وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DK093625 لLH، وDK069909 وDK047757 إلى JHL) وVA (جائزة الاستحقاق I01BX000820 إلى JHL). ونود أن نشكر الدكتور مايكل حزمة والدكتور جي وفي جامعة ولاية بنسلفانيا اسماك الزرد الأساسية لتوفير الدعم الضروري.

بيان الأخلاق: ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب الزرد من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية. 1. إعداد Morpholino <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم وتركيب الترجمة حجب (AUG-) وتثبيط لصق (Splice-) لمكافحة الشعور morpholino (MO) [أليغنوكليوتيد لهذا الجين من الفائدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1A). يرجى الاطلاع على معلومات الشركة المصنعة في الجدول 1. يتم شحن المنظمات الأعضاء كما أسهم مجفف بالتجميد في عبوات زجاجية: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عالية الجودة الماء المعقم للنفايات وقوارير زجاجية على اعادة تعليق أشهر للتركيز النهائي من 25 ميكروغرام / ميكرولتر. تأكد من أن قليل النوكليوتيد يذوب تماما. وإذا كان بعض بقايا صلبة، تسخين قارورة تحتوي على محلول المخزون قليل النوكليوتيد عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق ودوامة لفترة وجيزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين محلول المخزون MO في RT. لا تخزينها في 4 درجات مئوية أو -20 °، C بسبب انخفاض درجات الحرارة يمكن أن يسبب قليل النوكليوتيد MO لربط الجدار حاوية. قياس تركيز محلول المخزون باستخدام مقياس الطيف الضوئي (يرجى الرجوع إلى TABLE1) في كل مرة يتم حل الأسهم MO الجديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل العمل MO في يوم حقن عن طريق تمييع الحل الأسهم مع الدرجة العالية الماء المعقم إلى الجرعة المطلوبة. إضافة 0.5٪ الفينول الأحمر للوصول إلى تركيز 0.05٪. على سبيل المثال، لجعل الحل العمل 5 ميكرولتر مع تركيز 15 نانوغرام / NL، إضافة 3 ميكرولتر MO حل سهم و 0.5 ميكرولتر 0.5٪ الفينول الأحمر إلى 1.5 ميكرولتر من الماء. ملاحظة: مع هذا تركيز العمل، كل قطرة (500 رر) الحقن يحتوي على 7.5 نانوغرام من MO واثنين من قطرات تحتوي على 15 نانوغرام من MO. </li></ol> 2. إعداد جهاز حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزجاج شراء الإبر وانسحب قبل (انظر الجدول 1 للحصول على معلومات مفصلة). بدلا من ذلك، وسحب الإبرة واي حقن الزجاجث مجتذب الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على ضاغط الهواء وضبط ضغط الإعداد ل50 رطل. بدوره على المجهر مصدر الضوء تشريح وبيكو مضخة حقن الصغرى وضبط الإعدادات كما يلي: عقد ضغط 20 رطل، إخراج ضغط 10 رطل، قيمة الفترة من 2.5 و 100 μsec مجموعة من النابضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الزجاج إبرة قبل سحبها مع 5 ميكرولتر من محلول الحقن ووضع الإبرة في وضع عمودي مع طرف إلى الانخفاض. الانتظار حتى يصل كل الحل طرف الإبرة مع عدم وجود فقاعات الهواء مرئية. ضع حامل إبرة في الموقف المناسب المقبل لالمجهر وادخال الإبرة الزجاج في حامل. ضبط زاوية الحقن الى 45 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب رأس الإبرة في عرض تحت المجهر، وارتفاع قبالة المرحلة، والتركيز على نحافة المنطقة من غيض. قطع رأس إبرة مع ملاقط نقطة غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مسطرة وأنبوب شعري مع القطر الداخلي من 0.15 ملم جنبا إلى جنب تحت المجهر.حقن المحلول في واحدة من نهاية الأنابيب الشعرية لجعل عمود السائل. ضبط الوقت الإخراج لتصل إلى كل 17 قطرات لكل 1 ملم طول عمود السائل، ثم حجم كل قطرة من 1 NL (حجم قطرة = π س دائرة نصف قطرها 2 × طول (من عمود السائل) / عدد (قطرات). ملاحظة: انخفاض يبلغ قطرها 0.1 ملم تعطي حجم الحقن حوالي 500 رر (حجم قطرة = 4/3 س س π دائرة نصف قطرها 3). </li></ol> 3. إعداد أسمدة اسماك الزرد الأجنة وحقن مع Morpholinos <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تيراغرام (wt1b: GFP) المعدلة وراثيا أزواج تربية الزرد وفقا لبروتوكولات تنشر لتربية الزرد القياسية والصيانة. جمع الأجنة بعد تفرخ الطبيعي، والاحتفاظ بها في 10 سم طبق بتري مملوءة بالماء E3 (5MM كلوريد الصوديوم، 0.17mM بوكل، 0.33 ملي CaCl 2، 0.33 ملي MgSO 4). بدء حقن MO على الفور 13. مراقبة الجنين التشكل تحت المجهر والتأكد من حقن MO هو في واحدة-مرحلة الخليوي، أو في موعد لا يتجاوز المرحلة أربعة خلايا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجنة إلى طبق بتري 10 سم مع إسفين على شكل أحواض أجار. نضح الماء E3 اضافية واضغط بلطف الأجنة في أحواض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلاعب في الأجنة مع ممص مكروى لتصور 1 خلية الأجنة مرحلة تحت المجهر تشريح. اختراق المشيمه ثم صفار البيض لحقن واحدة أو قطرتين من MO في صفار البيض (1 قطرة = 500 رر). نقل الأجنة المحقونة إلى 10 سم طبق بتري بالماء E3 واحتضان عند 28.5 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، وإزالة الأجنة الميتة وتسجيل عدد من الأجنة المحقونة. استبدال الماء E3 في طبق كل 24 إلى 48 ساعة. </li></ol> 4. التجارب النمط الظاهري الإنقاذ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد orthologue من الأنواع آخر لديه مختلف بنية الزوج القاعدة الأساسية (عادة 3-7 عدم التطابق الزوج القاعدة) وذلك، من مقاومة للMO، للانقاذ. على سبيل المثال، في هذه التجربة، اخترناالماوس لأن تسلسل الماوس Wnt5a مرنا يختلف عن تسلسل الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم التمهيدي مع مجموعة من التمهيدي إلى الأمام بدأت في موقع متعدية والتمهيدي العكسي عند مقربة من نهاية المنطقة الترميز مرنا. إضافة تسلسل T7 المروج في 5&#39;- نهاية تسلسل التمهيدي إلى الأمام. في هذه التجربة، وكنا ما يلي تسلسل التمهيدي. إلى الأمام: 5&#39;- TAA تاك GAC TCA CTA العلامة GGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA أ 3 &quot;وعكس: 5&#39;- TCA CTT الائتلاف GAC GTA CTG gtc- 3&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء 50 ميكرولتر البلمرة المتسلسل (PCR) مع مجموعة التمهيدي (0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي) مصممة فوق و 0.1 ميكروغرام قالب DNA التي تحتوي على الماوس تسلسل Wnt5a [كدنا مع برنامج PCR التالية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. 35 دورات من 95 درجة مئوية (30 ثانية)، 58.5 ° C (30 ثانية)، 72 ° C (1 دقيقة)؛ وخطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانتهاء رانه دورة، تشغيل 2 ميكرولتر من المنتج PCR على agarose هلام 1٪ للتأكد من أن الفرقة هو الحجم الصحيح. تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحقق من تركيز الحمض النووي مع معمل. تخزين المنتج PCR المنقى في -20 ° C أو استخدامها مباشرة في توج النسخ RNA في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف في المختبر توج مرنا مع مجموعة تخليق الحمض النووي الريبي توج وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تمييع مرنا في 20 ميكرولتر المياه مجانا ريبونوكلياز وتحديد تركيز. قسامة الحمض النووي الريبي وتخزينها في -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الحقن، وإعداد محلول العمل في مرنا مع ريبونوكلياز الماء المعقم مجانا. لاحظ أن 40 خريج عموما أعلى جرعة RNA الذي آثار غير محددة أو السامة من الحمض النووي الريبي لا تحدث. حافظ على حل العمل على الجليد. حقن الجنين مع MO ثم مرنا الإنقاذ، أو شارك في حقن كلاهما معا. على سبيل المثال، إذا كان تركيز prepar مرناإد في الخطوة 4.5 هو 0.6 ميكروغرام / ميكرولتر، إضافة 0.67 ميكرولتر من الرنا المرسال (0.4 ميكروغرام) إلى 4.33 ميكرولتر من ريبونوكلياز المياه مجانا لجعل تركيز النهائي من 0.08 ميكروغرام / ميكرولتر، ثم قطرة واحدة (500 رر) من كل حقنة يحتوي على 40 خريج من مرنا. إعداد MO كما هو موضح في الخطوة 3. </li></ol> 5. إعداد الأجنة المحقونة التصوير الفلورسنت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة في 28.5 درجة CO / N، إضافة 0.003٪ N-الفنيل (PTU) إلى الماء E3 لمنع التصبغ، مما يؤثر مراقبة هيكل سليفة الكلوة باستخدام المجهر مضان. ومع ذلك، لا تضيف PTU قبل تكون المعيدة، لأنه يؤثر على التطور الجنيني المبكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 48 HPF، dechorionate الأجنة مع ملاقط غرامة يدويا. التقاط صور ل48 و 72 الأجنة HPF تحت المجهر تشريح الضوء. ملاحظة: يمكن أن تؤخذ هذه الصور من دون تخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما يقرب من 10 دقيقة قبل التصوير تحت المجهر مضان، تخدير الأجنة عن طريق وضعها في10 سم طبق بتري تحتوي على 160 ميكروغرام / مل مخزنة تريكين. الانتظار لمدة 5-10 دقائق، ثم مسة خفيفة الزرد للتأكد من أنها لا تتحرك وبالتالي التخدير هو العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن يتم تخدير الأجنة، جبل لهم في 3٪ السليلوز الميثيل وتوجيهها في وضعية الرقود تحت المجهر تشريح (يرجى الرجوع إلى الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة هيكل سليفة الكلوة تحت المجهر مضان (يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1) والتقاط الصور في تكبير مختلفة (10X 20X و). </li></ol>

<ol>
	<li>Choi, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+deficiency+causes+ciliary+abnormalities+and+cystic+kidneys.">Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys.</a> J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).</li><li>Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+pronephros:+a+model+for+understanding+cystic+kidney+disease.">Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease.</a> Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).</li><li>Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+number+and+size+in+relation+to+age,+kidney+weight,+and+body+surface+in+normal+man.">Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man.</a> Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).</li><li>Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number+in+patients+with+primary+hypertension.">Nephron number in patients with primary hypertension.</a> N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).</li><li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+number,+renal+function,+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice.">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li><li>Gerlach, G. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organogenesis+in+the+zebrafish:+insights+into+vertebrate+nephrogenesis+and+regeneration.">Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).</li><li>Igarashi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+nonmammalian+organisms+for+studies+of+kidney+development+and+disease.">Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).</li><li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesonephric+development+and+regeneration+using+transgenic+zebrafish.">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+a+novel+Nek-family+kinase+causes+cystic+kidney+disease+in+the+mouse+and+in+zebrafish.">A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish.</a> Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).</li><li>Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephrocystin-4+is+required+for+pronephric+duct-dependent+cloaca+formation+in+zebrafish.">Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Wnt5a+in+prostate+gland+development.">The role of Wnt5a in prostate gland development.</a> Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).</li><li>Andre, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt+coreceptor+Ryk+regulates+Wnt/planar+cell+polarity+by+modulating+the+degradation+of+the+core+planar+cell+polarity+component+Vangl2.">The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2.</a> J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease.">Autosomal dominant polycystic kidney disease.</a> Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

مرض الكلى المتعدد الكيسات (PKD) هي واحدة من الأسباب الرئيسية للنهاية مرحلة المرض الكلوي في البشر ويتميز تشكيل التدريجي الكيس، وتضخم الكلى، والتنمية أنبوب صغير غير طبيعية 14. راثي PKD السائد (ADPKD) هو مرض وراثي الذي تحور إما PKD1، ترميز polycystin-1 (PC1)، أو PKD2، ترميز polycystin-2 (PC2)...

وقد استخدمت على نطاق واسع الزرد (دانيو rerio) الأجنة كنموذج لدراسة تطوير الكلى ومرض الكلى المتعدد الكيسات. وهناك العديد من المزايا لاستخدام الزرد كنموذج للحيوانات: جدوى دراسة التفاعلات الوراثية، والقدرة على استخدام العقاقير morpholinos (MO) للبروتين ضربة قاضية، وفرصة لفحص بسرعة أعداد كبيرة من الأجنة، وسهولة عرض الظواهر الجهاز في اليرقات 1 الحية. وسليفة الكلوة هي الكلى الأول لتطوير في الفقاريات وهي وظيفية في الزرد اليرقات 2. هيكل سليفة الكلوة الزرد مقارنة بسيطة نسبيا إلى الكلوة التالية الثدييات، والكلى الثالث والأخير لتطوير في الثدييات. نفرون هو وحدة عمل الكلى، مع كل الكلى البشرية تحتوي على ما بين 500،000-1،000،000 النيفرون 3،4 وكل الكلى الماوس وجود ما يقرب من 13،000 النيفرون 5، مما يجعل من الصعب مراقبة هيكل كليون واحد طن كلى الانسان أو الماوس. الزرد اثنين فقط النيفرون، ولكل كليون الزرد يحتوي على كافة المكونات الرئيسية وجدت في الكبيبة والأنابيب من الفئران والبشر 6 وأنواع الخلايا الكلوية المتخصصة مماثلة. بالمقارنة مع النماذج الفقاريات الأخرى مثل الضفدع، وكليون الزرد أكثر شبها نفرون الثدييات لأنه يحتوي على نظام مغلق 7. في السنوات الأخيرة، تم التسلسل الجينوم الزرد، والسماح للمقدمة واسعة من الأدوات الوراثية، والموارد متحولة واسعة، ومجموعات من خطوط مراسل المعدلة وراثيا في نماذج الزرد. أشكال سليفة الكلوة الزرد بين 12-72 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ويمكن تصور بسهولة في الأجنة شفافة. بروتين ورم في WILM في WT1 هو عامل أساسي للتنمية الكلى. خطوط الزرد المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج wt1b تيراغرام (wt1b: GFP) تظهر GFP expression تقع تحديدا في المناطق سليفة الكلوة في الأجنة الزرد، بدءا من 17 HPF 8. سحاف الكلية (NPHP)، جسمية متنحية أمراض الكلى الكيسي، والتي تسببها طفرات الجينات NPHP 9. NPHP4 ضربة قاضية من قبل morpholino تسبب تشكيل الكيس في تيراغرام (wt1b: GFP). الأسماك 10 لذلك، هذا السمك المعدلة وراثيا هو نموذج مناسب لمراقبة الهياكل الكلى وتشكيل الكيس أثناء التطور الكلى. الأهم من ذلك، تأثير جهري التنمية الكلى يمكن دراستها باستخدام هذه السلالة في وقت وبكفاءة العمل. وتصف ورقتنا استخدام تيراغرام (wt1b: GFP) الأسماك كنموذج لتصور تشكيل الكيس الكلى بعد تعديل الجينات. كنا البدء ولصق الموقع مكافحة الشعور المنظمات الأعضاء لاسقاط الجين wnt5a في الزرد. Wnt5a هو بروتين سكري يفرز غير متعارف عليه من عائلة WNT التي تلعب دورا هاما في تطوير مختلف الأجهزة وبعد الولادة الخلويةوظيفة 11. Wnt5a يعمل من خلال مسارات WNT غير متعارف عليها، بما في ذلك قطبية خلية مستو (PCP) المسار، الذي تم العثور على لعب دور في انقسام الخلايا الموجهة خلال استطالة الأنبوبية الكلوية. Wnt5a ينظم WNT / PCP المسار من خلال تشكيل مجمع مع مستقبلات التيروزين كيناز مثل (ريك)، والتي transduces مزيد Wnt5a الإشارات من خلال تشكيل مجمع مع VANGL البروتين قطبية خلية مستو 2 (Vangl2)، وبالتالي تعزيز الاستقرار Vangl2 12. عيوب في مسار PCP يمكن أن يؤدي إلى انقسام الخلايا بشكل عشوائي وتسبب تشكيل الكيس الكلوي. استخدمنا تيراغرام (wt1b: GFP) خط الزرد لمراقبة تشكيل الكيس الكلى التالية wnt5a ضربة قاضية. تيراغرام (wt1b: GFP) نموذج الزرد يسمح التصوير الحي والمراقبة في الوقت المناسب من هيكل الكلى. بعد wnt5a ضربة قاضية، تم العثور على تشكيل الكيس الكلى ابتداء من الساعة 24 HPF. في 72 HPF، الخراجات يمكن العثور عليها في الكبيبات والأنابيب القريبة. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها إلى screen الجينات الأخرى التي قد تتسبب في تشكيل الكيس الكلى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1135">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">0.5% Phenol-Red</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P0290</td>
			<td style="width:491px;">Color indicator for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Morpholino</td>
			<td style="width:229px;">Genn Tools, LLC</td>
			<td style="width:195px;">(customized)</td>
			<td>Customized designed to the gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:221px;">Pre-pulled needle</td>
			<td style="width:229px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:195px;">MINJ-PP</td>
			<td style="width:491px;">If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">T7 mMessage Kit</td>
			<td style="width:229px;">Ambion</td>
			<td style="width:195px;">1344</td>
			<td>For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">N-Phenylthiourea</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">P7629</td>
			<td>For prevention of melanization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tricaine</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">A5040</td>
			<td>Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Methyl Cellulose</td>
			<td style="width:229px;">Sigma</td>
			<td style="width:195px;">M-0387</td>
			<td>For position of zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td style="width:229px;">Qiagen</td>
			<td style="width:195px;">28104</td>
			<td>For purification of PCR product for cap RNA synthesis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:229px;">Promega</td>
			<td style="width:195px;">U1511</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Tag DNA Polymerase</td>
			<td style="width:229px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:195px;">10342-053</td>
			<td>For PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;"></td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Equipment</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">NanoDrop sepctrophotometer</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:195px;">ND-1000</td>
			<td>For measure morpholino and RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Air Compressor</td>
			<td style="width:229px;">Werther International, Inc.</td>
			<td style="width:195px;">Panther Compact 106</td>
			<td>Air source for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Pico micro-injection pump</td>
			<td style="width:229px;">World Precision Instruments Inc</td>
			<td style="width:195px;">PV830 Pnematic PicoPump</td>
			<td>Other types of microinjection system can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Micro-manuplator</td>
			<td style="width:229px;">World Precision Instruments Inc</td>
			<td style="width:195px;">MMJR</td>
			<td>Right-handed (MMJL for left handed)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Needle holder</td>
			<td style="width:229px;">World Precision Instruments Inc</td>
			<td style="width:195px;">5430-ALL</td>
			<td>To hold needle for micromanipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dumont Tweezers</td>
			<td style="width:229px;">Fine Surgical Tools</td>
			<td style="width:195px;">11253-20</td>
			<td>For breaking off the needle tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Dissecting microscope</td>
			<td>Leica M205C&#160;</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>For observing and imaging zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Fluorscence microscope</td>
			<td>Zeiss Axio Obserer D1m &#160;</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>For imaging zebrafish pronephros</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:221px;">Capillary tube (I.D 0.15 mm)</td>
			<td>VitroCom</td>
			<td style="width:195px;">CV1525Q-100</td>
			<td>For measure the volume of each injected drop</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a possible zebrafish model of polycystic kidney disease: knockdown of wnt5a causes cysts in zebrafish kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

وقد تحقق Wnt5a نهدم عن طريق إدخال الترجمة حجب MO (AUG-MO) أو اكسون / إنترون لصق الحدود MO (لصق-MO) إلى الأجنة الزرد في مرحلة خلية واحدة. وAUG-MO يستهدف كودون بداية، وبالتالي يمنع كلا رسالة wnt5a الأم واقحي. ولصق-MO يستهدف الموقع الثالث المانحة لصق ويمنع فقط نص اقحي من wnt5a (?...

Watch this Scientific Journal Video about A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys at JoVE.com

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

نموذج الزرد ممكن من مرض الكلى المتعدد الكيسات: ضربة قاضية لل<em&gt; wnt5a</em&gt; أسباب الخراجات في الكلى اسماك الزرد

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

a-possible-zebrafish-model-polycystic-kidney-disease-knockdown-wnt5a

Research

JoVE Journal

Medicine

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

11.0K Views.  Eastern Virginia Medical School. We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish. 

Video: A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and teleost fish retain a remarkable capacity for cardiac regeneration with little or no scarring throughout life2,3. It is not known why only some non-mammalian vertebrates can recreate a complete organ from remnant tissues4,5. To understand the molecular and cellular differences between regenerative responses in different species, we need to use similar approaches for inducing acute injuries.
In mammals, the most frequently used model to study cardiac repair has been acute ischemia after a ligation of the coronary artery or tissue destruction after cryoinjury6,7. The cardiac regeneration in newts and zebrafish has been predominantly studied after a partial resection of the ventricular apex2,3. Recently, several groups have established the cryoinjury technique in adult zebrafish8-10. This method has a great potential because it allows a comparative discussion of the results obtained from the mammalian and non-mammalian species.
Here, we present a method to induce a reproducible disc-shaped infarct of the zebrafish ventricle by cryoinjury. This injury model is based on rapid freezing-thawing tissue, which results in massive cell death of about 20% of cardiomyocytes of the ventricular wall. First, a small incision was made through the chest with iridectomy scissors to access the heart. The ventricular wall was directly frozen by applying for 23-25 seconds a stainless steel cryoprobe precooled in liquid nitrogen. To stop the freezing of the heart, fish water at room temperature was dropped on the tip of the cryoprobe. The procedure is well tolerated by animals, with a survival rate of 95%.
To characterize the regenerative process, the hearts were collected and fixed at different days after cryoinjury. Subsequently, the specimen were embedded for cryosectioning. The slides with sections were processed for histological analysis, in situ hybridization and immunofluorescence. This undertaking enhances our understanding of the factors that are required for the regenerative plasticity in the zebrafish, and provide new insights into the machinery of cardiac regeneration. A conceptual and molecular understanding of heart regeneration in zebrafish will impact both developmental biology and regenerative medicine.

Zebrafish represents a valuable model to study the mechanisms of heart regeneration in vertebrates. Here, we present a protocol for induction of a heart infarct in adult zebrafish using cryoinjury. This method results in massive cell death within 20% of the ventricular wall, similar to that observed in mammalian infarcts.

الاستقراء من احتشاء عضلة القلب في الزرد الكبار باستخدام Cryoinjury

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being analyzed 1, 2. This classical banding technique, however, is not reliable in identifying complex chromosomal aberrations such as those associated with cancer. To overcome the limitations of the banding technique, Spectral Karyotyping (SKY) is introduced to provide much reliable information on chromosome abnormalities.
SKY is a multicolor fluorescence in-situ hybridization (FISH) technique to detect metaphase chromosomes with spectral microscope 3, 4. SKY has been proven to be a valuable tool for the cytogenetic analysis of a broad range of chromosome abnormalities associated with a large number of genetic diseases and malignancies 5, 6. SKY involves the use of multicolor fluorescently-labelled DNA probes prepared from the degenerate oligonucleotide primers by PCR. Thus, every chromosome has a unique spectral color after in-situ hybridization with probes, which are differentially labelled with a mixture of fluorescent dyes (Rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC and Cy5.5). The probes used for SKY consist of up to 55 chromosome specific probes 7-10.
The procedure for SKY involves several steps (Figure 1). SKY requires the availability of cells with high mitotic index from normal or diseased tissue or blood. The chromosomes of a single cell from either a freshly isolated primary cell or a cell line are spread on a glass slide. This chromosome spread is labeled with a different combination of fluorescent dyes specific for each chromosome. For probe detection and image acquisition,the spectral imaging system consists of sagnac interferometer and a CCD camera. This allows measurement of the visible light spectrum emitted from the sample and to acquire a spectral image from individual chromosomes. HiSKY, the software used to analyze the results of the captured images, provides an easy identification of chromosome anomalies. The end result is a metaphase and a karyotype classification image, in which each pair of chromosomes has a distinct color (Figure 2). This allows easy identification of chromosome identities and translocations. For more details, please visit Applied Spectral Imaging website (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
SKY was recently used for an identification of chromosome segregation defects and chromosome abnormalities in humans and mice with Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD), a genetic disease characterized by dysfunction in primary cilia 11-13. Using this technique, we demonstrated the presence of abnormal chromosome segregation and chromosomal defects in ADPKD patients and mouse models 14. Further analyses using SKY not only allowed us to identify chromosomal number and identity, but also to accurately detect very complex chromosomal aberrations such as chromosome deletions and translocations (Figure 2).

Spectral Karyotyping (SKY) is an advanced cytogenetics technique to identify genomic and chromosomal aberrations. This technique takes advantage of chromosome painting probes, which allow classification of all chromosomes. SKY can also identify complex chromosome aberrations and segregation defects in mice and humans with various diseases, including polycystic kidney disease.

الطيفية Karyotyping إلى دراسة حالة شذوذ الكروموسومات في البشر والفئران مع مرض الكلى المتعدد الكيسات

Conventional method to identify and classify individual chromosomes depends on the unique banding pattern of each chromosome in a specific species being ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory and large scale clinical trials has revealed that diabetic complications progress unimpeded via the phenomenon of metabolic memory even when glycemic control is pharmaceutically achieved. Gene expression can be stably altered through epigenetic changes which not only allow cells and organisms to quickly respond to changing environmental stimuli but also confer the ability of the cell to "memorize" these encounters once the stimulus is removed. As such, the roles that these mechanisms play in the metabolic memory phenomenon are currently being examined.
We have recently reported the development of a zebrafish model of type I diabetes mellitus and characterized this model to show that diabetic zebrafish not only display the known secondary complications including the changes associated with diabetic retinopathy, diabetic nephropathy and impaired wound healing but also exhibit impaired caudal fin regeneration. This model is unique in that the zebrafish is capable to regenerate its damaged pancreas and restore a euglycemic state similar to what would be expected in post-transplant human patients. Moreover, multiple rounds of caudal fin amputation allow for the separation and study of pure epigenetic effects in an in vivo system without potential complicating factors from the previous diabetic state. Although euglycemia is achieved following pancreatic regeneration, the diabetic secondary complication of fin regeneration and skin wound healing persists indefinitely. In the case of impaired fin regeneration, this pathology is retained even after multiple rounds of fin regeneration in the daughter fin tissues. These observations point to an underlying epigenetic process existing in the metabolic memory state. Here we present the methods needed to successfully generate the diabetic and metabolic memory groups of fish and discuss the advantages of this model.

Metabolic memory is the phenomenon by which diabetic complications persist and progress unimpeded even after euglycemia is achieved pharmaceutically. Here we describe a diabetes mellitus zebrafish model which is unique in that it allows for the examination of the mitotically transmissible epigenetic components of metabolic memory in vivo.

نموذج من اسماك الزرد مرض السكري والأيض الذاكرة

Diabetes mellitus currently affects 346 million individuals and this is projected to increase to 400 million by 2030. Evidence from both the laboratory ...

Assessment of Vascular Function in Patients With Chronic Kidney Disease

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this is only partially explained by traditional CVD risk factors. Vascular dysfunction is an important non-traditional risk factor, characterized by vascular endothelial dysfunction (most commonly assessed as impaired endothelium-dependent dilation [EDD]) and stiffening of the large elastic arteries. While various techniques exist to assess EDD and large elastic artery stiffness, the most commonly used are brachial artery flow-mediated dilation (FMDBA) and aortic pulse-wave velocity (aPWV), respectively. Both of these noninvasive measures of vascular dysfunction are independent predictors of future cardiovascular events in patients with and without kidney disease. Patients with CKD demonstrate both impaired FMDBA, and increased aPWV. While the exact mechanisms by which vascular dysfunction develops in CKD are incompletely understood, increased oxidative stress and a subsequent reduction in nitric oxide (NO) bioavailability are important contributors. Cellular changes in oxidative stress can be assessed by collecting vascular endothelial cells from the antecubital vein and measuring protein expression of markers of oxidative stress using immunofluorescence. We provide here a discussion of these methods to measure FMDBA, aPWV, and vascular endothelial cell protein expression.

The degree of vascular dysfunction and contributing physiological mechanisms can be assessed in patients with chronic kidney disease by measuring brachial artery flow-mediated dilation, aortic pulse-wave velocity, and vascular endothelial cell protein expression.

تقييم وظيفة الأوعية الدموية في المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن

Patients with chronic kidney disease (CKD) have significantly increased risk of cardiovascular disease (CVD) compared to the general population, and this ...

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular mechanisms responsible for the disease, and are very convenient for rapid drug screening and testing of promising therapies. A limiting factor in these studies is often the lack of efficient non-invasive methods for sequentially analyzing the anatomical and functional changes in the kidney. Magnetic resonance imaging (MRI) is the current gold standard imaging technique to follow autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) patients, providing excellent soft tissue contrast and anatomic detail and allowing Total Kidney Volume (TKV) measurements.A major advantage of MRI in rodent models of PKD is the possibility for in vivo imaging allowing for longitudinal studies that use the same animal and therefore reducing the total number of animals required. In this manuscript, we will focus on using Ultra-high field (UHF) MRI to non-invasively acquire in vivo images of rodent models for PKD. The main goal of this work is to introduce the use of MRI as a tool for in vivo phenotypical characterization and drug monitoring in rodent models for PKD.

Use of Ultra-high Field MRI in Small Rodent Models of Polycystic Kidney Disease for In Vivo Phenotyping and Drug Monitoring

The use of ultra-high field MRI as a non-invasive way to obtain phenotypic information of rodent models for polycystic kidney disease and to monitor interventions is described. Compared with the traditional histological approach, MRI images can be acquired in vivo, allowing for longitudinal follow-up.

استخدام فائقة MRI الميداني في القوارض الصغيرة نماذج من مرض الكلى المتعدد الكيسات ل<em&gt; في فيفو</em&gt; Phenotyping والدواء المراقبة

Several in vivo pre-clinical studies in Polycystic Kidney Disease (PKD) utilize orthologous rodent models to identify and study the genetic and molecular ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.

نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن ميتوتريكسات في الزرد الكبار

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

تقييم لوظيفة الكلي في نماذج الماوس من المرض الكبيبي

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

متساوي القياس كونتراكتيليتي القياس الشريان المساريقي العلوي الماوس باستخدام أسلاك ميوجرافي

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...