وأيد هذا العمل من قبل كوري إعادة الإدماج منحة ماري (IRG249084). ونحن نشكر جميع أعضاء المختبر Kurant.

لمتابعة ديناميات إزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي يجب أن يكون المسمى اثنين من السكان من الخلايا: الخلايا البلعمية والخلايا أفكارك. بمناسبة السكان الخلية البلعمية نستخدم خط ذبابة الفاكهة التي تحتوي على علامة تليفون-cytGFP، التي تصف الخلايا البلعمية حصرا في الجنين: الضامة، والخلايا الدبقية الأديم الظاهر 8. يمكن للمرء استخدام علامات مختلفة للخلايا البلعمية، بما في ذلك خطوط تحتوي على السائق GAL4 كرية دموية محددة (CRQ-GAL4) أو الدبقية محددة GAL4 السائق (الريبو-GAL4) ومراسل الفلورسنت المشفرة جينيا تحت السيطرة UAS (UAS GFP-). لرصد الخلايا أفكارك خلال إزالة الخلايا الميتة التي نستخدمها موت الخلايا المبرمج مختلفة / علامات البلعمة. Annexin V (المسابر الجزيئية) بمثابة مؤشر مبكر لخلايا أفكارك 10؛ Phiphilux (OncoImmunin) هي الفلورة كاسباس 3 الركيزة، التي يستخدم كأساس apopto في وقت لاحقجهاز الأمن والمخابرات علامة، وLysoTracker (المسابر الجزيئية) يعمل كعلامة يبلوع. نحن حقن هذه الكواشف باستخدام نظام حقن مكروي PicoPump PV 820. 1. يستعد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغراء هيبتان: انبسط الشريط مزدوجة من جانب ووضع بقدر ما يمكنك في قارورة التلألؤ، وملء مع هيبتان، ختم قارورة مع parafilm، والصخور لمدة 24 ساعة. إضافة هيبتان إذا الغراء سميكا جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسمح الذباب لتضع على عصير العنب قبل تحسنت وحة آغار + الخميرة لصق لمدة 2 ساعة، ثم نقل لوحة إلى 25 درجة مئوية لمدة 10-12 ساعة (يعتمد على المرحلة المطلوبة) قبل حقن مكروي والوقت الفاصل بين التسجيلات من الأجنة حقن. نحن جمع أجنة من لوحات أجار الحفاظ على 25 درجة مئوية، وبالتالي توفير الأجنة من مرحلة 15 أو 16 من التنمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد إبرة: لإعداد إبر للحقن، ونحن نستخدم &quot;أداة سوتر &#39;ساحبة إبر وخيوط زجاجية رقيقة الجدران (أنابيب شعرية FHC). واندلعت غيض من تجميع الشعريةN ليبلغ قطرها 0.5-2 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ساترة مع الغراء: تلميح باستخدام ماصة تفريق قطرة من الغراء هيبتان في سطر واحد في منتصف ساترة. اتركها لتجف لبضع ثوان. إعداد عدد قليل من هذه coverslips على. </li></ol> 2. تحضير الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأجنة من لوحات أجار ونقلها إلى مصفاة الخلية (علوم الحياة SPL) باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة ومياه جارية. ويقام على مصفاة كوب لجمع مياه الصرف الصحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجنة في مصفاة الخلية باستخدام المياه حتى يتم إزالة كافة عجينة الخميرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجف الماء الزائد عن طريق مسح السطح الخارجي للمصفاة باستخدام Kimwipes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية في طبق بتري نظيفة وإضافة ما يكفي من مواد التبييض 50٪ لتغطية الأجنة في مصفاة الخلية. Dechorionate الأجنة لمدة 2 دقيقة في بعض الأحيان (2-3 مرات) التحريك لهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع المياه على نطاق واسع حتى الأجنة فضفاض رائحة التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية في نظيفةطبق بتري وتغطية الأجنة مع الماء لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء في إعداد الأجنة، تحميل 1 ميكرولتر من كاشف المطلوب في اثنين من الإبر (أحيانا إبرة يمكن انسداد). يستغرق حوالي 5 دقائق للسائل للوصول إلى رأس الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة مستطيلة من العنب آغار عصير ووضعها على شريحة المجهر. نقل الأجنة dechorionated من طبق بيتري إلى قطعة أجار باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت المجهر تشريح فلوري حدد بشكل صحيح نظموا الأجنة معربا عن علامة GFP باستخدام فرشاة الطلاء الرطب وتضع كل جنين على مقربة من حافة قطعة أجار في صف واحد تلو الآخر (الشكل 1A). ينبغي أن توضع الأجنة مع جانبهم بطني حتى لالبلعمة التصوير بواسطة الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي (CNS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حوالي 10 الأجنة في صف واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق الأجنة إلى ساترة المغلفة في الوسط مع شريط من الغراء هيبتان (الشكل 1B، C </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة في غرفة الجفاف لمدة 5 دقائق (وهذا يعتمد على نسبة الرطوبة في الغرفة والمبلغ الذي يتم حقنه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تجفيف تغطية الأجنة مع زيت الهالوكربون 700 (سيجما) لتجنب المزيد من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة على شريحة المجهر مع الأجنة مواجهة. قد كنت وضعت قطرة من الماء على الشريحة لمنع الانتقال من ساترة. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن. موقع الحقن هو عادة على الجانب الوحشي في منتصف الجنين. </li></ol> 3. حقن الجنين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الإبرة إلى مياداة مجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكسر غيض إبرة وضعت على حافة ساترة في مجال الرؤية وضبط الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. تحرك بحذر جدا ساترة حتى يضرب رأس الإبرة ويكسر ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع التركيز على الأجنة، ضع الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرة السائل من إبرة. ذلك يعني تم غيض إبرةكسر جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون لمس حامل إبرة نقل الجنين في إبر وحقن تسقط في جنين. نقل الجنين بعيدا والمضي قدما إلى المرحلة التالية حتى يتم حقن كل الأجنة. </li></ol> 4. التصوير نحن صورة الأجنة على مجهر متحد البؤر المقلوب مع الهدف 40X أو 100X. ونحن نتطلع لوضع الجنين بشكل جيد مع الجهاز العصبي المركزي في الوسط، مما يدل على التعبير GFP قوي ووضع العلامات الجيدة من الخلايا أفكارك بعد الحقن. للمرة تسجيلات انقضاء الأجنة الحية نختار عادة 5 أو 6 شرائح متحد البؤر (2 ميكرون سميكة لكل منهما). بعد ذلك، ونحن جعل الإسقاط من 3 شرائح (6 سماكة ميكرون) من أجل مراقبة الخلايا بأكملها. نحن نستخدم علامات لخلايا أفكارك التي هي مستقرة ولا التبييض بسهولة. لتجنب التبييض نجعل التسجيلات في فترات من 60 ثانية GFP. في بعض الحالات قد تبدأ الأجنة المتداولخلال ذلك الوقت من تسجيل الفيديو. ولذلك، فإننا نلقي نظرة مرة واحدة في حين لاخر على تسجيل من أجل وقف والبدء من جديد إذا لزم الأمر.

<ol>
	<li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+to+die+for:+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm,+fly+and+mouse.">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+maturation:+going+through+the+acid+test.">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li><li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytic+signaling:+you+can+touch,+but+you+can't+eat.">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li><li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+elegant+complexity.">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis.">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li><li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+the+CNS+clear:+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila.">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li><li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons.">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li><li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos.">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li><li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved.">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

إزالة الخلايا أفكارك هي المرحلة الأخيرة الحاسمة من موت الخلايا المبرمج، وهو ديناميكية للغاية. لذا دراسات الوقت الحقيقي من عملية ذات أهمية قصوى. نحن هنا وصف البروتوكول الذي يتيح رصد إزالة الخلايا أفكارك في العيش النامية أجنة ذبابة الفاكهة. في هذا الإجراء، يجب أن...

القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة اللاحقة أمر بالغ الأهمية لنمو الجنين وكذلك للتوازن الأنسجة في الكبار. البلعمة من الخلايا أفكارك أو إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية التي تسير في أربع خطوات: (1) تعيين البالعات إلى الخلية أفكارك (&#39;العثور-ME&#39;)، (2) الاعتراف الخلية كهدف للالبلعمة ( &#39;أكل لي&#39;) و (3) الغمر، تليها (4) نضوج يبلوع وتدهور جسيم أفكارك 1-5. هناك نوعان من البالعات: الضامة &#39;المهنية&#39; والخلايا الجذعية غير الناضجة، و &#39;غير مهنية&#39; الخلايا المجاورة الأنسجة المقيمين، والتي هي حاسمة لإزالة الخلايا أفكارك أثناء تطوير metazoan 6،7. ذبابة الفاكهة في التنمية، والقضاء على خلايا زائدة عن الحاجة من خلال موت الخلايا المبرمج يحدث في ثلاثة ممراحل عين، لأول مرة في منتصف إلى أواخر الجنين، ثم في منتصف خادرة، ومرة ​​أخرى في الكبار في وقت مبكر. خلال مرحلة التطور الجنيني تتم إزالة الجسيمات أفكارك بواسطة البالعات &#39;المهنية&#39;، الضامة، والأديم الظاهر و&#39;غير مهنية&#39; والدبقية 8،9. في أعمالنا السابقة حددنا مستقبلات البلعمية، لمدة ستة ميكرون تحت (SIMU)، وهو ما يعبر عنه حصرا في الخلايا البلعمية خلال مرحلة التطور الجنيني. باستخدام المروج تليفون ولدت لدينا علامة محددة للسكان الخلية البلعمية (سيمو-cytGFP) والتي تمكننا من رصد الضامة، الأديم الظاهر والدبقية في وقت واحد في وضع الجنين ايف 8. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام علامات محددة للخلايا أفكارك في مراحل مختلفة من موت الخلايا المبرمج، ونحن قادرون على تتبع تحركات لإزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Annexin V </td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>A35108</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PhiPhiLux G2D2</td>
 <td>OncoImmunin</td>
 <td>A304R2G-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LysoTracker</td>
 <td>Molecular Probes</td>
 <td>L-7528</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Halocarbon oil 700</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>H8898</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Capillary tubing</td>
 <td>FHC </td>
 <td>30-30-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell Strainer</td>
 <td>SPL</td>
 <td>93100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paintbrush</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

live imaging of apoptotic cell clearance during drosophila embryogenesis

القضاء السليم للخلايا غير المرغوب فيها أو الشاذة من خلال موت الخلايا المبرمج والبلعمة لاحقة (إزالة الخلايا الميتة) أمر بالغ الأهمية من أجل التنمية طبيعي في جميع الكائنات الحية metazoan. إزالة الخلايا أفكارك هي عملية ديناميكية للغاية يرتبط ارتباطا وثيقا مع موت الخلايا؛ تعتبر الخلايا أفكارك unengulfed بالكاد في الجسم الحي في ظل ظروف طبيعية. من أجل فهم الخطوات المختلفة لإزالة الخلايا الميتة ومقارنة البالعات &#39;المهنية&#39; - الضامة، والخلايا الجذعية إلى &#39;غير مهنية&#39; - خلايا الأنسجة المجاورة المقيمين، في الجسم الحي التصوير المباشر لعملية قيمة للغاية. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة التخليص الخلية أفكارك في العيش أجنة ذبابة الفاكهة. لمتابعة ديناميات الخطوات المختلفة في البلعمة نستخدم علامات محددة للخلايا أفكارك والبالعات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا رصد نظامين بلعمية في نفس الوقت: الضامة &#39;المهنية&#39; و &#39;نصف profeالدبقية ssional &#39;في الجهاز العصبي المركزي النامية (CNS). الطريقة الموضحة هنا توظف الجنين ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا للدراسات في الوقت الحقيقي من إزالة الخلايا الميتة.

وتظهر إطارات ممثل عن فيلم التي وصفت الخلايا أفكارك مع Annexin V، ويطلق عليها الخلايا الدبقية، الأديم الظاهر والضامة مع تليفون-cytGFP في الشكل 2. كل الإطار هو إسقاط 3 شرائح 2 ميكرومتر لكل منهما. يتم وضع الجنين من مرحلة 15 بشكل ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis at JoVE.com

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

هنا نحن تصف طريقة فعالة لدراسة ديناميات إزالة الخلايا الميتة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. هذا الأسلوب يعمل العيش<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة كنموذج قوية لرصد البلعمة للخلايا أفكارك باستخدام وضع العلامات المحددة للخلايا أفكارك والبالعات.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

live-imaging-apoptotic-cell-clearance-during-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

13.4K Views.  Technion-Israel Institute of Technology. هنا نحن تصف طريقة فعالة لدراسة ديناميات إزالة الخلايا الميتة في الجسم الحي. هذا الأسلوب يعمل العيش ذبابة الفاكهة الأجنة كنموذج قوية لرصد البلعمة للخلايا أفكارك باستخدام وضع العلامات المحددة للخلايا أفكارك والبالعات.

Video: Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

إعداد وتطوير الكبار ذبابة الفاكهة الأمخاخ والشبكية للتصوير لايف

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

نهج عكس الوراثية لاختبار التكرار وظيفية خلال مرحلة التطور الجنيني

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

إعداد فردية ذبابة الفاكهة البيض غرف للتصوير لايف

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

يعيش التصوير من البروتينات التي تحمل علامات GFP في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; البويضات

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both the female and male germ lines of Drosophila have contributed greatly to the current understanding of meiosis as well as stem cell biology. Excellent protocols are available in the literature for the isolation and imaging of Drosophila ovaries&#160;and testes3-12. Herein, methods for the dissection and preparation of Drosophila testes for microscopic analysis are described with an accompanying video demonstration. A protocol for isolating testes from the abdomen of adult males and preparing slides of live tissue for analysis by phase-contrast microscopy as well as a protocol for fixing and immunostaining testes for analysis by fluorescence microscopy are presented. These techniques can be applied in the characterization of Drosophila mutants that exhibit defects in spermatogenesis as well as in the visualization of subcellular localizations of proteins.

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Methods for isolating and preparing Drosophila testes samples (live and fixed) for imaging by phase-contrast and fluorescence microscopy are described herein.&#160;

تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخصية

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by available technologies, apoptosis is generally assumed to occur shortly thereafter. Caspases can cleave many functional and structural components to cause rapid and complete cell destruction within a few minutes. However, accumulating evidence indicates that in normal healthy cells the same caspases have other functions, presumably at lower enzymatic levels. Studies of non-apoptotic caspase activity have been hampered by difficulties with detecting low levels of caspase activity and with tracking ultimate cell fate in vivo. Here, we illustrate the use of an ultrasensitive caspase reporter, CaspaseTracker, which permanently labels cells that have experienced caspase activity in whole animals. This in vivo dual color CaspaseTracker biosensor for Drosophila melanogaster transiently expresses red fluorescent protein (RFP) to indicate recent or on-going caspase activity, and permanently expresses green fluorescent protein (GFP) in cells that have experienced caspase activity at any time in the past yet did not die. Importantly, this caspase-dependent in vivo biosensor readily reveals the presence of non-apoptotic caspase activity in the tissues of organ systems throughout the adult fly. This is demonstrated using whole mount dissections of individual flies to detect biosensor activity in healthy cells throughout the brain, gut, malpighian tubules, cardia, ovary ducts and other tissues. CaspaseTracker detects non-apoptotic caspase activity in long-lived cells, as biosensor activity is detected in adult neurons and in other tissues at least 10 days after caspase activation. This biosensor serves as an important tool to uncover the roles and molecular mechanisms of non-apoptotic caspase activity in live animals.

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

To detect healthy cells in whole animals that contain low levels of caspase activity, the highly sensitive biosensor designated CaspaseTracker was generated for Drosophila. Caspase-dependent biosensor activity is detected in long-lived healthy cells throughout the internal organs of adult animals reared under optimized conditions in the absence of death stimuli.

في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...