The authors thank David Larson for developing the original protocol for imaging the live Drosophila pupal eye. We thank our colleagues Richard Carthew, Shoichiro Tsukita and Matthew Freeman, who developed the transgenic flies that we combined to generate our live-imaging fly lines. Brittany Baldwin-Hunter gave helpful comments on the manuscript. This work was supported by start-up funds awarded to Ruth Johnson by Wesleyan University.

ويبين الشكل 3 ملخصا لإجراء التجارب. 1. إعداد الأنسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد عواقب التعبير معدلة من الجينات في المصالح، وإنشاء الصليب التالية في مكررة والحفاظ على درجة حرارة 25 درجة C: UAS-التحوير (ذكور) X-GMR GAL4. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. + / SM5-TM6b (الإناث البكر) ملاحظة: للحصول على السيطرة الأنسجة عبر UAS-lacZ الذكور GMR-GAL4. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: إناث GFP. β غالاكتوزيداز يولد عدم وجود عيوب في سلوك الخلية في شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، عبر UAS-رني الذكور إلى GMR-GAL4، UAS-DCR-2. UAS-α-القط: GFP، يو بي آي-DE-كاد: GFP. + / SM5-TM6b الإناث البكر. ملاحظة: العيوب العرضية في سلوك الخلية في الشبكية التعبير لوحظت خارج الرحم DCR-2 (لا تظهر البيانات). ويوصى اليقظة في حالة استخدام هذا النهج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sالمنتخب الأبيض قبل الشرانق من التراكيب الوراثية المناسبة ومكان في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إذا الشرانق التعبير عن DCR-2، حدد الشرانق إما ذكرا أو أنثى: التعبير عن UAS-DCR-2، وهو إدراج على كروموسوم X، هو أقوى في الذكور. الشرانق يجب بالغت في 0 ساعة APF قبل تصبغ في حالة العذراء - الغدد التناسلية للذكور واضحة كما الكرات شفافة كبيرة على الجانبين الجانبية للخادرة (حوالي ثلث من الخلفي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان أنابيب microcentrifuge تحتوي على الشرانق، في بلاغ البلاستيك مربع نظيفة في 25 ° C. لمنع جفاف مكان الشرانق قطعة 10 سم 2 من الأنسجة، وينقع في الماء المقطر، في مربع تلميح. ملاحظة: إذا كانت الرطوبة في مربع طرف تصبح مرتفعة جدا قد تصبح حالة العذراء فطير ويصعب تشريح في الخطوات اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة الوقت المناسب. لالتقاط السلوكيات الخلية المرتبطة الزخرفة العين، وإعداد الشرانق للتصوير في حوالي 17 ساعة APF، 20 ساعة APF أو 24 ساعة APF. انظر ممثل النتائج لمزيد من المناقشة في حين لوحظ السلوكيات خلية معينة أفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من الشريط على الوجهين الطازج على طبق تشريح sylgard الأسود. ضع الجانب خادرة، الظهرية يصل، مع رئيس خادرة انضمت إلى الوجهين الشريط (الشكل 1A) وليس محاولة التمسك الصدرية ومناطق البطن من خادرة إلى الشريط على الوجهين. مع ملقط رفع بعناية وإزالة الغطاء الخيشومي لفضح رئيس العذراء. المسيل للدموع على طول الجانب من حالة العذراء لفضح منطقة حول عين واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إزالة خادرة من شريط لاصق. إذا بقيت ملتصقة خادرة، وتطبيق كمية صغيرة من الماء المقطر إلى تقاطع بين حالة العذراء والشريط لإضعاف التصاق. </li></ol> 2. تركيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء صغير 15 مم 2 الإطار من الورق النشاف وكمة ثقب في middlethat هو 5.5 ملم وقطرها (الشكل 1B). تزج في الماء المقطر ومكان فيوسط شريحة المجهر. باستخدام حقنة 30 سم مكعب، اخراج حلقة موحدة من الفازلين لتطويق إطار ورقة النشاف. تأكد من أن عصابة الفازلين أعلى هامشيا من عرض خادرة وأن قطر الدائري هو أقل هامشيا من عرض زلة غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حبة صغيرة من الفازلين مباشرة على الشريحة، في حفرة لكمات في ورقة النشاف (الشكل 1C) .Carefully ترتيب خادرة، على جانبها، بدعم من حبة الفازلين (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة على رأس عصابة الفازلين بحيث إنها تجري اتصالات مع ظهارة فوق الظهارة العصبية العين (الشكل 1D). ضغط بلطف إعداد لختم ساترة ضد الفازلين وتوليد سطح التماس شقة صغيرة بين منطقة العين العذراء وساترة. </li></ol> 3. الإسفار التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة إعداد العذراء باستخدامالمجهر الفلورسنت. كل القبض على 7 دقائق أقسام التسلسلية من خلال المجال قمية من الظهارة العصبية العين، في منطقة تقاطعات الملتصقة. ملاحظة: أ) أقسام مسلسل المناسبة وعادة ما تكون 4-5 في ض المكدس تتألف من 0.2 ميكرون ض الخطوات. ب) المخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفيفة وطيات، قد جعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور من مناطق واسعة من الأنسجة. بينما التصوير، ويمكن للمرء أن يجد جزء من مجال اهتمام أن تكون في التركيز، ومنطقة مجاورة ليكون خارج نطاق التركيز. يمكن أن تشمل قطرات صغيرة من الماء المقطر بين العين العذراء وساترة القضاء على بعض طيات النسيج الحادة ولكن ليس سمة طوبولوجيا تفاوت أقل ما يقال من المراحل المبكرة من العذراء التشكل العين. في هذه الحالات oversample الأنسجة من خلال توسيع ض المكدس حتى في التركيز يتم الحصول على شرائح للحقل بأكمله. ج) الحصول أقسام التسلسلية يجب على كل 7 دقائق تمكن الحية التصوير لمدة 3 إلى 4 ساعات من دون redu كبيرةction في شدة GFP مضان يمكن أن تكون ضارة جودة الصورة. -فترات زمنية أقصر قد يقلل من الوقت الإجمالي من التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستمر التصوير لمدة 3 إلى 4 ساعات. لا تستخدم التركيز التلقائي وظيفة الوقت الذي يتوفر على العديد من المجاهر الفلورية منذ نمو العذراء وضخ الدملمف يتحرك الموقف من شبكية العين والحذر مطلوب كل 14-21 دقيقة إعادة تركيز. ملاحظة أن التصوير ما بعد 4 ساعات قد تبطئ أو المماطلة التشكل من العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برامج إزالة التفاف المناسب للحد من خلفية وتعزيز النقيض من الصور قسم التسلسلية. لكل ملف ض المكدس، نفذ ما يلي في برنامج LAS AF (انظر جدول المواد): انتقل إلى لوحة الأدوات، حدد 3D إزالة التفاف وانقر فوق تطبيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد أقصى قدر من الإسقاط (MP) صورة لكل ملف كومة deconvoluted: انتقل إلى لوحة الأدوات، حدد 3D الإسقاط وانقر فوق تطبيق. ملاحظة: قد تفشل الخوارزمية الإسقاط القصوى لتوليد موحدةلاي في التركيز على الصورة لالأنسجة التي تم oversampled. ويرد وهناك تقنية لشحذ مناطق خارج نطاق التركيز في الخطوة 5.2. </li></ol> 4. ما بعد التصوير العذراء الانقاذ والنمط الظاهري التأكيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمعالجة ما إذا تم إدخال القطع الأثرية أو خادرة أذى أثناء التصوير، وإزالة بعناية خادرة من تلاعب التصوير: باستخدام ملقط إزالة ساترة ونقل خادرة إلى قارورة نظيفة من المواد الغذائية. يخزن في درجة حرارة الغرفة أو 25 ° C حتى يظهر الطاير الكبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدرس بعناية النمط الظاهري من العين الكبار ومقارنة لعيون الذباب الكبار الناشئة عن الصليب ذبابة الأصلي. </li></ol> تجهيز 5. صورة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التلقائي محاذاة الصورة: ملاحظة: سوف الأنسجة الحية ذبابة الفاكهة التحول والنمو في جميع مراحل عملية التصوير. ونتيجة لذلك، تجمع مراكز الصور في نقاط زمنية متتالية قد لا تتوافق مع نفس النقطة في الأنسجة ذبابة الفاكهة. وبالإضافة إلى ذلكالقرص شبكية العين بأكمله يدور حول 30 درجة بين ~ 21 و 23 ساعة APF. لتسليط الضوء على السلوكيات خلية فردية والحد من الانحرافات الناجمة عن النمو العضوي، محاذاة كل MP image.While هذا لا يمكن أن يؤديها يدويا، وبرامج تحرير الصور المستخدمة هنا (انظر جدول المواد) وقد بنيت في الخوارزميات التي يمكن تسريع هذه العملية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية، مخطوطات المفتوحة والملفات تحميل مختارة في المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد ملفات الصور النائب في لوحة الطبقات تحميل واختر موافق. تأكد من أن محاولة خيار الصور المصدر إلى محاذاة تلقائيا لم يتم تحديد. ملاحظة: إذا تم تحديد هذا الخيار، فإن البرنامج قد يستخدم خوارزمية المحاذاة أن يشوه بيانات الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد تحميل جميع ملفات MP إلى جزء الطبقات، تأكد من أن جميع الصور هي حسب الترتيب الزمني بحيث أقرب نقطة زمنية هي في الجزء العلوي من طبقة المكدس. إذا كانت الطبقات ليست في الصحيح النظام، وسحب وإسقاط لهم حتى يتم أمروابشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الطبقات لصناعة السيارات في محاذاة من علامة التبويب تحرير من القائمة الرئيسية. اختر تعديل وانقر فوق موافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا فشلت خوارزمية لصناعة السيارات في محاذاة لتوجيه الإطارات إلى نقطة محورية ذات الصلة، إجراء تعديلات طفيفة باستخدام أداة التحريك. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شحذ مركب: ملاحظة: خارج نطاق التركيز مناطق صورة النائب الأولية يمكن شحذ التي كتبها &#39;الزراعة&#39; كومة المقابلة deconvoluted في مجال البرمجيات LAS AF. الاقتصاص ملف كومة يسمح احد لتقييد فترة من كومة ض أن تخضع لخوارزمية الإسقاط القصوى يدويا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقع الدالة المحاصيل في لوحة الأدوات (ضمن علامة التبويب عملية). تقييد يدويا شرائح الأولية والنهائية بحيث أنها تغطي فقط الحزام التصاق داخل المنطقة في البداية خارج نطاق التركيز. انقر فوق تطبيق لإنشاء ملف كومة الجديد الذي هو الأمثل لهذه المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد إسقاط الحد الأقصى الجديد لكومة الأمثل محليا وتصدير كملف TIFF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الالبريد تحرير الصور البرمجيات (انظر جدول المواد)، مخطوطات المفتوحة (الموجود في علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية) وحدد تحميل الملفات إلى المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد الأولي ملف الصورة MP وملف النائب الأمثل محليا لنقطة زمنية معينة في لوحة الطبقات تحميل واختر موافق. تأكد من أن محاولة خيار الصور المصدر إلى محاذاة تلقائيا لم يتم تحديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد كل الطبقات في الطبقات جزء ثم اختيار الطبقات لصناعة السيارات في مزيج (الموجود في علامة التبويب تحرير من القائمة الرئيسية) لإخفاء المناطق المناسبة من الصورتين تلقائيا، مما أسفر عن موحد في مجال التركيز في شبكية العين. حفظ هذه الصورة المركبة كملف TIFF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 5.2.1 خلال 5.2.5 لجميع الصور النائب دون المستوى الأمثل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من التعديلات: تدوير، والمحاصيل، وضبط مستويات من الطبقات الفيلم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع كل من الطبقات المحددة، استخدم أداة التحويل (تحرير&gt; تحويل حر) لتدوير الصور بحيث محور الظهري البطني من شبكية العين هو الانحيازإلى ذ محور الإطار الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، استخدم أداة الاقتصاص للحد من مجال الرؤية إلى الحجم المطلوب والشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام تعديل مستوى (الإطارات الفردية) للمساعدة في تعزيز التباين بين غشاء الخلية وخلايا الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأغراض الأسلوبية والتأكيد على السلوكيات خلية معينة، وإدخال اللون كاذبة لتسليط الضوء على النقاط المثيرة للاهتمام في كل إطار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرسوم المتحركة: تحويل الصور إلى الفيلم: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح جزء الرسوم المتحركة من علامة التبويب ويندوز من القائمة الرئيسية. حدد جعل إطارات من طبقات من القائمة الموجودة في الزاوية اليمنى العليا من جزء الرسوم المتحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاحظ أن طبقات تضاف إلى جزء الرسوم المتحركة في ترتيب تسلسلي بدءا من أسفل المكدس. لعكس ترتيب إطارات، أولا تحديد كافة الإطارات ثم حدد عكس إطارات من قائمة لوحة الرسوم المتحركة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الإطار الزمني تأخير لكل إطار باستخدام القائمة المنسدلة أدناه إطار الإبهامالأظافر. ملاحظة: تأخير الإطار لأفلام 1-4 المقدمة في هذه الورقة هو 0.8 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من علامة التبويب ملف من القائمة الرئيسية، وفتح التصدير وتحديد تجسيد الفيديو. اختر تصدير QuickTime تحت خيارات الملف وتحديد تنسيق الفيديو المطلوب. تحت تجعل تحديد خيارات معدل الإطار إلى مخصص، أدخل معدل الإطار 15، ثم انقر تجعل. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells.">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein.">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li><li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye.">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li><li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina.">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19 (1993).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F., Bate, M., Arias, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila.+retina.">Pattern formation in the Drosophila. retina.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 1277-1325 (1993).</li><li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina.">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li><li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+death+zone:+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye.">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li><li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA/miRNA+silencing+pathways.">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li><li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae.">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system.">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li><li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye.">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li><li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye.">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina.">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li><li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina.">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112 (1989).</li><li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina.">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li><li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development.">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li><li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye.">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions.">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li><li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation.">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

وصف للتنمية البرية من نوع (أعلاه) يشكل الأساس لمقارنات بين الأحداث الزخرفة في رني أو الأنماط الجينية overexpression. مقارنات التنمية الأنسجة الحية لا تقدر بثمن عند تحديد بالضبط التي تنظم سلوك الخلية عن طريق بروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، وليس وصفها هنا، تصوير الخلايا ال...

يتميز المجمع ذبابة الفاكهة العين عن طريق ترتيب نمطي لها ~ 750 ommatidia مفصولة العسل شعرية من الخلايا الصبغية التبعي 4،5. ونمط هذه الخلايا الصبغية من قبل مجموعة منسقة من الأحداث: حركات خلية محلية، نمو الخلايا، والتغيرات في شكل الخلية، وموت الخلايا المبرمج. التصور المباشر لهذا ظهارة يسمح احد لدراسة الآليات الجزيئية التي تقوم عليها هذه الأحداث في سياق ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ورابط الجأش. وعلى النقيض من البروتوكولات السابقة 6،7، والتقنية المذكورة هنا تتضمن وسيلة فعالة لتحقيق الاستقرار في حركة الأنسجة الغريبة التي لا يمكن أن تكون. فصل من عملية التصوير. هذه الطريقة يعزز دراسات سلوك الخلية في تطوير ذبابة الفاكهة العذراء العين ظهارة - الأنسجة التي تنمو، بالتناوب، والتحولات على مدار التصوير. وبالإضافة إلى ذلك الحركة استقرار تقنية ديمكتوب هنا سوف تكون مفيدة لدراسة الخلايا في سياقات أخرى حيث تحدث حركة دخيلة. لتصور حدود الخلية في مجال الشبكية ذبابة الفاكهة، تم إنشاء خطوط الطيران المعدلة وراثيا التي تعبر عن يو بي آي-DE-كادهيرين: GFP وكذلك UAS-α-كاتينين: GFP تحت سيطرة السائق العين محددة GMR-GAL4 1-3. استخدام اثنين من الموسومة GFP علامات غشاء يسمح لتصور حدود الخلية في انخفاض كثافة الضوء. هذا يقلل من تلف الأنسجة وphotobleaching من على التعرض المتكرر للموجات عالية الطاقة، مما يتيح زيادة معدل الإطار، ومدة الفيلم. لتعزيز فعالية الجينات المحورة رني، تأسست UAS-DCR-2 أيضا في خط الطيران الثانية 8. في التحديث الثالث من البروتوكولات السابقة، وصفت تلاعب التصوير أسهل أن يتم تجميعها بسهولة في معظم المختبرات. هذا الجهاز يغني عن اشتراط أن يكون لها ص التصوير المتخصصةIG الناتجة عن &quot;آلة متجر&quot; جامعة أو خدمة مماثلة. هذا تلاعب التصوير مماثلة لتلك التي تستخدم لصورة العذراء الأنسجة الأخرى 9،10. المقدمة هنا هي الخلية الحية بروتوكول التصوير البسيطة التي يمكن استخدامها لتقييم مباشرة أحداث التخلق التي تسهم في الزخرفة العين من ~ 17-42 ساعة بعد تشكيل puparium (ساعة APF). على وجه التحديد، هذا البروتوكول يتيح احدة لتحديد الآثار المترتبة على تعديل التعبير الجيني خلال تطوير العذراء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;">UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&#160;</td>
			<td>Available on request from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Scotch double stick tape</td>
			<td style="width:124px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Black Sylgard dissection dish</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 h to polymerize</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Sylgard (Black)</td>
			<td style="width:124px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLG170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Glass petri dish</td>
			<td style="width:124px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">25 x 75 x 1 mm glass microscope slide</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">22 x 40 mm glass coverslip</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td>48393-172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:124px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Whatman 3mm Chromatography Paper</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-713-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Vaseline</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">19-086-291</td>
			<td>Or purchase at local pharmacy.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">30ml syringe</td>
			<td style="width:124px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7510-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Adobe Photoshop CS5</td>
			<td style="width:124px;">Adobe</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Leica TCS SP5 DM microscope</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software</td>
			<td style="width:124px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of the drosophila pupal eye

العمليات الكامنة للتنمية العذراء ذبابة الفاكهة يمكن أن تحول وتشويه ظهارة العين في السبل التي تجعل سلوك الخلية الفردية الصعب تتبع أثناء التصوير الخلية الحية. وتشمل هذه العمليات: دوران في شبكية العين، نمو الخلايا وحركة عضوي. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما طيات قدم مخالفات في طوبولوجيا من ظهارة، بما في ذلك المطبات خفية وكما يتم إعداد خادرة للتصوير، وجعلها صعبة للحصول على التركيز في الصور أكثر من عدد قليل من ommatidia في طائرة الوصل واحدة. سير العمل أوجز هنا العلاجات هذه القضايا، مما يسمح للتحليل سهل من العمليات الخلوية خلال ذبابة الفاكهة تطوير العذراء العين. يتم ترتيب الشرانق نظموا بشكل مناسب، في تلاعب التصوير التي يمكن تجميعها بسهولة في معظم المختبرات اليوبيكويتين-DE-كادهيرين: GFP وGMR-GAL4 -driven UAS-α-كاتينين: GFP تستخدم لتصور حدود الخلية في العين ظهارة 1 -3. بعد إزالة التفاف هوتطبق على صور الفلورسنت القبض على طائرات التنسيق متعددة، يتم إنشاء القصوى الصور الإسقاط لكل نقطة زمنية وتعزيز استخدام برامج تحرير الصور. وتستخدم خوارزميات المواءمة لتحقيق الاستقرار بسرعة الحركة زائدة، مما يجعل سلوك الخلية الفردية أسهل لتتبع.

يعيش التصوير من العين العذراء هو استراتيجية ناجحة لمراقبة سلوكيات الخلية التي تساهم في الزخرفة من الظهارة العصبية. دور بروتينات معينة يمكن تقييمها بسهولة عن طريق التعبير عن الجينات المحورة التي تعدل مستويات البروتين خلال تطوير العين. للقيام بذلك GMR-GAL4 يستخدم ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye at JoVE.com

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

9.3K Views.  Wesleyan University. This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Video: Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

الهندسة الحيوية من أنسنة نخاع العظام ميكرونفيرونمنتس في الماوس والتصور من خلال التصوير لايف

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

التصوير والتحليل لاتجاهات الأنسجة وديناميات النمو في الظهارة الهوائية النامية Drosophila خلال مراحل البوبال

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...