אנו מודים לד&quot;ר ליאונרד I. זון שבמעבדה שלו טכניקות אלו פותחו בתחילה; קריסטן קוואן ומאוחר צ&#39;י סל Chien למתנות של פלסמידים משמשים בעבודה זו; ג&#39;יימס ליסטר ודיוויד Raible לקבלת סיוע בצביעת נוגדנים, וג&#39;יימס לNeiswender וידאו microinjection. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R00AR056899-03 לCJC

1. הקרנה למכפילי התחילה מלנומה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת שיבוטי כניסה אמצעית Gateway באמצעות PCR הגברת המסגרת באורך מלא הפתוחה קריאה של גנים של עניין (GOI) ויצרף אל pDONR 221 באמצעות BP clonase השני (Invitrogen). השתמש multisite Gateway טכנולוגיה (Invitrogen) לrecombine p5E_mitfa, pME_GOI, # 302 6 p3E_SV40polyA Tol2kit וminiCoopR 5 למקום גנים של ריבית מתחת אמרגן mitfa בminiCoopR הווקטור (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 25 picograms של כל שיבוט יחד עם 25 picograms Tol2 mRNA transposase לתוך אחד התאים Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); mitfa (LF) עוברי דג זברה פי שלוש הומוזיגוטים כפי שתוארו בעבר 7. דגירת העוברים המוזרקים ב28.5 מעלות צלזיוס הסר את כל עוברים מתים בגיל 24 hpf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בעלי חיים מהונדסים עם מלנוציטים חולצו ב72 hpf ידי הצבת צלחת פטרי המכיל עוברים הזריקו בmicroscop ביתורדואר תחת אור תקרית על רקע לבן (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חיות ל3 טנקי L בחדר ילדים של מתקן דג הזברה בשעת 4 DPF כפי שתואר בעבר 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב2 חודשים, בחר את החיות באזור אחד לפחות של הצלת מלנוציט יותר מ 4 מ&quot;מ 2 (איור 1 א). יש מתאם חזק בין מידת הצלת מלנוציט ב 72 hpf ומידת הצלת מלנוציט ב2 חודשים. כאשר עוברים בעלי הצלת מלנוציט נקטפים בגיל 72 hpf, רובם (~ 80%) יהיה לפחות אזור אחד של הצלת מלנוציט יותר מ 4 מ&quot;מ 2 ב2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך החיות הנבחרות השבועיות לנוכחות של גידולים (1B איור). יש מתאם חזק בין שינויים מורפולוגיים והיסטופתולוגיים. מעבר משפיר לממאיר מוכר כשינוי המורפולוגי כאשר נגעים הפכו העלו מעל פני השטח של בעלי החיים. מבודד האנימה נושאה גידולls למחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר עקומות הישרדות ללא מלנומה עם גיל בשבועות ובabscissa אחוזים מלנומה בהישרדות ללא ordinate. חיות עם מלנוציטים שמבטאים את הגן של עניין הן בהשוואה לבעלי חיים ששולטות המפורש EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) במלנוציטים (התרשים 1C). הופעת הגידול החציוני לבעלי חיים הוזרקו miniCoopR-EGFP היא כ 18 שבועות. קבע האם שתי העקומות הן סטטיסטי שונות בעזרת בדיקת דרגת יומן. </li></ol> 2. Assay פלישת גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דג זברה מבודד שלפתח גידולי dorsally, באזור שבין הגבול האחורי של המוח האחורי וגבול קדמי של סנפיר הגב (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועות לאחר תחילה לנומה להרדים את הדג על פי הנחיות מפורטות על ידי הפנל האמריקאי לרפואת וטרינרית אגודה על המתת חסד ואושר על ידי אוניברסיטת Ins בית הספר לרפואה במסצ&#39;וסטסטיפול בבעלי חיים וtitutional ועדת שימוש (IACUC). באופן ספציפי, דגים ממוקמים לתוך צלחת עם 0.6 מ&quot;ג / המ&quot;ל tricaine עד תנועת זימים מפסיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך בחלל הצפק של הדג עם אזמל ולאחר מכן הנח את הדג בparaformaldehyde 4% (PFA) לילה ב 4 ° C לקיבעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק עם 0.5 M EDTA לילה ב 4 ° C כדי decalcify. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן עם פורמלין בקלטת לילה, לייבש לשעה 1, ברור עם 3 פעמים קסילן לשעה 1 ולאחר מכן טיפול עם פרפין 2 פעמים עבור 2 שעות כל אחת, לפי 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ הרקמה בפרפין בעובש ולאפשר לו לחזק למשך 30 דקות עד 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 5 חלקים 1 מיקרומטר, כל 50 מיקרומטר. הסעיפים צריכים להיות רוחביים ודרך כל הנגע כך שהנקודה העמוקה ביותר של פלישה יכולה להיות מזוהית. עקוב ידי hematoxylin ומכתים eosin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערך את פלישת גידול על ידי מדידה אם תאים סרטניים להישאר מחוץ לשכבה compactum collagenous, לפלוש לתוך הגבשרירים או לפלוש לעוד יותר לתוך עמוד השדרה (האיור 2B, C). לקבוע הבדל סטטיסטי בין שני הסטים של דגימות. </li></ol> 3. כתמים של נוגדן מלנוציטים Scale <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור PO4 חיץ עם 80 מ&quot;ל 0.1 M Na 2 HPO 4 ו 20 המ&quot;ל 0.1M nah 2 PO 4. ודא pH הוא 7.3. איפור חיץ התיקון 2x המכיל סוכרוז 8.0 גרם, 0.15 המ&quot;ל CaCl 0.2m 2 ל 4 חיץ 90 מ&quot;ל 0.2m PO, 7.3 pH. אם יש צורך להתאים את ה-pH ל 7.3 עם NaOH או HCl אז לעשות עד 100 מ&quot;ל עם 4 חיץ פו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול עד 300 מ&quot;ג המוצק PFA ולהוסיף לצינור microcentrifuge. הוסף 5 המ&quot;מ NaOH לנפח שווה למסת 4.5 X, במ&quot;ג, של PFA (למשל 450 ul 5 המ&quot;מ NaOH עד 100 מ&quot;ג PFA). חום ב60-70 מעלות צלזיוס עם רעד עד PFA נמס מזדמן. ספין למטה חלקיקים נותרים ולשחזר 20% PFA supernatant. הפוך טריה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסה המכילה קיבעון 1x Fiחיץ x ו 4% PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם את הדגים ב0.17 מ&quot;ג / המ&quot;ל tricaine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אור אירוע תחת מיקרוסקופ לנתח למרוט קשקשי גב באמצעות מלקחיים חדים קנס בקצוות, נזהרים שלא לפגוע במחצית מלנוציט המכיל הסולם (איור 3 א). קשקשי מקום ישירות מהמלקחיים לתוך פתרון 1 מיליליטר קיבעון ו דגירה בטמפרטורת חדר, תוך כדי הפעלה, ל≥ 2 שעות. להעביר את הדגים למי דגים ולנטר את הדגים כדי לאשר שחזור מוצלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלנוציטים פיגמנט אקונומיקה לשטוף סולמות קבועים בPBST (1x PBS pH 7.4, 0.1% Triton X-100) 2 פעמים למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. הוסף 1 מיליליטר תמיסת כלור טרי המכילה 0.4 המ&quot;ל KOH 10% ו0.15 המ&quot;ל 30% H 2 O 2 ב5 מ&quot;ל עם DH 2 O. שים על מנעולי parafilm או מכסה כדי למנוע מגז שהתפוצץ הצינורות פתוחים. המשך עד הלבנת הפיגמנט נעלם (10 דקות הן טיפוסיות) (איור 3B, C). שטוף בזמני PBST 4 למשך 5 דקות בטמפ &#39;החדרerature. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק לפחות 30 דקות בתמיסה מורכבת מבלוק 1x PBS pH 7.4, 0.2% Triton X-100, 2 מ&quot;ג / המ&quot;ל BSA, 1% DMSO, 0.02% NaN 3 וכבש 2% בסרום. השאר את 3 NaN אם מתפתח עם תגובת HRP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני בפתרון בלוק הלילה בטמפרטורת חדר. אתה צריך לפחות 400 μl של פתרון את הדוגמות, כדי לשמור אותם מתחת למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכף 3 פעמים למשך 30 דקות בPBST בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן משני מ 2 שעות ללילה בפתרון בלוק בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם למשך 10 דקות עם PBST + DAPI מיקרומטר 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים למשך 5 דקות עם PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הסולמות על שקופית זכוכית בירידה של vectashield כך שהצד הקעור של המאזניים כלפי מטה לכיוון השקף ומניח פיסת זכוכית לכסות עליהם. לאטום את הקצוות של שקופיות עם לק הברור ולבחון את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (האיור 3D, E, F, G </stronז&gt;). </li></ol> 4. ההשתלה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חודש 9 דגי הנמען 2-3 ישנים casper ידי הקרנה עם 25 Gy של קרינת גמא יום לפני ההשתלה 10. אפשר הדגים להתאושש במי דגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים דגי גידול נושאה כפי שתואר לעיל (סעיף 2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את הגידול ולשים אותו בצלחת פטרי עם כ 5 מיליליטר מסנן מעוקר 0.9x PBS עם 5% FBS. קוביות גידול עם סכין גילוח ואילו בתמיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בטמפרטורת חדר, עם triturate P1000 פיפטה כדי לקבל תאים בודדים. הפוך את עוצמת הקול עד 25 מ&quot;ל עם מעוקר 0.9x PBS מסנן עם 5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסנן דרך מסננת רשת מיקרומטר 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בצנטריפוגה שולחן 5810R אפנדורף ב1500 סל&quot;ד (453 RCF) למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהפוך את השעית תא לריכוז רצוי בערך (תניח 10 7 תאים לגידול 3 מ&quot;מ 100). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב tהוא מספר תא מדויק באמצעות hemocytometer ולדלל את השעית התא, כך שנפח ההזרקה הסופי הוא כ 5 μl. לדוגמה, אם 50,000 תאים הם להיות מוזרקים, השעית התא צריכה להיות מדוללת לריכוז סופי של 10,000 תאים / μl. פליק הצינור המכיל את השעית תא בכל כמה דקות, כדי למנוע יצירת גושים של התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו מד 26s (קצה שיפוע) מזרק המילטון μl 701 N 02-03 אוקטובר פעמים עם אתנול 100% ו0.9x PBS. טען את המזרק עם 5 μl של השעית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם דגי הנמען המוקרנים ב0.17 מ&quot;ג / המ&quot;ל tricaine. דגים במקום על צידו על Kimwipe לח (איור 4 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את הדגים ביד אחת ולהכניס את המחט עם השיפוע כלפי מעלה בזווית של 45 ° לאגף של הדג מעל חלל הצפק בערך באמצע הדרך בין הגבול האחורי של המוח האחורי וגבול קדמי של סנפיר הגב. בעדינות לוחץ על המתג (איור 4 ב). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הדגים להתאושש במי דגים טריים ולבחון את הדגים מדי יום לengraftment גידול (האיור 4C). אם engraftment אירע, המשך צמיחה והתפתחות מחלה יכולות גם להיות שנצפו. </li></ol>

<ol>
	<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma.">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li><li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma.">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li><li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma.">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li><li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset.">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li><li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tol2kit:+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs.">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function.">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis.">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת miniCoopR מאפשרת ביטוי של גנים של עניין מלנוציטים דג זברה. גישה זו מנצלת את העובדה שגן mitfa דג הזברה פועל תא אוטונומי. מסיבה זו, מלנוציטים חולצו על ידי וקטור miniCoopR בטוחים כדי להכיל minigene וכל גן של עניין שאליו הוא מצמיד באופן פיזי. מלנוציטים הצילו הם נראים בבירור ונית...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> ריאגנטים רקומבינציה Gateway </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> עיון 5 </td></tr><tr><td> נוגדן Mitfa </td><td></td><td></td><td> עיון 5 </td></tr><tr><td> עיזים נוגדני IgG נגד ארנב FITC </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> מעבדות וקטור </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> קספר דג זברה </td><td></td><td></td><td> התייחסות 9 </td></tr><tr><td> 701N 10 מזרק μl </td><td> המילטון / פישר </td><td> 14-824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 מיקרומטר סינון </td><td> BD פלקון / פישר </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

screening for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model

מחקרים הגנומי של סרטן האנושי הניבו שפע של מידע על גנים ששינו בגידולי 1,2,3. אתגר נובע ממחקרים אלה הוא שגנים רבים הם שינו, וזה יכול להיות קשה להבחין שינויים גנטיים שהובילו tumorigenesis מאלה שהתעוררו במקרה במהלך הפיכה. כדי לצייר הבחנה זו היא מועילה יש assay שיכול כמותית למדוד את ההשפעה של גן השתנה בייזום גידול ותהליכים אחרים שייאפשרו גידולים להתמיד ולהפיץ. כאן אנו מציגים אמצעי מהיר כדי לסנן כמויות גדולות של מלנומה מכפילי מועמד בדג זברה באמצעות 4 מודל גידול כבני מקום שמקיפים את פעולות הנדרשות לייזום מלנומה ותחזוקה. מגיב מפתח בassay זה הוא וקטור miniCoopR, שזוגות העתקה פרועה סוג של גורם מפרט מלנוציט mitfa לקלטת רקומבינציה שער שאליו מל המועמדגני anoma ניתן recombined 5. וקטור miniCoopR יש minigene הצלת mitfa המכיל מקדם, מסגרת קריאה פתוחה ואזור 3&#39;-מתורגם של גן mitfa פראי מהסוג. זה מאפשר לנו לבצע מבנים באמצעות מסגרות קריאה פתוחות באורך מלא של מלנומה מכפילי מועמד. שיבוטים בודדים אלה לאחר מכן ניתן להזריק לתוך תא Tg היחיד (mitfa: BRAF V600E); (LF) עוברי דג זברת mitfa; p53 (LF). וקטור miniCoopR מקבל משולב על ידי transgenesis Tol2 בתיווך 6 ומציל מלנוציטים. משום שהם מצמידים פיסיים mitfa הצלת minigene, גני המועמדים באים לידי הביטוי במלנוציטים חולצו, שחלקם יהפכו ולהתפתח לגידולים. ההשפעה של גן המועמד בייזום לנומה ומאפייני תא מלנומה ניתן למדוד באמצעות עקומות הישרדות ללא מלנומה, מבחני פלישה, מכתים נוגדן מבחני השתלה.

אחד תאי Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (LF); (LF) עוברי mitfa דג זברה הוזרקו וקטור miniCoopR מכיל אונקוגן לנום SETDB1 5 או EGFP, כל אחד תחת השליטה של אמרגן mitfa. עוברים בעלי הצלת מלנוציט נבחרו ואפשרו לבוגרים. ב2 חודשים של גיל עם הצלת חי מלנוציט יותר מ 4 מ&quot;מ 2 נבחרו. הח...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model at JoVE.com

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

screening-for-melanoma-modifiers-using-zebrafish-autochthonous-tumor

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K Views.  University of Massachusetts Medical School. דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתו?...

Video: Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

הערכת שינויים teratogenic במודל דג הזברה של חשיפה אלכוהול עוברית

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory and large scale clinical trials has revealed that diabetic complications progress unimpeded via the phenomenon of metabolic memory even when glycemic control is pharmaceutically achieved. Gene expression can be stably altered through epigenetic changes which not only allow cells and organisms to quickly respond to changing environmental stimuli but also confer the ability of the cell to "memorize" these encounters once the stimulus is removed. As such, the roles that these mechanisms play in the metabolic memory phenomenon are currently being examined.
We have recently reported the development of a zebrafish model of type I diabetes mellitus and characterized this model to show that diabetic zebrafish not only display the known secondary complications including the changes associated with diabetic retinopathy, diabetic nephropathy and impaired wound healing but also exhibit impaired caudal fin regeneration. This model is unique in that the zebrafish is capable to regenerate its damaged pancreas and restore a euglycemic state similar to what would be expected in post-transplant human patients. Moreover, multiple rounds of caudal fin amputation allow for the separation and study of pure epigenetic effects in an in vivo system without potential complicating factors from the previous diabetic state. Although euglycemia is achieved following pancreatic regeneration, the diabetic secondary complication of fin regeneration and skin wound healing persists indefinitely. In the case of impaired fin regeneration, this pathology is retained even after multiple rounds of fin regeneration in the daughter fin tissues. These observations point to an underlying epigenetic process existing in the metabolic memory state. Here we present the methods needed to successfully generate the diabetic and metabolic memory groups of fish and discuss the advantages of this model.

Metabolic memory is the phenomenon by which diabetic complications persist and progress unimpeded even after euglycemia is achieved pharmaceutically. Here we describe a diabetes mellitus zebrafish model which is unique in that it allows for the examination of the mitotically transmissible epigenetic components of metabolic memory in vivo.

דגם דג זברה של סוכרת וזכרון מטבולית

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

רומן ברזולוציה גבוהה<em&gt; בvivo</em&gt; טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

מודל אפשרי דג הזברה של מחלת כליות פוליציסטיות: מציאה של<em&gt; Wnt5a</em&gt; גורם ציסטות בכליות דג הזברה

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal cells. The tumor microenvironment is comprised of a variety of cell types, such as fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, pericytes and bone-marrow-derived cells, embedded in the extracellular matrix (ECM). Cancer-associated fibroblasts (CAFs) have a pro-tumorigenic role through the secretion of soluble factors, angiogenesis and ECM remodeling. The experimental models for cancer cell survival, proliferation, migration, and invasion have mostly relied on two-dimensional monocellular and monolayer tissue cultures or Boyden chamber assays. However, these experiments do not precisely reflect the physiological or pathological conditions in a diseased organ. To gain a better understanding of tumor stromal or tumor matrix interactions, multicellular and three-dimensional cultures provide more powerful tools for investigating intercellular communication and ECM-dependent modulation of cancer cell behavior. As a platform for this type of study, we present an experimental model in which cancer cells are cultured on collagen gels embedded with primary cultures of CAFs.

Here we present a protocol to co-culture in three-dimensions, which is useful for investigating multicellular interactions and extracellular matrix-dependent modulation of cancer cell behavior. In this experimental model, cancer cells are cultured on collagen gels embedded with human cancer-associated fibroblasts.

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Isolated Hepatic Perfusion as a Treatment for Liver Metastases of Uveal Melanoma

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic agent melphalan. Briefly, the procedure starts with the setup of a percutaneous veno-venous bypass from the femoral vein to the external jugular vein. Via a laparotomy, catheters are then inserted into the proper hepatic artery and the caval vein. The portal vein and the caval vein, both supra- and infrahepatically, are then clamped. The arterial and venous catheters are connected to a heart lung machine and the liver is perfused with melphalan (1 mg/kg body weight) for 60 min. This way it is possible to locally perfuse the liver with a high dose of a chemotherapeutic agent, without leakage to the systemic circulation.
In previous studies including patients with isolated liver metastases of uveal melanoma, an overall response rate of 33-100% and a median survival between 9 and 13 months, have been reported. The aim of this protocol is to give a clear description of how to perform the procedure and to discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

Here, we present a protocol how to perform an isolated liver perfusion (IHP) with melphalan and we also discuss IHP as a treatment option for liver metastases of uveal melanoma.

כבדית זלוף המבודד לטיפול בכבד גרורות של מלנומה של הענביה

Isolated hepatic perfusion (IHP) is a procedure where the liver is surgically isolated and perfused with a high concentration of the chemotherapeutic ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

הערכה של תת-יקוציט חדירת גידול בדגם גידול תת עורי

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

הזרקה של תאים syngeneic Murine מלנומה מנת לקבוע את פוטנציאל גרורתי שלהם בתוך הריאות

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...