وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون R01EY017925 وR21EY020985 والتمويل من المؤسسات دانا وايت هول لPK كما نشكر متى بتريا للحصول على المساعدة مع العمليات الجراحية؛ غريس ديون لتعقب التشعبات هو مبين في الشكل 5A، وبراتيك Chhatbar لل تعليقات على المخطوط.

1. إعداد الجراحية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل التخدير ورصد معدل ضربات القلب بشكل مستمر، وإنهاء المد والجزر CO 2، EEG، ودرجة الحرارة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام من جامعة ساوث كارولاينا الطبية واستندت على تلك التي سبق نشرها 9،15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشف السطح الظهري من الجمجمة عن طريق قطع الجلد بشفرة المشرط. تشريح الأنسجة الضامة التي تغمر العظام باستخدام مجرفة Brudon. تنظيف العظام باستخدام أدوات تطبيقها القطن والشاش والقطن ذات الرؤوس. تطبيق الشمع العظام (حسب الحاجة) في الجمجمة ووقف النزيف في بعض الأحيان من خلال الأوردة مبعوث الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق التيتانيوم المقاوم للصدأ أو الفولاذ لوحة لرئيس الجمجمة (فوق منطقة ذات أهمية حيث سيتم تنفيذ حج القحف) باستخدام الاسمنت الأسنان مختلطة مع الطلاء الأسود (انظر المواد). A افتتاح مستطيل في وسط لوحة الرأس وصولا لحج القحف والتصوير الضوئي. إرفاق غرفة معدنية على الجزء العلوي من لوحة الرأس. وهذه القاعة بمثابة خزان السائل للتصوير بهدف عدسة المياه الغمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين لوحة الرأس إلى مرحلة XY باستخدام المشاركات المعادن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة مساحة كبيرة من العظام داخل فتح مستطيلة من headplate باستخدام الحفر الأسنان. يجب على المنطقة المراد ضعيفة تمتد إلى ما وراء حدود حج القحف المخطط لها. يجب أن ضعفت الجمجمة سميكة من غير الثدييات إذا القوارض إلى صور عالية الدقة يمكن الحصول عليها من القشرة المخية الحديثة لأنه في موقع حج القحف، والعظام وسمك تملي سمك الاغاروز بين ساترة وسطح القشرة المخية الحديثة (انظر أدناه) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر 2 × 2 مم مربع مخطط في العظام لحج القحف. شطف الغرفة دوريا مع السائل المخي الشوكي الطازجة الاصطناعي (ACSF) لإزالة شظايا العظام وتقليل تبديد الحرارة إلى القشرة الأساسية. تطبيق الشمع العظام حسب الحاجة، لوقف النزيف في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليفر رفرف العظام مع ملقط # 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كافة ولكن الطبقة السفلية من الجافية باستخدام ملقط غرامة (# 5CO) ومقص الربيع Vannas. والدرة في غير الثدييات القوارض سميكا وغير شفاف ولكن يمكن إزالتها في طبقات متميزة. النزيف أمر نادر الحدوث ولكن يمكن وقفها مع جلفوم وينبغي إزالة أي بقايا الدم برفق من الطبقة المتبقية من استخدام ملقط الجافية والشطف مع ACSF. الطبقة الأخيرة من دورا يتسم بالشفافية والأوعية حنوني ينبغي أن تكون واضحة للعيان من خلال ذلك. وترك هذه الطبقة النهائية من خلال التصوير الجافية سليمة إشارة جوهرية تزيد من نسبة نجاح التحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم الفلورية للمرحلة اللاحقة التصوير ثنائي الفوتون من التجربة (انظر المناقشة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قطرة دافئة الاغاروز 2٪ (الذائبة في ACSF) وعلى الفور وضع ساترة خلال حج القحف. تحقق من حج القحف لضمان أن نبضات القلب والأوعية الدموية في الجهاز التنفسي وتكاد تكون معدومة باستخدام الميكروسكوب الجراحي أو تشريح oculars حل الدولتين،الفوتون المجهر في مجال وضع مشرق. </li></ol> 2. الجوهرية الإشارات الضوئية التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة هلام الرغوة غارقة مع ACSF حول السطح الخارجي للساترة لمنع الاغاروز من الجفاف خلال التصوير إشارة الذاتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الذاتية كاميرا CCD التصوير إشارة إلى ميناء جبل معيار C-على رأس المجهر ثنائي الفوتون (الشكل 1). وضع مصدر إضاءة الضوء على الجدول جوية قرب مرحلة س ص (الشكل 1A). موقف وتأمين أدلة الضوء على حج القحف وheadplate / غرفة (1B الشكل). التراجع عن مزدوج اللون الأساسي والمرآة دون ميناء جبل C-بحيث الضوء المنعكس الأحمر اللازمة لإشارات جوهرية سوف تمر مباشرة من حج القحف إلى الكاميرا CCD (الشكل 1C-D). الهدف باستخدام الهواء 4X (0.13 NA، 17 مم WD)، وحقل 2 × 2 مم للعرض متاح للتصوير إشارة الذاتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج مرشح الحرارة في لآيت الطريق لمنع القشرة من التدفئة. استخدام التصفية التي يمر الضوء الأخضر (546 نانومتر مركز λ) وتسجيل صورة مرجعية رقمية في الأوعية الدموية السطحية القشرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التركيز إلى 500 ميكرومتر Z تحت السطح القشري. استخدام عامل تصفية الحمراء (630 نانومتر مركز λ) لإلقاء الضوء على قشرة لقياس الإشارات الجوهرية. وضع أدلة ضوء بحيث يتم مضيئة بشكل موحد على السطح القشري. درع حج القحف من ضوء الشاشة التي تنتجها التحفيز البصري. تقديم سلسلة من المحفزات البصرية والصور سجل بيانات الانعكاس. لإنشاء خريطة التوجه في غضون 10 دقيقة، وجمع البيانات الموافق 4 التكرار من سلسلة من 8 منبهات (4 التوجهات والاتجاهات اثنين لكل اتجاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات الجوهرية لتوليد إشارة التوجه اللون كاذبة الخريطة. حدد المناطق المستهدفة المحتملة للثنائي الفوتون توسيم الخلايا العصبية، على سبيل المثال، والتوجه شخصياته الدولاب على الهواء - نقطة في الخريطة مكانجميع التوجهات تلتقي المفضل (الشكل 2A). تراكب الخريطة التوجيه وصورة الأوعية الدموية السطحية القشرية (الشكل 2B-C). استخدام تخطيط من المجالات الوظيفية وموقع سفن السطح الكبيرة لتحديد الهدف، وتجنب المواقع مع الأوعية الدموية الكبيرة والشرايين 15. </li></ol> 3. تحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم نيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل بلورونيك 20٪ / DMSO بإضافة 1 غرام في 5 بلورونيك DMSO ميكرولتر. تسخين الخليط في 60 ° C لمدة 10 دقيقة على حل تماما بلورونيك. يسمح هذا الخليط ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 4 ميكرولتر من خليط بلورونيك / DMSO إلى قارورة ميكروغرام 50 من الكالسيوم مؤشر الفلورية الخضراء ولاية أوريغون 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). ثم يضاف 1 ميكرولتر من صبغة حمراء (اليكسا فلور 594، 2 محلول المخزون ملي) و 35 ميكرولتر من حل ماصة (انظر المواد) لتركيز النهائي من 1 ملم OGB-1 AM. يصوتن الحل ل½ ساعة فيحمام المياه المبردة وأجهزة الطرد المركزي ثم 0،45 ميكرون مع فلتر لإزالة الشوائب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ماصة تفتق طويل مع قطر تلميح الخارجي من 2،0-2،5 ميكرومتر. تحميل 5 ميكرولتر من خليط الصبغة في ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبقة النهائية من دورا لتسهيل ماصة الإدراج والحصول على أعلى جودة لمدة الفوتون الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المكان المحدد على سطح القشرية التي يجب أن توضع في ماصة من أجل الوصول إلى هدفه في طبقة قشرية 2/3. هدفنا هو محدد سلفا القشرية التفرد الدولاب على الهواء في خريطة التوجه (الشكل 2). يجب أن تكون مدفوعة ماصة في القشرة بزاوية ° 30 لتمرير بين الجدار وغرفة الهدف. وهكذا، لتسمية المنطقة المستهدفة 200 ميكرومتر تحت السطح القشري، فإن موقف دخول ماصة على سطح القشرية يكون حوالي 350 ميكرون الجانبي إلى موقف الهدف (الشكل 3 AB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة XY (التي الحيوان وعتوضع ipette مياداة مجهرية) إلى مركز إدخال السطح القشري موقف إطار الهدف (الشكل 3C). استخدام الهدف 20X 40X أو مع مسافة العمل (WD) ما لا يقل عن 3 مم (انظر المواد) للتأكد من أن ماصة ستدخل بسهولة القشرة دون لمس الهدف أو العظام على طول جدار حج القحف. مرة واحدة ويتركز موقف دخول في إطار الهدف، ورفع الموقف Z الهدف بنسبة 2 مم (الشكل 3D). مع برنامج التحصين الموسع، مضان أخضر فاتح تشغيل لتصور الأحمر اليكسا الصبغة في ماصة، استخدم محور مائل للمياداة مجهرية لنقل ماصة حتى يتركز طرفها (وركز) في إطار الهدف مباشرة فوق موقف سطح دخول القشرية ( الرقم 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض عموديا ماصة (على طول محور ض) حتى تصل إلى السطح ماصة القشرية (الشكل 3F)، في حين عرض مستمر من خلال طرف ماصة مكتب تعزيز الوحدةلارس من المجهر. باستخدام مشرق مجال الإضاءة، والدم سطح السفن والأغشية القشرية السحائي المتبقية (PIA والعنكبوتي) مرئية بسهولة كما ماصة تقترب من سطح القشرية. إذا كان ماصة لا يصل إلى موقف الإدخال المطلوب، ورفع ماصة وإعادة تقويم يعتمد على استهداف المعالم الأوعية الدموية على سطح القشرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الهدف، الفتيل السائل النخاعي الزائد من حج القحف وتجفيف العظام المجاورة باستخدام الرماح امتصاص الخالي من الوبر. تطبيق قطرة دافئة الاغاروز 3٪ (الذائبة في ACSF) لتحقيق الاستقرار في القشرة التي مرئيا من خلال حج القحف (الشكل 3G). في القوارض غير، الاغاروز 3٪ من الضروري تخفيف نبضات لامتصاص نجاح الأصباغ الفلورية من الخلايا العصبية. للتصوير الضوئي إشارة الجوهرية 2٪ فقط وهناك حاجة لأن الاغاروز مزيج من الاغاروز 2٪ وساترة ويوفر الاستقرار اللازم. هنا، يتم استخدام أي ساترة للخطوة صبغة التحميل حتى 3٪ والاغاروزاللازمة. بعد الاغاروز وقد عززت، اضافة الى وجود الهدف 40X (0.8 NA، 3.3 مم WD) وإعادة ملء الغرفة مع ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحول من الميدان مشرق لاثنين من الفوتون عرض وتحديد موقع الطرف ماصة. باستخدام محور مائل للمياداة مجهرية، نقل ماصة حتى طرفها تصل إلى العمق المطلوب في القشرة (الشكل 3H). وأحيانا نفث طرد ضغط خليط الصبغة (أ PSI قليلة، كل 0،1 ثانية نبض) تساعد على منع الطرف ماصة من انسداد. لأن OGB-01:00 يصبح فقط مرئية عند دخول الخلايا، وصبغ أحمر اليكسا أمر بالغ الأهمية لرؤية غيض ماصة داخل القشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل محاولة تحميل الخلايا العصبية في طبقة قشرية 2/3 مع الجرعة الكاملة من الأصباغ، وإعادة تركيز الهدف على سطح القشرية لتأكيد عمق غيض ماصة والتأكد من أن الطرف هو في موقع الهدف على أساس تخطيط سفن السطح الدم. إذا كان في طبقة ماصة 2/3، وينبغي أن نفث صغيرة من الخليط صبغة تضيءخارج الخلية الفضاء وتكشف عن وجود الجمعية كثيفة من أجسام الخلايا الدائرية والظلال الداكنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل أجسام الخلايا العصبية في القشرة مجال قطرها ميكرون 300-600، وضخ صبغة الخليط في الفضاء خارج الخلية باستخدام نبضات 30-90، كل 1،0 ثانية نبض، 2-10 رطل. ينبغي أن نبضات من الضغط لا تكون قوية لدرجة أن الأنسجة يتحرك. بعد اكتمال حقن، انتظر لدقيقة قليلة، ثم إزالة ماصة وموضوعية. الانتظار لمدة 1 ساعة للسماح للOGB-1 صباحا إلى اتخاذ يكون كاملا، من قبل الخلايا العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الاغاروز المستخدمة في صبغ التحميل وشطف غرفة تسجيل. وضع قطرة صغيرة من 2-3٪ الاغاروز على السطح وسرعان ما وضع ساترة خلال حج القحف. لأن الأصباغ الفلورية هي حساسة للضوء، وتجنب الإفراط في تعريض القشرة إلى الميدان أو مشرق ضوء برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت. اضافة الى وجود ارتفاع NA (1.0) 20X الهدف في ماسك الهدف وإعادة مركز المنطقة المسماة القشرية في إطار الهدف باستخدام المرحلة XY. درع من حج القحف السابقينمصادر الضوء traneous، على سبيل المثال، عرض الحوافز البصرية، وذلك باستخدام طبقات متعددة من مواد تعتيم. </li></ol> 4. وحيدة الخلية الصعق الكهربائي من الأصباغ نيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدراسة التشكل شجيري، يعد الحل من 100 ميكرومتر اليكسا فلور 594 (1:20 التخفيف في ACSF من 2 ملي الأسهم اليكسا فلور 594). قد لتصوير الفنية للالتشعبات يمكن استخدام الملح OGB 16،17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب ماصة تفتق طويل مع حجم غيض من 1 ميكرومتر وتحميل 5 ميكرولتر من صبغة في ماصة. جميع الخطوات الأخرى استهدفت عمل المجال مماثلة لطريقة التحميل بالجملة (أرقام 1-3). لوضع تلميح ماصة مجاورة لغشاء الخلية العصبية الجسم، ورصد زيادة في مقاومة القطب وتطبيق نفث ضغط صبغ لإلقاء الضوء على الفضاء خارج الخلية ونرى أجسام الخلايا والظلال أثناء التصوير ثنائي الفوتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما غيض ماصة المجاورة لغشاء الخلية العصبية الجسم، استخدم 800A Axoporator لتطبيق1-3 البقول (-8 إلى -10 V، 10 ميللي ثانية النبض). شغل الفوري للعصبون مع صبغ هو تصور بسهولة مع اثنين من الفوتون المجهري. إزالة ماصة وجمع صور عالية الدقة من التشعبات والمحاوير في الجسم الحي. </li></ol>

<ol>
	<li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex.">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+cortex+revealed+by+optical+imaging+of+intrinsic+signals.">Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals.</a> Nature. 324, 361-364 (1986).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iso-orientation+domains+in+cat+visual+cortex+are+arranged+in+pinwheel-like+patterns.">Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns.</a> Nature. 353, 429-431 (1991).</li><li>Ohki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+ordered+arrangement+of+single+neurons+in+orientation+pinwheels.">Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels.</a> Nature. 442, 925-928 (2006).</li><li>Shmuel, A., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+for+direction+of+motion+and+its+relationship+to+orientation+maps+in+cat+area+18.">Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18.</a> J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity.">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li><li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17/18+border+in+cat+visual+cortex.">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li><li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex.">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li><li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+Cortical+Column+Would+that+Be.">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).</li><li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex.">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li><li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging:+comparison+with+the+primary+visual+cortex.">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li><li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo.">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).</li><li>Nevian, T., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+indicator+loading+of+neurons+using+single-cell+electroporation.">Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation.</a> Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).</li><li>Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+patch-clamp+recordings+and+single-cell+electroporation+of+unlabeled+neurons+in+vivo.">Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).</li><li>Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex.">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li><li>Rochefort, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+direction+selectivity+in+mouse+cortical+neurons.">Development of direction selectivity in mouse cortical neurons.</a> Neuron. 71, 425-432 (2011).</li><li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity.">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-972 (2007).</li><li>Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Imaging+Based+on+Intrinsic+Signals.">Optical Imaging Based on Intrinsic Signals.</a> Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).</li><li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo.">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li><li>Hofer, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex.">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم طريقة لاستهداف بوضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية (أو محورا وتشعبات عصبية) في المجالات المحددة مسبقا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. دمج الجوهرية التصوير الإشارات الضوئية مع اثنين من الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد أي نقاط الاشتباك العصبي وال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. دعم الحياة / التجربة الإعدادية </td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> ويبستر البيطرية </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane المرذاذ </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> تعليقات بطانية التدفئة التنظيم </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> ECG مراقب </td><td> Digicare الطبية الحيوية </td><td> LifeWindow لايت </td><td></td></tr><tr><td> مكبر للصوت EEG </td><td> نظم AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> طرق العرض رصد EEG </TD&gt; <td> هيوليت باكارد </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> إنهاء المد والجزر CO 2 مراقب </td><td> RESPIRONICS </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> تحسين التهوية </td></tr><tr><td> نتوءات كربيد الحفر لحفر العظام </td><td> هنري شين </td><td> غرامة (0.5 مم تلميح) والخشنة (1.25 تلميح مم) </td><td></td></tr><tr><td> الاسمنت لheadplate / غرفة </td><td> DENTSPLY </td><td> 675571، 675572 </td><td></td></tr><tr><td> مسحوق الطلاء الأسود الصبغ </td><td> سارجنت الفن وشركة </td><td> 22-7185 </td><td> إضافة إلى الاسمنت لتحسين التدريع ضوء والحد من انعكاسات </td></tr><tr><td> الاغاروز - النوع الثالث-A </td><td> سيجما </td><td> A9793 </td><td> لتقليل نبضات خلال إشارة الذاتية والتصوير ثنائي الفوتون </td></tr><tr><td> ساترة: 5 أو 8 مم، 0.17 مم سمك </td><td> الدقة في العالمstruments </td><td> 502040، 502041 </td><td> لتقليل نبضات خلال التصوير، قد يتم قطع ساترة حسب الحاجة </td></tr><tr><td> [كرتس Brudon </td><td> جورج تيمان </td><td> 105-715-0، 105-715-3 </td><td> تنظيف سطح الجمجمة </td></tr><tr><td> الشمع العظام </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> وقف النزيف بسرعة </td></tr><tr><td> يميل القطن القضيب </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 72308-05 </td><td> نظيفة وجافة السطح العظام </td></tr><tr><td> دومون # 5CO الملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11295-20 </td><td> انتزاع طبقات الفردية دورا أو الحنون </td></tr><tr><td> Vannas ربيع مقص </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 15000-03 </td><td> قطع الجافية </td></tr><tr><td> جلفوم </td><td> شركة فايزر </td><td> 09-0396-05 </td><td> لوقف نزيف على الجافية </td></tr><tr><td> امتصاص الرماح</td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 18105-01 </td><td> فائقة السرعة والوبر الحرة فتل من CSF </td></tr><tr><td> تعتيم المواد </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> درع حج القحف </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. صبغ إعداد / الحقن </td></tr><tr><td> ثنائي ميثيل Sulphoxide (DMSO) </td><td> سيجما </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> بلورونيك </td><td> سيجما </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> ولاية أوريغون الخضراء 488-Bapta 01:00 </td><td> إينفيتروجن </td><td> O6807 </td><td> الكالسيوم مؤشر </td></tr><tr><td> الكسا فلور 594 </td><td> إينفيتروجن </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> الطرد المركزي فلتر (0.45 ميكرون حجم المسام) </td><td> ميليبور </td><td> UFC30HV00 </td><td> لإزالة الشوائب قبل الحقن </td></tr><tr><td> الزجاج ماصة مجتذب </td><td> سوتر الآلات </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> الخيطية البورسليكات الزجاج الشعرية (1.5 مم الخارجي) </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> 1B150F-4 </td><td> صبغ طرد ماصة </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> إيبندورف </td><td> 5242 956 003 </td><td> لتحميل صبغة في ماصة </td></tr><tr><td> مياداة مجهرية </td><td> سوتر الآلات </td><td> MP-285 </td><td> لوضع ماصة </td></tr><tr><td> ضغط النبض تحكم </td><td> باركر Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> للحقن الصبغة ضغط </td></tr><tr><td> وحيدة الخلية electroporator </td><td> الجزيئية الأجهزة </td><td> Axoporator 800A </td><td> لالصعق الكهربائي للصباغة </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. معهد العالم العربي الجوهريةجينج </td></tr><tr><td> 4X الهدف (0.13 NA، 17 مم WD) </td><td> OLYMPUS </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> الجوهرية الأجهزة / البرمجيات </td><td> التصوير الضوئي شركة </td><td> تصوير 3001 / VDAQ </td><td> يتم استخدام البرنامج للحصول على VDAQ التصوير العرضية </td></tr><tr><td> CCD كاميرا </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> ضوء العرض مصدر الطاقة </td><td> كيبكو </td><td> 15-15M أكل </td><td></td></tr><tr><td> مصدر الضوء </td><td> التصوير الضوئي شركة </td><td> HAL 100 </td><td> شدة الضوء على السطح القشري هو 3-5 ميغاواط </td></tr><tr><td> الأخضر مرشح (لصورة الأوعية الدموية) </td><td> التصوير الضوئي شركة </td><td> λ = 546 نانومتر (ممر الموجة 30 نانومتر) </td><td> لصورة مرجعية من الأوعية الدموية السطحية </td></tr><tr><td> مرشح الأحمر (لإشارة الذاتية) </td><td> Imagi البصريةنانوغرام شركة </td><td> λ = 630 نانومتر (ممر الموجة 30 نانومتر) </td><td> لجمع الإشارات الجوهرية </td></tr><tr><td> مرشح الحرارة </td><td> التصوير الضوئي شركة </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. ثنائي الفوتون تلاعب / التصوير </td></tr><tr><td> ثنائي الفوتون المجهر والبرامج </td><td> البراري تكنولوجيا </td><td></td><td> انظر شين وآخرون 2012 للمسار الضوء والفلاتر وقوة الليزر </td></tr><tr><td> منظمة الشفافية الدولية: ياقوت ليزر </td><td> أطياف-الفيزياء </td><td> ماي تاي XF </td><td></td></tr><tr><td> 20X (0.5 NA؛ WD 3.5 ملم) </td><td> OLYMPUS </td><td> UMPLFLN20X </td><td> ويستخدم 0،5 NA الهدف الوحيد لمحاذاة ماصة على حج القحف (وليس للتصوير الفوتون اثنين) </td></tr><tr><td> 20X (1.0 NA؛ WD 2.0 مم) </td><td> OLYMPUS </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40X (0.8 NA؛ WD 3.3 مم) </td><td> OLYMPUS </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> الجدول الهواء </td><td> نيوبورت </td><td> ST-200 </td><td> يعزل من إعداد الاهتزازات الخارجية </td></tr><tr><td> س ص المرحلة </td><td> مايك آلة شركة (أتليبورو، MA) </td><td></td><td> التجريبية الموضوع ومياداة مجهرية سوتر وضعت على خشبة المسرح س ص </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> وصفات </td></tr><tr><td> اصطناعية الدماغي الشوكي السوائل </td><td> كلوريد الصوديوم (135 ملم)، بوكل (5.4 ملم)، MgCl 2 (1.0 ملم)، CaCl 2 (1.8 ملم)، HEPES (5 ملم)، درجة الحموضة 7.4 </td></tr><tr><td> الحل ماصة 14 </td><td> كلوريد الصوديوم (150 مم)، بوكل (2.5 ملم)، HEPES (10 ملم)، درجة الحموضة 7.4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

في القشرة البصرية الأولية غير القوارض الثدييات، وتتجمع الخلايا العصبية وفقا لتفضيلهم لميزات مثل التحفيز التوجه 1-4، الاتجاه 5-7 و هيمنة العين والتفاوت مجهر 8،9 9. الانتقائية التوجه هو السمة الأكثر دراسة على نطاق واسع وخريطة المستمر مع تخطيط شبه دورية لتوجيه المفضل موجود في القشرة البصرية الأولية 10،11 كامل. دمج مساهمات متشابك، وشبكة الخلوية التي تؤدي إلى تحفيز استجابات انتقائية في هذه الخرائط وظيفية يتطلب التهجين من تقنيات التصوير التي تمتد الفرعية ميكرون إلى المقاييس المكانية ملليمتر. مع الإشارة التقليدية التصوير الضوئي الجوهرية، يمكن تحديد تخطيط الشامل للخرائط وظيفية عبر كامل سطح القشرة البصرية 12. تطوير مجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة تمكن واحد لتحديد synaptجيم إدخال تصل إلى العمود الفقري شجيري الفردية 13 أو سجل نشاط في وقت واحد من مئات الأفراد أجسام الخلايا العصبية 6،14. وبناء على ذلك، والجمع بين التصوير الجوهرية إشارة للقرار الفرعية ميكرون المكاني للثنائي الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد بالضبط التي شرائح والخلايا الجذعية تسهم إلى المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية في القشرة المخية الحديثة. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة ذات الإنتاجية العالية للحصول على الخارطة بسرعة التوجه القشرية واستهداف محدد الصغيرة النطاق في هذه الخريطة الوظيفية لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في الثدييات غير القوارض. مع المجهر نفسها التي استخدمت لمدة الفوتون التصوير، ونحن أولا توليد خريطة التوجه باستخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية. ثم نعرض كيفية استهداف الدقيقة مجال الاهتمام باستخدام micropipette محملة صبغة إما تسمية عدد سكانها أجسام الخلايا العصبية أو العصبونات تسمية واحدة بحيث التشعبات، والعمود الفقري محاور عصبية واضحة فيالجسم الحي. لدينا أكثر من التحسينات الطرق السابقة تسهيل دراسة العلاقات هيكل الوظائف العصبية مع شبه الخلوية القرار في إطار البنى الوظيفية القشرة المخية الحديثة.

لتوضيح دقة طرقنا وضع العلامات صباغة، استهدفت نحن أصغر الجزئي أي مجال وظيفي الخريطة المعروفة في القشرة المخية الحديثة غير القوارض. تتخللها قليلة في جميع أنحاء الخريطة التوجه في القشرة البصرية الأولية هي شخصياته. هذه النقاط التي تحدث في جميع الاتجاهات بحيث تتلاقى الم...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging at JoVE.com

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

يوصف أسلوب لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في المجالات المحددة سلفا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. أولا، يتم استخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية للحصول على خريطة وظيفية. ثم يتم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتسمية الخلايا العصبية والصورة ضمن مجال الصغيرة من على الخريطة.

استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  Medical University of South Carolina. يوصف أسلوب لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في المجالات المحددة سلفا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. أولا، يتم استخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية للحصول على خريطة وظيفية. ثم يتم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتسمية الخلايا العصبي...

Video: Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

الاجتثاث سكان الخلايا العصبية باستخدام ليزر اثنين-فوتون وتقييمها باستخدام الكالسيوم تصوير وتسجيل السلوكية في اليرقات الزرد

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.