نشكر الدكتور ليونارد I. زون في المختبر الذي تم تطوير هذه التقنيات في البداية؛ كوان كريستين والراحل تشي شين بن لهدايا من البلازميدات المستخدمة في هذا العمل؛ جيمس معلن Raible ديفيد للمساعدة في تلوين الأجسام المضادة، وجيمس لNeiswender وحقن مكروي الفيديو. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R00AR056899-03 لCJC

1. الكشف عن المعدلات بداية ظهور سرطان الجلد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء بوابة دخول الحيوانات المستنسخة الأوسط من خلال تضخيم PCR كامل طول الإطار القراءة مفتوحة من الجينات ذات الاهتمام (GOI) وإعادة توحيد pDONR إلى 221 باستخدام BP clonase II (إينفيتروجن). استخدام التكنولوجيا متعددة المواقع بوابة (إينفيتروجن) لp5E_mitfa أعد تجميع، pME_GOI، Tol2kit # 302 p3E_SV40polyA 6 و miniCoopR 5 إلى وضع الجينات ذات الاهتمام تحت المروج mitfa في ناقلات miniCoopR (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 25 بيكوغرام كل استنساخ مع 25 بيكوغرام Tol2 مرنا transposase في واحدة خلية تيراغرام (mitfa: BRAF V600E)؛ P53 (LF)؛ mitfa (LF) الأجنة الزرد متماثلة اللواقح ثلاثة أسباب كما هو موضح سابقا 7. احتضان الأجنة حقن 28.5 ° C. في إزالة أي أجنة ميتة في 24 HPF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الخلايا الصباغية الحيوانات المعدلة وراثيا مع انقاذ في 72 HPF عن طريق وضع طبق بتري تحتوي على أجنة حقن على تشريح microscopه تحت الضوء الساقط على خلفية بيضاء (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات إلى L 3 دبابات في الحضانة لمرفق الزرد في 4 DPF كما هو موضح سابقا 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 2 أشهر، حدد الحيوانات مع واحد على الأقل من منطقة الصباغية الإنقاذ أكبر من 4 مم 2 (الشكل 1A). هناك علاقة قوية بين درجة الانقاذ الخلايا الصباغية في 72 HPF ودرجة الانقاذ الخلايا الصباغية في 2 أشهر. عندما يتم اختيار الأجنة مع الانقاذ الخلايا الصباغية في 72 HPF، فإن الغالبية منهم (~ 80٪) على الأقل منطقة واحدة من الخلايا الصباغية الإنقاذ أكبر من 4 مم 2 في 2 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاشة الحيوانات المحددة الأسبوعية عن وجود أورام (1B الشكل). هناك ارتباط قوي بين التغيرات النسيجية والشكلية. ومن المسلم به أن الانتقال من حميدة الخبيثة على أنه تغيير مورفولوجية الآفات عندما تصبح مرتفعة من السطح للحيوان. عزل الورم الحاملة أنيماLS للدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد مع التقدم في السن في الاسابيع على الإحداثي السيني وسرطان الجلد خالية في المئة على البقاء على قيد الحياة المنسقة. تتم مقارنة مع الحيوانات الخلايا الصباغية التي تعبر عن الجين من الفائدة للسيطرة على الحيوانات التي تعبر عن EGFP (تعزيز الأخضر بروتين فلوري) في الخلايا الصباغية (الشكل 1C). بداية الورم وسيطة لحقن الحيوانات مع miniCoopR-EGFP ما يقرب من 18 أسبوعا. تحديد ما إذا كانت منحنيات مختلفان إحصائيا باستخدام اختبار رتبة السجل. </li></ol> 2. ورم الغزو الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الزرد المعزولة التي تنمي الأورام ظهريا، في المنطقة الواقعة بين الحدود الخلفي من الدماغ المؤخر والحدود الأمامي من الزعنفة الظهرية (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أسبوعين من بداية سرطان الجلد الموت ببطء الأسماك فقا للمبادئ التوجيهية التي حددها الأمريكية البيطرية لوحة الجمعية الطبية حول القتل الرحيم والتي وافقت عليها الجامعة من الوظائف ماساتشوستس كلية الطبتلك الجلسة رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC). على وجه التحديد، يتم وضع الأسماك في طبق مع 0.6 ملغ / مل tricaine حتى جيل الحركة تتوقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في التجويف البريتوني من الاسماك مع مشرط ثم ضع السمك في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لتثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج مع EDTA M 0.5 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ليزيل الكلس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح مع الفورمالين في الكاسيت بين عشية وضحاها، ليذوى 1 ساعة، 3 مرات اضحة مع الزيلين لمدة 1 ساعة ثم علاج مع البارافين 2 مرات لمدة 2 ساعة كل في 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الأنسجة في البارافين في قالب والسماح لها لترسيخ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 5 أقسام ميكرومتر، ميكرومتر واحدة كل 50. يجب أن تكون المقاطع العرضية وخلال الآفة كامل بحيث يمكن التعرف على وجهة أعمق الغزو. متابعة من قبل hematoxylin و تلطيخ يوزين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم غزو الورم عن طريق قياس ما إذا كانت الخلايا السرطانية تبقى خارج الطبقة المكتنزة كولاجيني، غزو في ظهريالجهاز العضلي أو غزو الى مزيد من العمود الفقري (الشكل 2B، C). تحديد الفرق إحصائية بين المجموعتين من العينات. </li></ol> 3. تلوين الأجسام المضادة الخلايا الصباغية مقياس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل PO4 العازلة مع 80 مل 0.1 M 2 HPO نا 4 و 20 مل 0.1M ناه 2 PO 4. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 7.3. تشكل 2X العازلة التي تحتوي على الإصلاح 8،0 ز السكروز، 0.15 مل 0.2M CaCl 2 و 90 مل 0.2M PO 4 العازلة، ودرجة الحموضة 7.3. إذا لزم الأمر ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك ثم جعل ما يصل الى 100 ​​مل مع العازلة 4 PO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصل وزنه إلى 300 ملغ و PFA الصلبة إضافة إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 5 ملي هيدروكسيد الصوديوم إلى وحدة تخزين تساوي الكتلة × 4.5، في ملغ، من PFA (على سبيل المثال 450 UL 5 ملم هيدروكسيد الصوديوم إلى PFA ملغ 100). الحرارة ب 60-70 درجة مئوية مع الهز في بعض الأحيان حتى يتم حل PFA. تدور باستمرار الجسيمات المتبقية واستعادة 20٪ PFA طاف. جعل جديدة في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل تثبيت تحتوي على 1X فايX العازلة و 4٪ PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير السمك في 0،17 ملغ / مل tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الضوء الساقط تحت المجهر تشريح نتف جداول الظهرية باستخدام غرامة ذات الرؤوس الحادة ملقط، مع الحرص على عدم الاضرار النصف الخلايا الصباغية التي تحتوي على مقياس من (الشكل 3A). جداول مباشرة من مكان إلى 1 مل ملقط حل التثبيت واحتضان في درجة حرارة الغرفة، في حين تحول، لساعة 2 ≥. نقل الأسماك إلى أسماك المياه ورصد الأسماك لتأكيد الانتعاش ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الخلايا الصباغية المصطبغة التبييض جداول ثابتة في PBST (1X PBS درجة الحموضة 7.4، 0.1٪ تريتون X-100) 2 مرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 1 مل حل التبييض التي تحتوي على 0،4 الطازجة KOH مل 10٪ و 0.15 مل 30٪ H 2 O 2 في 5 مل مع DH 2 O. وضع أقفال على parafilm أو غطاء لمنع الغاز من الانفجار الأنابيب مفتوحة. تواصل تبيض حتى ذهب الصباغ (10 دقيقة هي الحال) (الشكل 3B، C). يغسل في أوقات PBST أربعة ل5 دقائق في درجة حرارة الغرفةerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة ل30 دقيقة على الأقل في محلول مكون من كتلة 1X PBS درجة الحموضة 7.4، 0.2٪ تريتون X-100، 2 ملغ / مل BSA، DMSO 1٪، نان 0.02٪ 3 و 2٪ مصل الضأن. يستبعد نان 3 إذا النامية مع رد فعل HRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في حل كتلة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. تحتاج إلى أن يكون لا يقل عن 400 ميكرولتر من حل على عينات للحفاظ على المغمورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل جداول 3 مرات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الضد الثانوية مع من 2 ساعة إلى ليلة وضحاها في حل كتلة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار لمدة 10 دقيقة مع دابي PBST + ميكرومتر 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل جداول على شريحة زجاجية في قطرة من vectashield ذلك أن الجانب المقعر من أسفل نحو جداول تواجه الشريحة ووضع غطاء زجاجي الانزلاق عليها. ختم حواف الشريحة مع طلاء الأظافر واضحة ومراقبة الشرائح تحت المجهر مضان (الشكل 3D، E، F، G </stronز&gt;). </li></ol> 4. زرع الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتلقي 2-3 الشهر القديمة كاسبر 9 الأسماك تشعيع مع 25 جراى من أشعة جاما في يوم من الأيام قبل زرع 10. السماح للأسماك في المياه لاسترداد الأسماك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء سمكة الحاملة للورم كما هو موضح سابقا (القسم 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الورم ووضعها في طبق بتري مع فلتر تعقيم حوالي 5 مل PBS مع 0.9x 5٪ FBS. الزهر الورم بشفرة الحلاقة بينما في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعمل في درجة حرارة الغرفة، يسحن مع ماصة P1000 للحصول على خلايا واحد. تشكل وحدة التخزين إلى 25 مل PBS مع فلتر تعقيم 0.9x مع 5٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية خلال 40 ميكرومتر تصفية شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أجهزة الطرد المركزي إيبندورف الطاولة 5810R في 1،500 دورة في الدقيقة (453 إطار التعاون الإقليمي) لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وجعل التعليق الخلية إلى التركيز المطلوب تقريبا (تحمل 10 7 خلايا الورم عن 100 3 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب رانه بالضبط عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ويخفف من التعليق الخلية بحيث حجم حقن النهائي هو ما يقرب من 5 ميكرولتر. على سبيل المثال، إذا الخلايا هي 50000 ليتم حقنه، ينبغي أن تضعف تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 10،000 خلية / ميكرولتر. نفض الغبار الأنبوب الذي يحتوي على التعليق الخلية كل دقيقة لمنع تراكمها قليل من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مقياس 26S (نصيحة شطبة) 701 N 10 حقنة هاميلتون ميكرولتر 2-3 مرات مع الإيثانول بنسبة 100٪ وPBS 0.9x. تحميل المحقنة مع 5 ميكرولتر من التعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأسماك المستفيدة المشع في 0،17 ملغ / مل tricaine. الأسماك مكان على جانبها على Kimwipe رطبة (الشكل 4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار الأسماك بيد واحدة وإدراج إبرة مع شطبة مواجهة بزاوية ° 45 إلى الجناح من الاسماك فوق التجويف البريتوني في منتصف المسافة تقريبا بين الحدود الخلفي من الدماغ المؤخر والحدود الأمامي من الزعنفة الظهرية. خفض بلطف الغواص (الشكل 4B). &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للأسماك في المياه لاسترداد الأسماك الطازجة ومراقبة الأسماك يوميا لمدة engraftment ورم (الشكل 4C). إذا حدث engraftment، ويمكن أيضا استمرار نمو وتطور المرض يمكن ملاحظة. </li></ol>

<ol>
	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة miniCoopR تمكن التعبير عن الجينات ذات الأهمية في الخلايا الصباغية الزرد. هذا النهج يستفيد من حقيقة أن هذا الجين يعمل الزرد mitfa الخلايا بشكل مستقل. لهذا السبب، الخلايا الصباغية انقاذهم من قبل الناقل miniCoopR من المؤكد أن تحتوي على الجينات أي minigene والاهتمام الذي يقت...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> الكواشف بوابة إعادة التركيب </td><td> إينفيتروجن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> المرجع 5 </td></tr><tr><td> Mitfa الأجسام المضادة </td><td></td><td></td><td> المرجع 5 </td></tr><tr><td> FITC الضد الماعز المضادة للأرنب مفتش </td><td> إينفيتروجن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> كاسبر اسماك الزرد </td><td></td><td></td><td> المرجع 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 ميكرولتر الحقنة </td><td> هاميلتون / فيشر </td><td> 14-824 </td><td> ونبسب؛ </td></tr><tr><td> 40 ميكرون فلتر </td><td> BD فالكون / فيشر </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> إينفيتروجن </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

وقد أسفرت دراسات الجينية من السرطانات البشرية ثروة من المعلومات حول الجينات التي تتغير في الأورام 1،2،3. وثمة تحد الناشئة عن هذه الدراسات هو أن يتم تغيير العديد من الجينات، وأنه يمكن أن يكون من الصعب التمييز تغيرات جينية تكون الأورام التي دفعت من تلك التي نشأت بالمناسبة خلال التحول. لرسم هذا التمييز فإنه من المفيد أن يكون هناك مقايسة التي يمكن قياس كميا تأثير جين متغير على بدء الورم وغيرها من العمليات التي تمكن الأورام أن تستمر ونشر. هنا نقدم وسيلة سريعة لفحص أعداد كبيرة من معدلات سرطان الجلد مرشح في الزرد باستخدام نموذج الورم الأصليين 4 أن يشمل الخطوات المطلوبة لبدء سرطان الجلد والصيانة. A كاشف رئيسي في هذا الاختبار هو متجه miniCoopR، الذي أزواج نسخة من النوع البري من مواصفات mitfa عامل الخلايا الصباغية إلى عبارة كاسيت إعادة التركيب في أي من المرشحين ميلويمكن إعادة تجميع الجينات أنوما 5. الناقل miniCoopR لديه minigene الإنقاذ mitfa الذي يحتوي على المروج، فتح الإطار القراءة و3&#39;-غير مترجمة المنطقة من الجين mitfa من النوع البري. لأنها تتيح لنا لجعل البنى باستخدام كامل طول إطارات القراءة المفتوحة للمعدلات سرطان الجلد مرشح. ويمكن بعد هذه الحيوانات المستنسخة الفردية يتم حقنها في تيراغرام خلية واحدة (mitfa: BRAF V600E)؛ P53 (LF)؛ الأجنة الزرد mitfa (LF). يحصل دمج ناقلات miniCoopR من Tol2 بوساطة transgenesis 6 و ينقذ الخلايا الصباغية. لأن تقترن ماديا إلى minigene الإنقاذ mitfa، يتم التعبير عن الجينات المرشحة في الخلايا الصباغية انقاذ، والبعض منها سوف تتطور الى تحويل والأورام. ويمكن قياس تأثير الجين مرشح على بدء سرطان الجلد القتامي الخلية وخصائص منحنيات البقاء على قيد الحياة سرطان الجلد باستخدام خالية من المقايسات غزو، وتلطيخ الأجسام المضادة وفحوصات الزرع.

تم حقن الأجنة الزرد mitfa (LF) مع الناقل الذي يحتوي على الجين الورمي miniCoopR سرطان الجلد SETDB1 5 أو EGFP، كل منها تحت سيطرة المروج mitfa؛ P53 (LF)؛: واحد خلايا تيراغرام (BRAF V600E mitfa). وقد تم اختيار الأجنة مع الانقاذ الخلايا الصباغية وسمح لتنضج. في 2 أشهر من الع...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

ويقدم وسيلة سريعة للكشف عن سرطان الجلد باستخدام معدلات الزرد نموذج الورم الأصليين. فإنه يستفيد من ناقلات miniCoopR الذي يسمح للتعبير عن الجينات المرشحة سرطان الجلد في الخلايا الصباغية. يتم وصف طريقة للحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد، ومقايسة الغزو، بروتوكول للتلوين الأجسام المضادة الخلايا الصباغية نطاق وفحص زرع سرطان الجلد.

الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

screening-for-melanoma-modifiers-using-zebrafish-autochthonous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Views.  University of Massachusetts Medical School. ويقدم وسيلة سريعة للكشف عن سرطان الجلد باستخدام معدلات الزرد نموذج الورم الأصليين. فإنه يستفيد من ناقلات miniCoopR الذي يسمح للتعبير عن الجينات المرشحة سرطان الجلد في الخلايا الصباغية. يتم وصف طريقة للحصول على منحنيات البقاء على قيد الحياة خالية من سرطان الجلد، ومق...

Video: Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

زراعة الخلايا المشتقة المريض وعزل CD133<sup&gt; +</sup&gt; خلايا الجذعية السرطانية المزعومين من الميلانوما

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory and large scale clinical trials has revealed that diabetic complications progress unimpeded via the phenomenon of metabolic memory even when glycemic control is pharmaceutically achieved. Gene expression can be stably altered through epigenetic changes which not only allow cells and organisms to quickly respond to changing environmental stimuli but also confer the ability of the cell to "memorize" these encounters once the stimulus is removed. As such, the roles that these mechanisms play in the metabolic memory phenomenon are currently being examined.
We have recently reported the development of a zebrafish model of type I diabetes mellitus and characterized this model to show that diabetic zebrafish not only display the known secondary complications including the changes associated with diabetic retinopathy, diabetic nephropathy and impaired wound healing but also exhibit impaired caudal fin regeneration. This model is unique in that the zebrafish is capable to regenerate its damaged pancreas and restore a euglycemic state similar to what would be expected in post-transplant human patients. Moreover, multiple rounds of caudal fin amputation allow for the separation and study of pure epigenetic effects in an in vivo system without potential complicating factors from the previous diabetic state. Although euglycemia is achieved following pancreatic regeneration, the diabetic secondary complication of fin regeneration and skin wound healing persists indefinitely. In the case of impaired fin regeneration, this pathology is retained even after multiple rounds of fin regeneration in the daughter fin tissues. These observations point to an underlying epigenetic process existing in the metabolic memory state. Here we present the methods needed to successfully generate the diabetic and metabolic memory groups of fish and discuss the advantages of this model.

Metabolic memory is the phenomenon by which diabetic complications persist and progress unimpeded even after euglycemia is achieved pharmaceutically. Here we describe a diabetes mellitus zebrafish model which is unique in that it allows for the examination of the mitotically transmissible epigenetic components of metabolic memory in vivo.

نموذج من اسماك الزرد مرض السكري والأيض الذاكرة

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

رواية عالية الدقة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تقنية التصوير لدراسة الاستجابة الديناميكية للمنشآت داخل القحف لنمو الورم والتداوي

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

نموذج الزرد ممكن من مرض الكلى المتعدد الكيسات: ضربة قاضية لل<em&gt; wnt5a</em&gt; أسباب الخراجات في الكلى اسماك الزرد

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

ثلاثي الأبعاد نموذج المشارك الثقافة ل-ورم انسجة التفاعل

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic agent melphalan. Briefly, the procedure starts with the setup of a percutaneous veno-venous bypass from the femoral vein to the external jugular vein. Via a laparotomy, catheters are then inserted into the proper hepatic artery and the caval vein. The portal vein and the caval vein, both supra- and infrahepatically, are then clamped. The arterial and venous catheters are connected to a heart lung machine and the liver is perfused with melphalan (1 mg/kg body weight) for 60 min. This way it is possible to locally perfuse the liver with a high dose of a chemotherapeutic agent, without leakage to the systemic circulation.
In previous studies including patients with isolated liver metastases of uveal melanoma, an overall response rate of 33-100% and a median survival between 9 and 13 months, have been reported. The aim of this protocol is to give a clear description of how to perform the procedure and to discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Here, we present a protocol how to perform an isolated liver perfusion (IHP) with melphalan and we also discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

معزولة كبدي الإرواء كعلاج للالانبثاث الكبد من العنبية الميلانوما

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

تقييم-التسلل ورم خلايا الدم البيضاء مجموعات فرعية في ورم تحت الجلد نموذج

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...