt 3), 897-912 (2004).</li><li>Euler, T., Masland , R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+bipolar+cells+in+a+mammalian+retina).">Light-evoked responses of bipolar cells in a mammalian retina).</a> J Neurophysiol. 83 (4), 1817-1829 (2000).</li><li>Berntson, A., Taylor , W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+characteristics+and+receptive+field+widths+of+on-bipolar+cells+in+the+mouse+retina.">Response characteristics and receptive field widths of on-bipolar cells in the mouse retina.</a> J Physiol. 524 Pt. 524 (Pt 3), 879-889 (2000).</li><li>Sterling, P., Smith, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+for+a+binary+synapse.">Design for a binary synapse.</a> Neuron. 41 (3), 313-315 (2004).</li><li>Borghuis, B. G., Marvin, J. S., Looger, L. L., Demb, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+nonlinear+glutamate+release+dynamics+at+bipolar+cell+synapses+in+the+mouse+retina.">Two-photon imaging of nonlinear glutamate release dynamics at bipolar cell synapses in the mouse retina.</a> J Neurosci. 33 (27), 10972-10985 (2013).</li><li>Dowling, J. E., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+retinal+dystrophy+in+the+rat.">Inherited retinal dystrophy in the rat.</a> J Cell Biol. 14, 73-109 (1962).</li><li>Eggers, E. D., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A),+GABA(C)+and+glycine+receptor-mediated+inhibition+differentially+affects+light-evoked+signalling+from+mouse+retinal+rod+bipolar+cells.">GABA(A), GABA(C) and glycine receptor-mediated inhibition differentially affects light-evoked signalling from mouse retinal rod bipolar cells.</a> J Physiol. 572 (Pt 1), 215-225 (2006).</li><li>Ichinose, T., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+retinal+presynaptic+inhibition+switches+with+light+intensity).">The mode of retinal presynaptic inhibition switches with light intensity).</a> J Neurosci. 32 (13), 4360-4371 (2012).</li><li>Ichinose, T., Fyk-Kolodziej, B., Cohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+ON+cone+bipolar+cell+subtypes+in+temporal+coding+in+the+mouse+retina.">Roles of ON cone bipolar cell subtypes in temporal coding in the mouse retina.</a> J Neurosci. 34 (26), 8761-8771 (2014).</li><li>Baicu, S. C., Taylor, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-base+buffering+in+organ+preservation+solutions+as+a+function+of+temperature:+new+parameters+for+comparing+buffer+capacity+and+efficiency.">Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency.</a> Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).</li><li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system.">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li><li>Haverkamp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+primordial,+blue-cone+color+system+of+the+mouse+retina.">The primordial, blue-cone color system of the mouse retina.</a> J Neurosci. 25 (22), 5438-5445 (2005).</li><li>Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+targeted+recording+of+GFP-expressing+neurons+for+light+responses+and+live-cell+imaging+in+the+mouse+retina.">Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina.</a> Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).</li><li>Farre, C. G., M Bruggemann, A., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+screening+-+automated+patch+clamp+on+the+rise.">Ion channel screening - automated patch clamp on the rise.</a> Drug discovery today. Technologies. 5 (1), e1-e34 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Good recordings can only be achieved with good retinal preparations and well-designed patch clamp setups. Although all the steps described above are important, the discussion highlights some critical steps both for the dissection and recordings. 
For dissection, two things are especially important: cooling and oxygenation. After enucleating the eye, quickly remove the front part of the eye in a dissecting chamber with oxygen-bubbled, cooled dissecting solution, and pour cold solution into the ...

The retina is one of the unique parts of the nervous system. As an accessible part of the brain, its synaptic architecture has been well characterized. In addition, the functions of this neural network can be examined with a physiological stimulus: light. If the retinal tissue is isolated in a dark room with appropriate procedures, neurons in the tissue will respond to light. This preparation has been used to study visual signal processing and elucidate various synaptic mechanisms and neural network functions, as well as disease mechanisms. 
Light responses in retinal neurons have been recorded for decades. Early studies used sharp electrodes to make intracellular recordings from mudpuppy retinal neurons1. In the 1980s, the patch clamp technique was invented2, and soon became a popular method among vision researchers3,4. Single cell recordings from lower vertebrates, including mudpuppy and fish retinal neurons, were popular methods that contributed to the elucidation of visual signal processing mechanisms5,6. 
After genetic mutation techniques were developed, the mouse retina became a more popular model for vision researchers7-9. The mammalian retina is more attractive than that of lower vertebrates because it is evolutionarily closer to the human retina, and there is an opportunity to use disease models. However, mouse retinal cells are small and fragile10, and making retinal preparations and conducting patch clamp recordings in a dark room is challenging. As technology has improved, diverse approaches have become available to study visual signaling mechanisms such as imaging studies11 and the electroretinogram (ERG)12. Nevertheless, single cell recording with the patch clamp method is still important because it is highly temporally and spatially sensitive compared to other methods. Therefore, we have continuously conducted patch clamp recordings and improved our methods to investigate visual signal processing in mouse retinal slice preparations13-15.
In this video tutorial, the protocols are presented with important tips. Good recordings can only be achieved with good preparation. Practicing animal dissection and building a sturdy patch clamp rig will enable most researchers to achieve successful recordings.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="886">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:203px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:323px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mice (28-60 days old, male)</td>
			<td style="width:145px;">Jackson laboratory</td>
			<td style="width:203px;">C57BL/6J strain</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ames&#39; medium powder</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:203px;">A1420</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:145px;">Nikon</td>
			<td style="width:203px;">SMZ745</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissecting tool_forceps</td>
			<td style="width:145px;">Dumont</td>
			<td style="width:203px;">#4, #5, #55</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissecting tool_scissors</td>
			<td style="width:145px;">Roboz</td>
			<td style="width:203px;">RS-5605</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dissecting tool_surgery knife</td>
			<td style="width:145px;">Surgistar</td>
			<td style="width:203px;">7514</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">razor blade (for chopper)</td>
			<td style="width:145px;">EMS</td>
			<td style="width:203px;">71970</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">chopper</td>
			<td style="width:145px;">handmade</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">infrared viewer</td>
			<td style="width:145px;">Night Owl Optics</td>
			<td style="width:203px;">NOBG1</td>
			<td>It shows bright view.&#160; Focusing small objects is an issue.</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">infrared pocket scopes</td>
			<td style="width:145px;">B.E. Meyers</td>
			<td style="width:203px;">OWL Gen 3 NV pocketscope</td>
			<td>excellent view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter</td>
			<td style="width:203px;">P-1000</td>
			<td>excellent.&#160; Make consistent size pipettes.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dark box</td>
			<td style="width:145px;">Pelican</td>
			<td style="width:203px;">dark box</td>
			<td>excellent</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">patch clamp system</td>
			<td style="width:145px;">Scientifica</td>
			<td style="width:203px;">slice scope 2000</td>
			<td style="width:323px;">Excellent setup.&#160; Most key components are included in one package.&#160; Micromanipulators are excellent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">amplifier</td>
			<td style="width:145px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:203px;">multiclamp 700B</td>
			<td>Excellent and easy control.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acquiring software</td>
			<td style="width:145px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:203px;">pClamp software</td>
			<td>Excellent and easy control.</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:216px;">light source (LED)</td>
			<td style="width:145px;">Cool LED</td>
			<td style="width:203px;">pE-2 4 channel system</td>
			<td>Excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CCD camera</td>
			<td style="width:145px;">Q-imaging</td>
			<td style="width:203px;">Retiga 2000</td>
			<td>Excellent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Faraday cage</td>
			<td style="width:145px;">handmade</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

recording light-evoked postsynaptic responses in neurons in dark-adapted, mouse retinal slice preparations using patch clamp techniques

شبكية العين هي بوابة الدخول إلى النظام البصري. لفهم آليات معالجة الإشارات المرئية، ونحن التحقيق في وظائف الشبكة العصبية في شبكية العين. تتكون الخلايا العصبية للشبكية في الشبكة العديد من الأنواع الفرعية. وقد تم تحديد أكثر من 10 أنواع فرعية من الخلايا القطبين، خلايا العقدة، والخلايا عديم الاستطالات التي كتبها الدراسات المورفولوجية. ويعتقد فرعية متعددة من الخلايا العصبية للشبكية لترميز سمات مميزة من الإشارات البصرية، مثل الحركة واللون، وتشكل المسارات العصبية متعددة. ومع ذلك، لا يفهم تماما الأدوار الوظيفية لكل الخلايا العصبية في معالجة الإشارات البصرية. طريقة المشبك التصحيح هو مفيد لمعالجة هذه المسألة الأساسية. هنا، وبروتوكول لتسجيل ردود متشابك أثار الخفيفة في الماوس الخلايا العصبية للشبكية باستخدام التصحيح التسجيلات المشبك في ظروف الظلام تكييفها يتم توفيرها. عيون الماوس تتكيف الداكنة-O / N، ويتم تشريح الاستعدادات شريحة الشبكية في غرفة مظلمة باستخدام الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء والمشاهدين. ضوء الأشعة تحت الحمراء لاتنشيط المستقبلات الضوئية الماوس وبالتالي يحافظ على الاستجابة ضوءها. يستخدم التصحيح المشبك لتسجيل استجابات أثار ضوئية في الخلايا العصبية للشبكية. يتم حقن صبغة الفلورسنت خلال تسجيلات لوصف أنواع فرعية المورفولوجية الخلايا العصبية. هذا الإجراء تمكننا من تحديد الوظائف الفسيولوجية من كل عصبون في شبكية العين الماوس.

ويرد إعداد شريحة تمثيلية في الشكل 1. إن إعداد شريحة هو في وضع مستقيم، والتي تبين المستقبلات الضوئية إلى خلايا العقدة في سطح مستو، ولا مفرزة من ورقة الترشيح. إذا كان يميل شريحة، سوى جزء من التحضير هو في التركيز، الأمر الذي يجعل من الصعب تحديد خلية المناسبة للق?...

Watch this Scientific Journal Video about Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques at JoVE.com

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

recording-light-evoked-postsynaptic-responses-neurons-dark-adapted

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Video: Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

تحليل الردود من الخلايا العصبية الحسية الشمية ماوس باستخدام تسجيل Electroolfactogram الهواء المرحلة

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

الردود تصوير الخلايا العصبية في الجهاز الاستعدادات لقطات للالميكعي تعرب عن جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

مثقب تسجيل التصحيح، المشبك من الماوس العصبونات الحسية الشمية في الظهارة العصبية السليمة: التحليل الوظيفي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها إبداء الرائحة مستقبلات

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

تسجيلات خلية كاملة التصحيح، المشبك في الدماغ شرائح

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

التصحيح المشبك تسجيل من خلايا النجمي عديم الاستطالات في جبل شقة إعداد Deafferentated شبكية العين الفأر

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze motor-learning induced plasticity, we trained rats using an accelerated rotor rod task. Rats performed the task 10 times at 30-s intervals for 1 or 2 days. Performance was significantly improved on the training days compared to the first trial. We then prepared acute brain slices of the primary motor cortex (M1) in untrained and trained rats. Current-clamp analysis showed dynamic changes in resting membrane potential, spike threshold, afterhyperpolarization, and membrane resistance in layer II/III pyramidal neurons. Current injection induced many more spikes in 2-day trained rats than in untrained controls.
To analyze contextual-learning induced plasticity, we trained rats using an inhibitory avoidance (IA) task. After experiencing foot-shock in the dark side of a box, the rats learned to avoid it, staying in the lighted side. We prepared acute hippocampal slices from untrained, IA-trained, unpaired, and walk-through rats. Voltage-clamp analysis was used to sequentially record miniature excitatory and inhibitory postsynaptic currents (mEPSCs and mIPSCs) from the same CA1 neuron. We found different mean mEPSC and mIPSC amplitudes in each CA1 neuron, suggesting that each neuron had different postsynaptic strengths at its excitatory and inhibitory synapses. Moreover, compared with untrained controls, IA-trained rats had higher mEPSC and mIPSC amplitudes, with broad diversity. These results suggested that contextual learning creates postsynaptic diversity in both excitatory and inhibitory synapses at each CA1 neuron.
AMPA or GABAA receptors seemed to mediate the postsynaptic currents, since bath treatment with CNQX or bicuculline blocked the mEPSC or mIPSC events, respectively. This technique can be used to study different types of learning in other regions, such as the sensory cortex and amygdala.

The slice patch clamp technique is an effective method for analyzing learning-induced changes in the intrinsic properties and plasticity of excitatory or inhibitory synapses.

تصحيح شريحة المشبك تقنية لتحليل اللدونة المستحثة بالتعلم

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

الأعمال التحضيرية وبروتوكولات "كل خلية التصحيح المشبك تسجيل" ليفيس النمو تيكتال الخلايا العصبية

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

إعداد شرائح الحبل الشوكي الحاد لتسجيل كامل الخلية التصحيح-المشبك في الخلايا العصبية جيلاتينوسا الدماغ

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...