Ce travail a été soutenu par des subventions du National Eye Institute R01EY017925 et R21EY020985 et le financement de la Fondation Dana et Whitehall au PK Nous remercions également Matthieu Petrella de l&#39;aide pour les procédures chirurgicales, Grace Dion pour tracer les dendrites indiquées sur la figure 5A, et Pratik Chhatbar pour commentaires sur le manuscrit.

1. Préparation chirurgicale <ol><li> Induire une anesthésie et surveiller en permanence le rythme cardiaque, la fin de la marée CO 2, EEG, et de la température. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Medical University of South Carolina et étaient basées sur celles que nous avons déjà publié 9,15. </li><li> Exposer la surface dorsale du crâne en coupant la peau avec une lame de scalpel. Disséquer les tissus conjonctifs qui recouvrent l&#39;os à l&#39;aide d&#39;une curette Brudon. Nettoyez l&#39;os en utilisant des applicateurs à embout de coton et gaze de coton. Appliquez la cire à os (au besoin) pour le crâne, pour arrêter les saignements occasionnels à travers de petites veines émissaires. </li><li> Attacher une plaque en titane ou en acier inoxydable tête en acier au crâne (sur la région d&#39;intérêt où la craniotomie sera effectué) à l&#39;aide de ciment dentaire mélangé avec de la peinture noire (voir Matériels). Une ouverture rectangulaire dans le centre de la plaque de tête permet d&#39;accéder à la craniotomie et d&#39;imagerie optique. Attacher une chambre de métal sur le dessus de la plaque de tête. Cette chambre se servir de réservoir de fluide pour l&#39;imagerie avec la lentille d&#39;objectif à immersion d&#39;eau. </li><li> Fixez la plaque de tête à un stade xy en utilisant des poteaux métalliques. </li><li> Amincir une grande surface de l&#39;os à l&#39;intérieur de l&#39;ouverture rectangulaire de la plaque de tête à l&#39;aide d&#39;une fraise de dentiste. La zone à être dilué doit s&#39;étendre bien au-delà des limites de la craniotomie prévu. Le crâne épais de non-rongeurs mammifères doivent être éclaircis si des images haute résolution sont à acquérir auprès du néocortex, car sur le site de craniotomie, l&#39;épaisseur de l&#39;os va dicter l&#39;épaisseur de la gélose entre la lamelle et la surface du néocortex (voir ci-dessous) . </li><li> Percer un trou de 2 x 2 mm contour carré dans l&#39;os de la craniotomie. Rincer la chambre périodiquement avec des produits frais liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour enlever des éclats d&#39;os et de minimiser la dissipation de la chaleur vers le cortex sous-jacent. Appliquez la cire à os selon les besoins, pour arrêter les saignements occasionnels. </li><li> Lift le volet osseux avec une pince n ° 3. </li><li> Retirez tous, mais la couche inférieure de durée à l&#39;aide d&#39;une amende pince (# 5CO) et des ciseaux à ressort Vannas. La dure-mère en non-mammifères rongeurs est épaisse et opaque, mais peut être enlevé en couches distinctes. Le saignement est rare mais peut être arrêté avec Gelfoam et tout résidu de sang doit être doucement retiré de la couche restante de durée en utilisant une pince et un rinçage à l&#39;ACSF. La dernière couche de dure-mère est transparente et les vaisseaux pie-mère doit être clairement visible à travers elle. En sortant de cette dernière couche de durée intacte lors de l&#39;imagerie signal intrinsèque augmente le taux de réussite de chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes pour la phase d&#39;imagerie à deux photons ultérieure de l&#39;expérience (voir discussion). </li><li> Appliquez une goutte d&#39;eau tiède agarose à 2% (dissous dans ACSF) et placer immédiatement une lamelle sur la craniotomie. Vérifiez la craniotomie pour s&#39;assurer que les pulsations respiratoires et cardiovasculaires sont minimes à l&#39;aide d&#39;un microscope chirurgical de dissection ou les oculaires des deux-microscope photonique à champ lumineux mode. </li></ol> 2. Intrinsèque du signal d&#39;imagerie optique <ol><li> Ajouter gel-mousse imbibée d&#39;ACSF autour de l&#39;extérieur du couvre-objet pour empêcher l&#39;agarose de séchage au cours de l&#39;imagerie de signal intrinsèque. </li><li> Fixer le signal de formation d&#39;image CCD intrinsèque à la norme monture C orifice sur le dessus du microscope à deux photons (figure 1). Placez la source de lumière d&#39;éclairage sur la table de l&#39;air près de la scène xy (figure 1A). Positionner et fixer les guides de lumière sur la craniotomie et plaque de tête / chambre (figure 1B). Rétracter la dichroïque primaire et le miroir au-dessous de l&#39;orifice de montage C de sorte que la lumière réfléchie rouge nécessaire pour des signaux intrinsèques passera directement de la craniotomie de la caméra CCD (figure 1C-D). Utilisation de l&#39;objectif 4x air (0,13 NA, 17 mm WD), un champ de 2 x 2 mm de vue est disponible pour l&#39;imagerie signal intrinsèque. </li><li> Insérer un filtre de chaleur dans la light chemin pour éviter le cortex de chauffage. Utilisez un filtre qui laisse passer la lumière verte (546 nm centre λ) et enregistrer une image numérique de référence des vaisseaux sanguins de surface corticale. </li><li> Déplacer le focus z à 500 um en dessous de la surface corticale. Utiliser un filtre rouge (630 nm centre λ) pour illuminer le cortex pour mesurer des signaux intrinsèques. Positionner les guides de lumière de telle sorte que la surface corticale est éclairé de façon uniforme. Protéger la craniotomie de la lumière produite par le stimulus visuel d&#39;affichage. Présenter une séquence de stimuli visuels et d&#39;enregistrer des images de réflectance de données. Pour générer une carte d&#39;orientation à l&#39;intérieur de 10 min, collecter des données correspondant à 4 répétitions d&#39;une séquence de stimuli 8 (4 orientations et deux directions pour chaque orientation). </li><li> Analyser les données de signal intrinsèque pour générer une carte en fausses couleurs orientation. Sélectionnez régions cibles potentielles pour les deux photons étiquetage des neurones, par exemple, l&#39;orientation des singularités moulinet - points dans la carte oùtoutes les orientations préférentielles convergent (Figure 2A). Superposer la carte et l&#39;orientation de l&#39;image de la vascularisation de la surface corticale (figure 2B-C). Utiliser la mise en page de domaines fonctionnels et l&#39;emplacement des bateaux de grandes surfaces pour sélectionner une cible en évitant les endroits les gros vaisseaux sanguins et des artérioles 15. </li></ol> 3. Chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes <ol><li> Préparer une solution de Pluronic 20% / DMSO en ajoutant 1 Pluronic g dans 5 ul de DMSO. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min pour dissoudre complètement le Pluronic. Laissez le mélange refroidir à température ambiante. Ajouter 4 pl du mélange Pluronic / DMSO dans un flacon de 50 mg de calcium de l&#39;indicateur fluorescent Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Puis ajoutez 1 ul d&#39;un colorant rouge (Alexa Fluor 594, solution mère 2 mM) et 35 ul de solution de la pipette (voir Matériel) pour une concentration finale de 1 mM OGB-1 AM. Soniquer la solution pendant une demi-heure dansun bain d&#39;eau glacée, puis centrifuger avec un filtre de 0,45 um pour éliminer les impuretés. </li><li> Tirez une pipette cône long avec un diamètre extérieur de 2,0 à 2.5 pointe um. Chargez 5 ul du mélange de colorants dans la pipette. </li><li> Enlever la couche finale de durée pour faciliter l&#39;insertion de pipette et obtenir la meilleure qualité d&#39;images à deux photons. </li><li> Déterminer l&#39;emplacement exact sur la surface corticale que la pipette doit être placé de manière à atteindre son objectif dans la couche corticale 2/3. Notre cible prédéterminée corticale est une singularité moulinet dans le plan d&#39;orientation (figure 2). La pipette doit être enfoncé dans le cortex à un angle de 30 ° pour passer entre la paroi de la chambre et l&#39;objectif. Ainsi, pour marquer la zone cible 200 um en dessous de la surface corticale, la position d&#39;entrée de pipette sur la surface corticale sera d&#39;environ 350 um latérales de la position de consigne (figure 3 AB). </li><li> Déplacer la table XY (sur lequel l&#39;animal et le pmicromanipulateur ipette sont placés) au centre de la position de l&#39;entrée de la surface corticale titre de l&#39;objectif (figure 3C). Utilisez un objectif 20x ou 40x avec une distance de travail (WD) d&#39;au moins 3 mm (voir Matériel) pour s&#39;assurer que la pipette sera facilement entrer dans le cortex sans toucher l&#39;objectif ou de l&#39;os le long de la paroi de la craniotomie. Une fois la position d&#39;entrée est centrée titre de l&#39;objectif, relever la position Z de l&#39;objectif de 2 mm (figure 3D). Avec l&#39;épi-fluorescence verte de lumière activé pour visualiser le colorant rouge Alexa dans la pipette, l&#39;utilisation de l&#39;axe diagonal de la micromanipulateur pour déplacer la pipette jusqu&#39;à ce que sa pointe est centrée (et concentrée) de l&#39;objectif au dessus de la position d&#39;entrée de la surface corticale ( Figure 3E). </li><li> Abaissez la verticale pipette (le long de l&#39;axe z) jusqu&#39;à ce que la pipette atteint la surface corticale (figure 3F), tout en continuant à visualiser la pointe de pipette à travers le oculars du microscope. Utilisation éclairage sur fond clair, les vaisseaux sanguins de surface corticales et autres membranes méningées (pie-mère et arachnoïde) sont facilement visibles dans la pipette se rapproche de la surface corticale. Si la pipette ne pas atteindre la position souhaitée d&#39;entrée, augmenter la pipette et recalibrer le ciblage sur la base des repères vasculaires sur la surface corticale. </li><li> Retirez l&#39;objectif, mèche excès de liquide céphalorachidien de la craniotomie et sécher l&#39;os adjacent en utilisant des lances d&#39;absorption non pelucheux. Appliquez une goutte d&#39;eau tiède 3% d&#39;agarose (dissous dans ACSF) pour stabiliser le cortex qui est visible à travers la craniotomie (figure 3G). Chez les non-rongeurs, agarose à 3% est nécessaire pour amortir les pulsations de l&#39;absorption réussie de colorants fluorescents par des neurones. Pour l&#39;imagerie optique intrinsèque signal de seulement 2% d&#39;agarose est nécessaire parce que la combinaison de 2% d&#39;agarose et la lamelle assure la stabilité nécessaire. Ici, pas de couvre-objet est utilisé pour l&#39;étape de chargement afin de colorant 3% d&#39;agarose estnécessaire. Après l&#39;agarose est solidifié, insérer un objectif 40x (0,8 NA, 3,3 mm DEO) et re-remplir la chambre avec ACSF. </li><li> Passez du champ lumineux à deux photons de visualisation et de localiser la pointe de la pipette. À l&#39;aide de l&#39;axe diagonal de la micromanipulateur, déplacer la pipette jusqu&#39;à ce que son extrémité atteint la profondeur désirée dans le cortex (figure 3H). Occasionnelles bouffées d&#39;éjection de pression du mélange de colorants (un peu psi, chaque impulsion 0,1 sec) aidera à prévenir la pointe de la pipette de colmatage. Car OGB-1 heures ne devient visible lors de l&#39;entrée des cellules, le rouge Alexa colorant est critique pour la visualisation de la pointe de la pipette à l&#39;intérieur du cortex. </li><li> Avant d&#39;essayer de charger des neurones dans la couche corticale 2/3 avec la pleine dose de colorant, re-concentrer sur l&#39;objectif de la surface corticale pour confirmer la profondeur de la pointe de pipette et faire en sorte que la pointe se trouve à l&#39;emplacement cible en fonction de la disposition des les vaisseaux sanguins de surface. Si la pipette est dans la couche 2/3, de petites bouffées du mélange de colorants devraient éclairer laespace extracellulaire et de révéler un ensemble dense de corps cellulaires circulaires que les ombres sombres. </li><li> Pour le chargement de corps cellulaires neuronaux dans une sphère de diamètre 300-600 um cortex, injecter le mélange de colorants dans l&#39;espace extracellulaire en utilisant 30-90 impulsions, chaque impulsion 1,0 s, 2-10 psi. Les impulsions de pression ne doit pas être si forte que le tissu se déplace. Après l&#39;injection est terminée, attendez quelques minutes, puis retirer la pipette et objective. Attendez pendant 1 heure pour permettre à l&#39;OGB-1 AM à être pleinement prises en livraison par les neurones. </li><li> Retirer l&#39;agarose utilisé pour la charge de colorant et rincer la chambre d&#39;enregistrement. Mettez une petite goutte de 2-3% d&#39;agarose sur la surface et placer rapidement une lamelle sur la craniotomie. Parce que les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière, évitez de surexposer le cortex de champ lumineux ou épi-lumière fluorescente. Insérer une grande ouverture numérique (1,0) 20x objectif dans la monture d&#39;objectif et recentrer la région corticale marquée titre de l&#39;objectif en utilisant la scène xy. Protégez la craniotomie de l&#39;exdes sources de lumière, par exemple des traneous affichage stimulus visuel, en utilisant des couches multiples de matériau panne. </li></ol> 4. Une seule cellule électroporation de colorants fluorescents <ol><li> Pour étudier la morphologie dendritique, préparer une solution de 100 uM Alexa Fluor 594 (dilution 1:20 dans ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 actions). Pour l&#39;imagerie fonctionnelle des dendrites d&#39;un sel d&#39;OGB peuvent être utilisées 16,17. </li><li> Tirez une pipette cône de long avec un diamètre de buse de 1 um et charger 5 ul de colorant dans la pipette. Toutes les autres étapes de cibler un domaine fonctionnel sont identiques à la méthode de chargement en vrac (figures 1-3). Pour positionner la pointe de pipette adjacente à une membrane le corps des cellules neuronales, de surveiller l&#39;augmentation de l&#39;impédance d&#39;électrode et d&#39;appliquer des bouffées de pression de colorant pour éclairer l&#39;espace extracellulaire et de voir les corps cellulaires comme des ombres au cours de deux photons d&#39;imagerie. </li><li> Lorsque la pointe de la pipette est adjacente à une membrane de cellule neuronale corps, utiliser le 800A Axoporator à appliquerImpulsions 1-3 (-8 à -10 V, 10 ms d&#39;impulsion). Le remplissage immédiat du neurone avec le colorant est facilement visualisées avec microscopie à deux photons. Retirer la pipette et de recueillir des images haute résolution des dendrites et des axones in vivo. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous présentons une méthode pour cibler l&#39;étiquetage des corps cellulaires neuronaux (ou dendrites et axones) dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Fusion d&#39;imagerie optique intrinsèque du signal avec la microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer lequel des synapses et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte selon l&#39;une quelconque fonctionnel, que ce soit les corrélats neuronaux de sélectivité avec l&#39;emplacement du neurone dans un pla...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Soutien de la vie / expérience de préparation </td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Vet Webster </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporisateur isoflurane </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Couverture chauffante Commentaires réglementé </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur ECG </td><td> Digicare biomédicale </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificateur EEG </td><td> Systèmes AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Moniteur d&#39;affichage EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> En fin d&#39;expiration CO 2 moniteur </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Optimiser la ventilation </td></tr><tr><td> Les bavures de perçage en carbure pour perçage os </td><td> Henry Schein </td><td> fin (0,5 mm pointe) et grossière (1,25 mm pointe) </td><td></td></tr><tr><td> Ciment pour plaque de tête / chambre </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Black Powder Tempera Peinture </td><td> Sargent Art Inc </td><td> 22-7185 </td><td> Ajouter au ciment pour améliorer la protection contre la lumière et réduire les reflets </td></tr><tr><td> Agarose - type III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Pour minimiser les pulsations pendant le signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie </td></tr><tr><td> Lamelle: 5 ou 8 mm de diamètre, 0,17 mm d&#39;épaisseur </td><td> Précision Monde eninstruments </td><td> 502040, 502041 </td><td> Pour minimiser les pulsations pendant l&#39;imagerie, la lamelle peut être découpé selon les besoins </td></tr><tr><td> Curettes Brudon </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Nettoyage de surface du crâne </td></tr><tr><td> La cire à os </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rapidement arrêter le saignement </td></tr><tr><td> Coton-tige </td><td> Sciences microscopie électronique </td><td> 72308-05 </td><td> Surface de l&#39;os propre et sec </td></tr><tr><td> Dumont # 5co forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-20 </td><td> Prenez différentes couches de dure-mère ou pia </td></tr><tr><td> Vannas Ciseaux Spring </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-03 </td><td> Cut-mère </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Pour arrêter le saignement sur la durée </td></tr><tr><td> Lances d&#39;absorption</td><td> Outils Fine Science </td><td> 18105-01 </td><td> Mèche ultra-rapide et non pelucheux du CSF </td></tr><tr><td> Matériau Blackout </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Bouclier craniotomie </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Teindre préparation / injection </td></tr><tr><td> Le diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-une heures </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Indicateur de calcium </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Filtre centrifuge (0,45 um taille des pores) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Pour éliminer les impuretés avant l&#39;injection </td></tr><tr><td> Verre pipette extracteur </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Verre borosilicaté filamenter capillaire (1,5 mm de diamètre extérieur) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B150F-4 </td><td> Pipette d&#39;éjection Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Pour charger un colorant dans pipette </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Pour positionner la pipette </td></tr><tr><td> Contrôleur d&#39;impulsion de pression </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Pour l&#39;injection sous pression de la teinture </td></tr><tr><td> Une seule cellule électroporateur </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Pour l&#39;électroporation de la teinture </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinsèque imaGing </td></tr><tr><td> Objectif 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Matériel intrinsèque / logiciel </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ logiciel est utilisé pour l&#39;imagerie épisodique </td></tr><tr><td> Caméra CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Voyant d&#39;alimentation source de </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Source lumineuse </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> HAL 100 </td><td> L&#39;intensité lumineuse à la surface corticale est de 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtre vert (pour image vasculaire) </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> λ = 546 nm (bande passante 30 nm) </td><td> Pour une image de référence de la vascularisation de surface </td></tr><tr><td> Filtre Rouge (pour le signal intrinsèque) </td><td> Imagi optiqueng Inc </td><td> λ = 630 nm (bande passante 30 nm) </td><td> Pour collecter des signaux intrinsèques </td></tr><tr><td> Heat filtre </td><td> Optical Imaging Inc </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. À deux photons rig / imagerie </td></tr><tr><td> Microscope à deux photons et les logiciels </td><td> Technologies des Prairies </td><td></td><td> Voir Shen et al. 2012 pour trajet de la lumière, les filtres et la puissance du laser </td></tr><tr><td> Laser Ti: Saphir </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA objectif est utilisé uniquement pour l&#39;alignement de la pipette au-dessus de la craniotomie (pas de deux photons d&#39;imagerie) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olympe </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Table pneumatique </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isole la préparation de vibrations externes </td></tr><tr><td> XY </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Sujet expérimental et micromanipulateur Sutter placés sur scène xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recettes </td></tr><tr><td> Artificielle liquide céphalo-rachidien </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Solution Pipeter 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

Dans le cortex visuel primaire de non-rongeurs mammifères, les neurones sont regroupés en fonction de leur préférence pour les fonctions de relance comme l&#39;orientation 1-4, direction 5-7, dominance oculaire 8,9 et la disparité binoculaire 9. Sélectivité orientation est la caractéristique la plus largement étudiée et une application continue avec une mise en quasi-périodique pour l&#39;orientation préférée est présent sur ​​l&#39;ensemble du cortex visuel primaire 10,11. Intégrant les apports synaptiques, cellulaires et le réseau qui conduisent à des réponses de stimulation sélective de ces cartes fonctionnelles nécessite l&#39;hybridation des techniques d&#39;imagerie qui couvrent sub-micron au millimètre échelles spatiales. À l&#39;imagerie optique intrinsèque signal conventionnel, la disposition générale de cartes fonctionnelles sur toute la surface du cortex visuel peut être déterminé 12. Le développement in vivo de microscopie à deux photons à l&#39;aide de calcium colorants sensibles permet de déterminer la SYNAPTentrée ic arriver à épines dendritiques individuelles 13 ou enregistrement d&#39;activité simultanément à partir des centaines de différents corps cellulaires neuronaux 6,14. Par conséquent, en combinant l&#39;imagerie signal intrinsèque à la résolution spatiale submicronique de microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer exactement quels segments dendritiques et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte fonctionnelle de tout dans le néocortex. Ici, nous démontrons une méthode à haut rendement permettant d&#39;obtenir rapidement une carte d&#39;orientation corticale et en ciblant un micro-domaine de cette carte fonctionnelle pour l&#39;étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents chez un mammifère non-rongeur. Avec le même microscope utilisé pour l&#39;imagerie à deux photons, nous avons d&#39;abord générer une carte d&#39;orientation à l&#39;aide d&#39;imagerie optique intrinsèque du signal. Ensuite, nous montrons comment cibler un micro-domaine d&#39;intérêt en utilisant une micropipette chargée avec de la teinture d&#39;étiquette soit une population de corps cellulaires neuronaux ou l&#39;étiquette d&#39;un seul neurone tels que des dendrites et des axones, les épines sont visibles dansvivo. Nos améliorations par rapport aux méthodes antérieures de faciliter l&#39;examen des neurones relations structure-fonction avec sub-cellulaire résolution dans le cadre du néocortex architectures fonctionnelles.

Pour illustrer la précision de nos méthodes de marquage colorant, nous avons ciblé le plus petit micro-domaine d&#39;une carte fonctionnelle connue dans le néocortex non-rongeur. Peu ponctué toute la carte d&#39;orientation dans le cortex visuel primaire sont des singularités. Ils se produisent en des points où convergent toutes les orientations privilégiées telles que les cartes en fausses couleurs de l&#39;orientation préférée, les régions autour de la singularité regard comme &quot;moulinets&quot; <stro...

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

On décrit une méthode pour l&#39;étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Tout d&#39;abord, l&#39;imagerie optique intrinsèque de signal est utilisé pour obtenir une carte fonctionnelle. Puis microscopie à deux photons est utilisée pour l&#39;étiquette et les neurones d&#39;image dans un domaine micro-de la carte.

Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d&#39;imagerie

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K vues.  Medical University of South Carolina. On décrit une méthode pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Tout d'abord, l'imagerie optique intrinsèque de signal est utilisé pour obtenir une carte fonctionnelle. Puis microscopie à deux photons est utilisée pour l'étiquette et les neurones d'image dans un domaine micro-de la carte.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Dans l&#39;imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Recherche

Neurosciences

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La détection de l&#39;hypoxie dans le cortex de souris microrégionale cérébrale par imagerie à deux photons de fluorescence endogène NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo Imagerie biphotonique d&#39;expérience qui dépendent des changements moléculaires dans les neurones corticaux

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Deux-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des épines dendritiques dans le cortex de souris utilisant un crâne-Diluée Préparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imagerie biphotonique Calcium en Dendrites neuronales dans des tranches de cerveau

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

Imagerie avancée de diffusion dans l'hippocampe des rats avec la blessure cérébrale traumatique douce

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...