الكتاب أود أن أشكر L. لمعدات التصوير Belluscio الجراحة، D. كوون المساعدة للتصوير، K. ليو لتحرير الفيديو المساعدة، وماكلويد K. لجميع موسيقى خلفية. KW يعترف بدعم سخي من شعبة NIMH من برامج بحثية ضمن الجدران والجينات، والإدراك وبرنامج الذهان. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث NIMH ضمن الجدران (VC، YY، SMKW) وشعبة NIAAA من ضمن الجدران برنامج البحوث السريرية والبيولوجية (VC، RMC، DML).

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل المعهد الوطني للصحة النفسية ورعاية الحيوان اللجنة استخدم وكانت وفقا للمعاهد القومية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. قبل العملية إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف جميع الأدوات في التعقيم حبة الساخنة قبل الجراحة العقيم، وتنظيف موقع الجراحة مع الايثانول 70٪، وانخفاض اخماد الملابس النظيفة. ارتداء قفازات معقمة. تخدير الحيوان مع الطازجة حل AVERTIN 1.2٪، عند 0.02 مل تعطى / ز، intraperitonially. بدلا من ذلك، تخدير بالغاز isoflurane من خلال مخروط الأنف، و 5٪ للتجنيد، 1.5٪ للصيانة، مع دائرة زبال السلبي. تحقق من مستوى التخدير باستخدام الذيل أو إصبع القدم القرصات لضمان تخدير كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية عيون الحيوان مع مرهم معقم للعين، وحقن ديكساميثازون الطازجة (0.2 ملغ / كلغ) وكاربروفين (5 ملغ / كلغ) subcutaneouslY لمنع التورم والالتهاب في الدماغ 11. حلق شعر أكثر من الجمجمة بين الأذنين، وتعقيم الجلد مع فرك betadine وثلاثة مسحات بالتناوب من الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الحيوان في مرحلة جراحة التجسيمي مع earbars، مع التدفئة وسادة تحت الماء تداول مجموعة الحيوانات في 37 ° C. تحقق بانتظام مستويات التخدير الحيوان، واستكمال جرعة مخدر الأصلي حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخ 200 ميكرولتر من 0.5٪ Marcaine تحت الجلد فروة الرأس لتخدير المنطقة. شق الجلد وإزالة الجلد فوق رفرف الجمجمة. إزالة السمحاق وتجفيف المنطقة مع قطعة قطن نظيفة. </li></ol> 2. جراحة الجمجمة نافذة المزمنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحفر عالية السرعة الأسنان مع لدغ 0.5 مم لتوضيح بلطف 3-5 مم دائرة حول منطقة الدماغ من الفائدة. الرطب بشكل دوري في موقع الحفر مع 0.9٪ العقيمة المالحة الغبار العظام واضحة بعيدا مع قطعة قطن نظيفة. إذا كان ينزف العظام، استخدم زelfoam presoaked مع ملحي معقم لطخة على تنزف وانتظر حتى يتوقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الوصول إلى طبقة العظام الماضي، رفع وإزالة العظام الجزيرة مع غرامة ذات الرؤوس ملقط. قد يكون واجه مرفقات الجافية إلى الرف السفلي من العظام إذا كان إطار يعبر خياطة العظام. يجب إزالة هذه بلطف ورفع رفرف العظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مبلل بلطف لفة هلام الرغوة على الجافية يتعرض لتنظيف سطحها وانتظار أي نزيف الجافية لوقف خطوة حاسمة: لا تقم بالمتابعة حتى جميع النزيف قد توقف الجافية. الدم الذي يصبح محاصرين داخل إطار الجمجمة عادة ما يؤدي إلى نافذة معتمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت المنطقة قد تهم تحت موقع حيث الجافية سميكا خاصة، وإزالة دورا أعلاه يكون من الضروري. إذا كانت هذه هي الحالة، فصل بلطف الجافية من الحنون أدناه مع ملقط دقيق جدا، وجعل شق صغير في بلدة دورا رفع مع زوج آخر من ملقط غرامة، فهم ثم حواف قطع وبلطفتقسيم الجافية. ولكن الجافية رقيقة قوية، لذا يجب الحرص على عدم شريحة الدماغ مع حواف سليمة من دورا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المنطقة مع ACSF معقمة أو ملحي معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرساء ساترة زجاجية معقمة (3-5 ملم) على الجافية أو PIA خطوة حاسمة: إذا منحنيات الجمجمة المحيطة بشكل كبير، استخدم Kwiksil 12 لاصقة لملء الفراغات في دورا حيث الحنون أو لن تجعل اتصال وثيق مع ساترة في المناطق لن يمكن تصوير ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هلام CYANOACRYLATE لتغطية اصقة المطاط الصناعي وحواف ساترة الزجاج. تغطية الجمجمة بأكملها تتعرض مع هلام CYANOACRYLATE، أو خليط الإسمنت والأسنان krazyglue خطوة حاسمة: عدم السماح لأي هلام CYANOACRYLATE لتلمس سطح الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين رأس معدنية مصنوعة خصيصا شريط التثبيت في الطرف المقابل من الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة الحيوان إلى غرفة الإنعاش الدافئة، بعد حقنة intraperitonial من كيتوبروفين، 5 مغ / كغ، FOص إدارة الألم. مواصلة مسكن ليومين آخرين بعد العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أسبوعين من الانتعاش بعد الجراحة، تخدير الحيوان مع isoflurane (5٪ للتحريض، 1.5٪ للصيانة)، تركيبها في مرحلة المجهر حسب الطلب مع إطار وجها لتثبيت، والتحقق من النافذة الجمجمة من أجل الوضوح البصري تحت الإضاءة مع اللون الأزرق الفاتح. الأوعية الدموية في الدماغ وضوح السطح يدل عالية الجودة من النافذة في الجمجمة. إذا تم تعريف بشكل حاد الحواف الأوعية الدموية، الإطار من المرجح أن يكون صالحة للاستعمال. وأوصت لمدة أسبوعين وقت الشفاء بعد الجراحة لإتاحة الوقت الكافي للحيوان للتعافي من عملية جراحية. نوافذ الجمجمة عادة مسح وتحسين وخلال هذا الوقت، وتبقى شفافة بصريا لأسابيع إضافية لأشهر حتى إعادة نمو الجمجمة أو سماكة في دورا يحط جودة الإطار. </li></ol> 3. بروتوكول السلوكية والليزر المسح الضوئي ثنائي الفوتون المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ج الحيوانات مع واضحةسوف يتعرض لنوافذ ranial حافزا البيئية أو التعرض للدورة تدريبية السلوكية، وبعد ذلك التقط ثم في وقت التعبير GFP قوس القصوى. قبل البدء في بروتوكول السلوكية، يجب أن تبقى الحيوانات في قفص بيئة منزلية متسقة للحد من يوم إلى يوم التباين في مستويات خط الأساس التعبير قوس GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء التدريب السلوكي أو نماذج التحفيز البيئي، اعتمادا على منطقة في الدماغ من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن أن يتعرض لبيئات الحيوانات البصرية المختلفة على مدى أيام متتالية، وتصوير كل يوم بعد التحفيز التحفيز البصري لتحديد استجابات محددة في القشرة البصرية 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوس GFP مضان عادة في الخلايا العصبية تصل إلى أعلى مستوياته بعد ساعتين التحفيز. قد يكون الأمثل الجدول الزمني التجريبية لتسهيل الكشف عن قوس GFP التعبير في الخلايا العصبية عند مستوياتها مضان الذروة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد جلسة التدريب السلوكي أو environmentaاكتمال التحفيز لتر، تخدير الحيوان مع isoflurane (5٪ للتحريض، 1.5٪ للصيانة) وجبل الحيوان في المرحلة المجهر حسب الطلب مع وجها لتثبيت الإطار تحت المجهر ثنائي الفوتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إصلاح الموقف الحيوان التوجه إلى الإطار وجها لتثبيت أن يربط مباشرة إلى مرحلة، وذلك باستخدام قضيب معدني مزروع في الجمجمة. يتم تزويد مستمر Isoflurane والأكسجين إلى الماوس من خلال مخروط الأنف. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان حماية أجهزة كشف المجهر من الإضاءة المحيطة عن طريق إجراء مسح ثنائي الفوتون الليزر في غرفة مظلمة. استخدام الغمر بالماء 20X 25X أو (1.05 الفتحة العددية) عدسة للتصوير. أولا، في إطار البرنامج الموسع للتمنيع، مضان الإضاءة، والحصول على صورة من أنماط سطح الأوعية الدموية في الدماغ على المنطقة في المصالح مع كاميرا CCD لمحاذاة الصورة في المستقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء ثنائي الفوتون مسح بالليزر للحصول على كومة صورة 3-D. وأوليمبوس FV1000يستخدم MPE متعدد الفوتون المجهر في الإعداد لدينا. تم تعيين الإثارة موجة ذات طول ليزر ثنائي الفوتون في نانومتر 920، وتعيين قوة الليزر المنبعثة من الهدف في ما يقرب من 50 ميغاواط. تم الكشف في وقت واحد مضان المنبعثة في قنوات الأخضر والأحمر (مرآة مزدوج اللون في 570 نانومتر، والمرشحات حاجز 495-540 نانومتر في و570-625 نانومتر)، وذلك باستخدام خارجي الكشف photomutiplier نظام ثنائي القناة وضعت على مقربة من العينة. قوس GFP مضان يظهر فقط في القناة الخضراء، في حين الأنسجة لصناعة السيارات في مضان يظهر في كل القنوات 13 و 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مداخن الصورة النمطية لها أبعاد حوالي 320x320x100 ميكرومتر (العرض العمق X X الطول)، والدقة الأفقية من 0.5 ميكرون / بكسل، ودقة رأسية من 3 ميكرون / بكسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على كومة الصورة، والعودة إلى قفص الحيوان وطنه. لا تخل الحيوان حتى السلوكية المقبل والدورة التصوير. تكرار السلوك والإجراءات التصوير عبر يوما ديزيريهأد. استخدام سطح الدماغ المكتسبة سابقا الصورة الدم السفينة لتوجيه مرة أخرى إلى الموقع نفسه التصوير. </li></ol>

<ol>
	<li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity.">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li><li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system.">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li><li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression.">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li><li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity.">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li><li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+growth+factor+and+activity-regulated+gene,+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites.">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li><li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity.">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li><li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+views+of+Arc,+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity.">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li><li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex.">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex.">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging.">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).</li><li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake.">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain.">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li><li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist:+a+review+journal+bringing+neurobiology.">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li><li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey.">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li><li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li><li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy.">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li><li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وطريقة التصوير في الجسم الحي وصفها هنا يمكن فحص المتكرر للقوس التغييرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية مجموعات نفس خلال الأيام متعددة في الحيوانات الحية. انها وسيلة فعالة ومرنة للحصول على معلومات حول الديناميات اللدونة العصبية الجزيئية ذات الصلة في الخلاي?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم معدات </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> FV1000 المسح بالليزر متعددة الفوتون المجهر </td><td> OLYMPUS </td><td> FV1000MPE </td><td> التصوير </td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> جراحة </td></tr><tr><td> Stereotaxis مرحلة عملية جراحية لالفئران </td><td> جهاز هارفارد </td><td> 726335 </td><td> جراحة </td></tr><tr><td> 20X 25X الهدف أو الغمر بالماء </td><td> OLYMPUS </td><td> XLPL25XWMP </td><td> التصوير </td></tr><tr><td> مرحلة المجهر مع وجها لتثبيت الإطار </td><td> والعرف </td><td> N / A </td><td> التصوير </td></tr><tr><td> غرامة ملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11251-20 </td><td> جراحة </td></tr><tr><td> حفر الأسنان لدغ </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 19007-05 </td><td> جراحة </td></tr><tr><td> CCD كاميرا </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-بت </td><td> التصوير </td></tr></tbody></table>

in vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons

قدرة الدماغ على تغيير استجابة لتجربة أمر ضروري لوظيفة الدماغ صحية، وتشوهات في هذه العملية تسهم في مجموعة متنوعة من 1،2 اضطرابات الدماغ. لفهم أفضل للآليات التي دوائر المخ تستجيب لتجربة الحيوان يتطلب القدرة على رصد التغيرات الجزيئية التي تعتمد على الخبرة في مجموعة معينة من الخلايا العصبية، على مدى فترة طويلة من الزمن، في الحيوانات الحية. بينما هو معروف الخبرة والنشاط العصبي لتحريك التغييرات المرتبطة التعبير الجيني في الخلايا العصبية 1،2، أكثر من الأساليب للكشف عن مثل هذه التغييرات لا تسمح المراقبة المتكررة من الخلايا العصبية نفسها خلال الأيام متعددة أو لم يكن لديك ما يكفي من القرار لمراقبة الخلايا العصبية الفردية 3 ، 4. هنا، نحن تصف طريقة يجمع بين الجسم الحي في اثنين من الفوتون المجهري مع مراسل الفلورسنت المشفرة وراثيا لتتبع التغيرات التي تعتمد على تجربة التعبير الجيني في الخلايا العصبية القشرية الفردية على<html> بالطبع من يوم إلى يوم التجربة. واحد من الجينات التي تعتمد على تجربة راسخة هي نشاط التنظيم البروتين يرتبط بها من هيكل الخلية (قوس) 5،6. نسخ من قوس هو بسرعة والتي يسببها النشاط المكثف للغاية من قبل الخلايا العصبية 3، والبروتين الناتج ينظم الإلتقام مستقبلات الغلوتامات من وطويلة الأجل اللدونة متشابك 7. وقد تم التعبير عن قوس تستخدم على نطاق واسع كعلامة الجزيئية لرسم خريطة الدوائر العصبية المشاركة في سلوكيات معينة 3. في معظم تلك الدراسات، تم الكشف عن قوس التعبير في الموقع التهجين أو المناعية في المخ أقسام ثابتة. على الرغم من كشف هذه الأساليب التي تم ترجمة تعبير عن قوس إلى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية مثير بعد تجربة السلوكية، وكيف تم التحقيق في أنماط لا الخلوية التعبير القوس قد تتغير مع نوبات متعددة من التجارب المتكررة أو مميزة خلال الأيام. ntent &quot;&gt; في الجسم الحي ثنائي الفوتون المجهري يوفر وسيلة قوية لدراسة تجربة تعتمد على التغيرات الخلوية في الدماغ المعيشة 8،9. لتمكين الفحص التعبير قوس في الخلايا العصبية الحية من قبل اثنين من الفوتون المجهري، ونحن ولدت في السابق للخبط في خط الماوس التي يتم وضعها مراسل GFP تحت سيطرة المروج قوس الذاتية 10. هذا البروتوكول يصف الاستعدادات والإجراءات الجراحية التصوير لتتبع التجربة التي تعتمد على أنماط التعبير GFP في قوس الفرق العصبية في الحيوانات الحية. في هذه الطريقة ، تم زرع Windows أولا الجمجمة المزمنة في قوس GFP الفئران فوق المناطق القشرية في المصالح. تم تصويرها ثم تلك الحيوانات مرارا وتكرارا من قبل اثنين من الفوتون المجهري بعد نماذج السلوك المطلوب على مدى عدة أيام، وهذا الأسلوب قد تكون قابلة للتطبيق عموما للحيوانات تحمل للصحفيين الفلورسنت الأخرى من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية 4.

<html> يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع التجربة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية في الحيوانات الحية. وإنشاء أول نافذة المزمنة الجمجمة على منطقة القشرية ذات الأهمية في ماوس يحمل مراسل الفلورسنت في التعبير الجيني. ويمكن بعد ذلك اثنين من ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons at JoVE.com

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

تجربة تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية ضرورية لقدرة الدماغ على التكيف استجابة للتحديات السلوكية. على<em&gt; في الجسم الحي</emيوصف&gt; ثنائي الفوتون التصوير هنا طريقة التي تسمح للتتبع مثل هذه التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية من خلال ترميز للصحفيين وراثيا.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

21.5K Views.  National Institute of Mental Health. تجربة تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية ضرورية لقدرة الدماغ على التكيف استجابة للتحديات السلوكية. على في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير هنا طريقة التي تسمح للتتبع مثل هذه التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية من خلال...

Video: In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or thinned-skull 3 preparations. While the open-skull technique is very versatile, it is not optimal for studying microglia because it is invasive and can cause microglial activation. Even though the thinned-skull approach is minimally invasive, the repeated re-thinning of skull required for chronic imaging increases the risks of tissue injury and microglial activation and allows for a limited number of imaging sessions. Here we present a chronic thin-skull window method for monitoring murine microglia in vivo over an extended period of time using two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a stable, accessible, thinned-skull cortical window (TSCW) with an apposed glass coverslip that remains translucent over the course of three weeks of intermittent observation. This TSCW preparation is far more immunologically inert with respect to microglial activation than open craniotomy or repeated skull thinning and allows an arbitrary number of imaging sessions during a time period of weeks. We prepare TSCW in CX3CR1 GFP/+ mice 4 to visualize microglia with enhanced green fluorescent protein to &le;150 &mu;m beneath the pial surface. We also show that this preparation can be used in conjunction with stereotactic brain injections of the HIV-1 neurotoxic protein Tat, adjacent to the TSCW, which is capable of inducing durable microgliosis. Therefore, this method is extremely useful for examining changes in microglial morphology and motility over time in the living brain in models of HIV Associated Neurocognitive Disorder (HAND) and other neurodegenerative diseases with a neuroinflammatory component.

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

We describe a method for repeatedly visualizing murine microglia and circulating monocytes in vivo over hours, days or weeks using transcranial two-photon microscopy. We demonstrate how to prepare a thinned-skull window that allows intermittent observation of quiescent microglia that can be activated by adjacent stereotactic injection of the HIV-1 regulatory protein Tat.

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...