نشكر رينجي الأغاني (ادسورث قياس التدفق الخلوي مركز كور) للمساعدة في تحليل الخلايا وهيلين جونسون (ادسورث مركز التشريح المرضي الأساسية الحيوان) لإعداد أقسام البارافين. نشكر الدكتور ريتشارد كول (ادسورث المجهر الضوئي مركز كور) للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر وجمع الصور. نود أن نعترف اندي بنتلي (ادسورث مركز الصور وتوضيحات) للحصول على المساعدة مع الرسوم المتحركة. ويدعم MDJ من قبل مؤسسة الحياة بحوث العلوم، معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) زمالة. ويدعم SA من زمالة مركز البحوث وادز ورث، وشركة صحة ما بعد الدكتوراه جماعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HD061916 وGM082978.

وتم إيواء الحيوانات تحت التقليدية وشروط محددة خالية من مسببات الأمراض وعولج في الامتثال الكامل لمركز رعاية الحيوان في ادسورث المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC). 1. عن طريق الفم بالتزقيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري) سلالة تسمين الماوس في الاختيار مع مستضد أو الميكروبات ذات الاهتمام باستخدام مجموعة ال 22 x1.5 في. بصراحة نهاية إبرة التغذية (بوبر العلمية، نيو هايد بارك، نيويورك). يجب تسليم كميات لا يتجاوز 400 ميكرولتر في الماوس. </li></ol> 2. عزل خلايا PP لقياس التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران خنقا 2 CO، وفقا لرعاية الحيوانات المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير البطن مع الايثانول 70٪ أو betadine قبل الجراحة. إجراء البطن القياسية التي تنطوي على واحد (1 سم) شق الصف باستخدام مقص جراحي على طول خط الوسط بداية حوالي 1.5 سم من قاعدة القفص الصدري. فضح فيitoneal تجويف وتحديد الأعور. قص الأمعاء الصغيرة الطرفية عند تقاطع اللفائفية-الأعور وإزالة بلطف الأمعاء بكاملها. والحرص على عدم hyperextend الأنسجة المعوية كما يتم إزالته من التجويف البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأمعاء الدقيقة على سرير من المناشف الورقية الرطبة أو Kimwipes. الرطب الأمعاء الدقيقة بلطف مع المياه المالحة لمنع الجفاف الأنسجة. ذكر المكتب الصحفى تحديد بصريا الفردية تقع على الجانب مضادة للالمساريقي من الأمعاء (الشكل 1). عادة، وهي واحدة من الفأرة من 5 إلى 10 ذكر المكتب الصحفى مرئية التي يتم توزيعها بالتساوي من العفج (القريبة) لالدقاق (البعيدة). في المتوسط، سوف تسفر عن فئران 4 23 ذكر المكتب الصحفى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص جراحي منحني، ذكر المكتب الصحفى الفردية المكوس بلطف ووضعها في محلول ملح الباردة هانك المتوازن (HBSS). ملاحظة، يجب وضع المقص منحنى الجانب الأعلى فقط فوق PP ثم تطبق بلطف على الأنسجة. المكوس فقط PP (لا surroundiنانوغرام الأنسجة) ونقل إلى HBSS الباردة. ملاحظة: يجب أن يتم كل حضانات والخطوات الطرد المركزي من هذه النقطة إلى الأمام في القسم 2 في 4 درجات مئوية للحفاظ على بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذكر المكتب الصحفى نقل إلى 5 مل الطحال التفكك المتوسطة واحتضان لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين تهز بقوة في 250 دورة في الدقيقة. وتعد فترة حضانة تؤثر سلبا على بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء تعليق خلية واحدة، ذكر المكتب الصحفى مكان على معقمة (تعقيمها) ميكرومتر النايلون 70 مصفاة الخلية شبكة وطحن بالقوة الأنسجة في شبكة باستخدام قاعدة من المكبس من المحاقن سم مكعب 1. بدلا من ذلك، ذكر المكتب الصحفى شطيرة بين اثنين بلوري العقيمة الشرائح المجهر والزجاج (تعقيمها في مظاريف) وتطحن بلطف الأنسجة مع الحركة ذهابا وإيابا. استخدام ماصة نقل معقمة لنقل التعليق الخلية في أنبوب فالكون 5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى EDTA تركيز النهائي من 1 ملم إلى تعليق الخلية. احتضان على الروك ل5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب التعليق الخلية من خلال 70 ميكرون في الثانية مصفاة لإزالة أي خلايا المجاميع المتبقية الخلوية أو الحطام الأنسجة. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية أو 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع الخلايا لطيف الطرد المركزي (5 دقائق في 500 XG). صب الخلايا و resuspend طاف في تدفق العازلة، التي هي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ مصل العجل الجنين (FCS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء، تمييع الخلايا في الزرقاء التريبان 1:10 وتفتيش بصريا الخلايا باستخدام المجهر الخفيفة وعدادة الكريات أ. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام عداد الخلايا الكونتيسة (إينفيتروجن) أو أداة مماثلة لتعداد الخلايا تلقائيا الأرقام وقدرتها على البقاء. بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى، يجب أن هذا البروتوكول تسفر&gt; 2.5 × 10 6 خلايا الكلية. وهذا يعادل 0،8-1،2 ~ × 10 6 خلايا في الماوس. </li></ol> الأجسام المضادة للخلايا وصفها لقياس التدفق الخلوي &lt;رأ بداية = &quot;11&quot;&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء الخلايا (10 5 لكل بئر) في آبار من أسفل لوحة 96-الجولة أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG)، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في كتلة عازلة ونادي احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. في حين أن هناك عددا من المخازن المؤقتة المتاحة تجاريا كتلة FC (مثل الفئران لمكافحة فأر CD16/CD32، BD العلوم البيولوجية)، ونحن ببساطة استخدام قضى المتوسطة من ورم هجين B خلية فأر (ATCC 2.4.G2) التي تفرز مفتش حيدة النسيلة 1 ضد الفئران Fcγ مستقبلات لهذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG) على النحو الوارد أعلاه، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة fluorophore، مترافق الأجسام المضادة مباشرة إلى تعليق خلية في التخفيف المطلوب، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع هزاز المستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG)، وصبطاف من قلب لوحة وبلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر من العازلة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا 400 ميكرولتر العازلة التثبيت، والذي يتألف من 300 ميكرولتر من العازلة تدفق و 100 ميكرولتر من 1٪ في بارافورمالدهيد العازلة PHEM (أنابيب 60 ملم، 25 ملم HEPES، 10 ملم EGTA، 4 ملم MgCl 2 في الرقم الهيدروجيني 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا تخضع لتدفق الخلوي باستخدام FACSCalibur أو ما يعادلها. تحليل النتائج باستخدام برنامج برو النسخة المحمولة كويست 5.2. </li></ol> 3. إعداد Cryosections PP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت مبكر من جمع الأنسجة، إضافة الأمثل قطع الحرارة (OCT) لمجمع قوالب مم 7x7x5 قاعدة من البلاستيك. أيضا بإعداد مجموعة من النيتروجين السائل (&gt; 750 مل) في دلو ديوار أو الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس وإجراء laparotamy، كما هو موضح أعلاه. إزالة الأمعاء ووضعت على مناشف ورقية مبللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلىذكر المكتب الصحفى لخفض عزل cyrosectioning، شرائح 0.5 سم عرضية من الأمعاء الدقيقة تحتوي على واحد ونسيج PP نقل إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. شطف بلطف تجويف هذه الشرائح مع PBS لإزالة الحطام البراز غير المرغوب فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شرائح الأنسجة المعوية عموديا داخل قوالب قاعدة تحتوي أكتوبر تزج القوالب في النيتروجين السائل وتسمح لتجميد الأنسجة تماما (1-2 دقائق). وهذا اللون من أكتوبر من تغيير واضح إلى الأبيض عندما يتم تجميد كامل للأنسجة. . لتبريد أكثر تدرجا (على سبيل المثال للحد من تشقق OCT)، قالب تزج في حمام من نظير البنتان مع تبريد أبخرة النيتروجين السائل ملاحظة: ارتداء نظارات السلامة المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قوالب قاعدة المجمدة من النيتروجين السائل باستخدام ملقط والسماح للقالب لتدفئة في درجة حرارة الغرفة فترة طويلة بما يكفي (~ 10-15 ثانية) للسماح للحواف كتلة أكتوبر لتخفيف. ثم لإزالة كتلة المجمدة من أكتوبر منالقالب، القالب عكس واضغط بلطف على ظهره لإخراج الكتلة على قطعة نظيفة × 4 سم 4 من رقائق الألومنيوم. التفاف على الفور الأنسجة في احباط وضعها في حقيبة عينة المسمى المخزنة في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف. بدلا من ذلك، نقل الأنسجة في الفريزر (&lt;-20 درجة مئوية). استخدام الأنسجة في غضون أسبوع، وإلا سوف تصبح هشة لبنات مع التقدم في السن. </li></ol> Cryosectioning <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection الأنسجة باستخدام CM3050S ايكا cryomicrotome أو ما يعادلها. وينبغي ضبط درجة حرارة الغرفة على ناظم البرد -21 ° C. إلى </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نسعى جاهدين لالمقاطع التي هي 12-14 ميكرومتر في السمك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطع على SuperFrost فيشر زائد (أو ما يعادلها) الشرائح المجهر والزجاج، وفحص بصريا باستخدام معيار ضوء انخفاض القوة المجهر. إذا كان يتم جمعها مقاطع متعددة على شريحة، تأكد من أن تتجمع معا لتطبيقات تلطيخ المصب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر رانه الشرائح في درجة حرارة الغرفة في صندوق الشرائح و، من الناحية المثالية، واستخدامها في غضون أيام قليلة. </li></ol> وصفها الأجسام المضادة من Cryosections ومتحد البؤر المجهر التحليل <ol start="10" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح تزج في الأسيتون (أو الميثانول) في جرة أو تلطيخ الأنسجة رفوف لمدة 2 دقيقة. قد يسبب الحضانة لفترات طويلة من الأنسجة لفصل الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشرائح إلى تلطيخ جرة جديدة وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-T (1X PBS مع 0.05٪ توين-20) لمدة 3 دقائق لكل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطويق المقاطع مع ImmEdge القلم مسعور. وسوف يضمن هذا ستبقى محصورة الكواشف والأجسام المضادة لتلك المنطقة خلال حضانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في كتلة عازلة (2٪ مصل الماعز في PBS) لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في غرفة مرطب، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح العازلة مع كتلة FC (انظر أعلاه) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع الشرائح في PBS-T ومنطقة جافة حول أقسام باستخدام ماصة أو الأنسجة Kimwipes أخرى.والحرص على عدم لمس الأجزاء الأنسجة الفعلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام الأنسجة تراكب مع حل الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطب. عادة يتم تخفيف الأجسام المضادة الأولية في كتلة عازلة للتركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل. استخدام الأجسام المضادة الأولية مباشرة، وصفت أمر مرغوب فيه، لأنه لا يمكن الجمع بين ما يصل الى ثلاثة أجسام مضادة مباشرة في هذه الخطوة. الأجسام المضادة التي تحمل علامات مباشرة القضاء أيضا على الحاجة إلى خطوات إضافية حضانة الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، والشرائح احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في غرفة الرطوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح لمدة 4 دقائق في بارافورمالدهيد 1٪ في المخزن المؤقت PHEM، كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الشرائح مع PBS لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منطقة جافة حول أقسام باستخدام Kimwipes أو غيرها من استيعابالأنف والحنجرة الأنسجة. والحرص على عدم لمس الأجزاء الأنسجة الفعلية. باستخدام ماصة أو القطارة، ضع قطرة من بلطف إطالة المتوسطة الذهب تصاعد مباشرة على القسم. تطبيق ساترة الزجاج على المدى المتوسط ​​تصاعد مع الحرص على تجنب الفقاعات. استخدام ورق النشاف لامتصاص فائض أي وسيط في تصاعد مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips ختم على الشرائح المجهر مع طلاء الأظافر التجارية والسماح للهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض الشرائح مع SP5 TCS لايكا أو المجهر متحد البؤر ما يعادلها. </li></ol>

<ol>
	<li>Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA's+complex+roles+in+immunity+and+mucosal+homeostasis+in+the+gut.">Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut.</a> Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).</li><li>Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaboration+of+epithelial+cells+with+organized+mucosal+lymphoid+tissue.">Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue.</a> Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).</li><li>Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+intestinal+homeostasis+and+disease.">Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease.</a> J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).</li><li>Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GALT:+organization+and+dynamics+leading+to+IgA+synthesis.">GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis.</a> Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).</li><li>Iwasaki, A., Kelsall, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+distinct+Peyer's+patch+dendritic+cell+subsets+and+their+recruitment+by+chemokines+macrophage+inflammatory+protein+(MIP)-3alpha,+MIP-3beta,+and+secondary+lymphoid+organ+chemokine.">Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine.</a> Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).</li><li>Iwasaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+dendritic+cells.">Mucosal dendritic cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).</li><li>Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+Patch+Dendritic+Cells+Sample+Antigens+by+Extending+Dendrites+Through+M+Cell-Specific+Transcellular+Pores.">Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores.</a> Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).</li><li>Lelouard, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+bacteria+and+dead+cells+are+internalized+by+a+unique+subset+of+Peyer's+patch+dendritic+cells+that+express+lysozyme.">Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme.</a> Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).</li><li>Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+induces+migration+of+dendritic+cells+from+the+subepithelial+dome+region+to+T-+and+B-cell+areas+of+Peyer's+patches.">Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches.</a> Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).</li><li>Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+IgA+possesses+intrinsic+modulatory+properties+stimulating+mucosal+and+systemic+immune+responses.">Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses.</a> J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).</li><li>Kelsall, B. L., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+dendritic+cells+are+present+in+the+subepithelial+dome+and+T+cell+regions+of+the+murine+Peyer's+patch.">Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch.</a> J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).</li><li>Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+Mouse+Ligated+Peyer's+Patch+Intestinal+Loop+Assay+to+Evaluate+Bacterial+Uptake+by+M+cells.">Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells.</a> J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).</li><li>Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Dendritic+Cells+and+Macrophages+from+the+Mouse+Intestine.">Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine.</a> J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).</li><li>Lopez-Guerrero, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+activates+dendritic+cells+from+Peyer's+patches+in+adult+mice.">Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice.</a> J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذه المقالة، قدمنا ​​البروتوكولات موازية لإعداد التحضيرات PP خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric والوظيفية وcryosections للالمناعية. كلتا الطريقتين هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة، وفرت قياس التدفق الخلوي وناظم البرد المتاحة. وينبغي للمحققين مرة الأولى تجدر ا?...

بقع باير (PPS) هي المجاميع العيانية من بصيلات اللمفاوية المنظمة الحالية في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة للإنسان والفئران (الشكل 1) وتشكل المواقع الأساسية التي تم تهيئتها الاستجابات المناعية المخاطية ضد مستضدات الغذائية والبكتيريا المتعايشة، ومسببات الأمراض الميكروبية، واللقاحات عن طريق الفم 1-4. على عكس الأنسجة الأخرى اللمفاوية الطرفية مثل العقد الليمفاوية المساريقي، ذكر المكتب الصحفى تفتقر الأوعية اللمفاوية وارد. كما هي مدفوعة، مثل الاستجابات المناعية التكيفية في ذكر المكتب الصحفى ردا على مستضدات المستمدة من تجويف الأمعاء. ويتم إنجاز أخذ عينات من المستضدات لمعي من قبل ظهارة جريب المرتبطة (FAE)، الذي يتكون من كل من الخلايا المعوية ومستضد أخذ العينات المعروفة باسم الخلايا M. تحت FAE، في قبة شبه الظهارية (SED) المنطقة، وتقع شبكة من الخلايا الجذعية (DCS) تتداخل مع الضامة، والخلايا B، وCD4 + T الخلايا 5-9. في صميم كل follicl اللمفاوية PPه هي الخلايا الجذعية الجريبي (FDCS) وخلية الغنية المركزية B مركز جرثومي، ويحيط بها مناطق T بين الجريبات الخلية الغنية. أخذ العينات بواسطة المستضد النتائج ذكر المكتب الصحفى في تطوير خلية + B ايغا plasmablasts وCD4 + الخلايا المستجيب والذاكرة التي الصفيحة المخصوصة البذور المحيطة ومنح الحصانة لمجموعة واسعة من الغزاة المخاطية. تشريح الأحداث المناعية المعقدة المرتبطة مستضد أخذ العينات، وتجهيز، وعرض في ذكر المكتب الصحفى هو مهمة شاقة، بالنظر إلى أن خلايا PP لا تشكل سوى نسبة ضئيلة من الخلايا اللمفاوية في مجموع مخاطية الأمعاء. للمساعدة في توصيف في المختبر من خلايا في هذه البيئة، ونحن نقدم لإعداد بروتوكول مجموع الماوس خلايا PP لتحليل تدفق cytometric والوظيفية، وكذلك بروتوكول لإعداد PP cryosections المناعي للفحص المجهري وimmunohistology. لدينا بروتوكول لعزل وتوصيف، والمناعية من مذكرات التفاهمه خلايا PP ليست رواية في حد ذاتها، كما يتضح من حقيقة أن هناك إشارات عديدة يعود تاريخها إلى أكثر من 25 عاما أن أذكر هذه التقنيات 5،6،9-11. بدلا من ذلك، لدينا بروتوكول يوفر مبسطة (والبصرية) للمحققين طريقة جمع ذكر المكتب الصحفى للمرة الأولى. ويتقن تقنيات بسهولة وصفنا وتسفر بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا مع&gt; بقاء الخلية 90٪. بروتوكول cryosectioning ينتج المسلسل أقسام استنساخه للغاية مثاليا للتلوين المناعي والتصوير مبائر. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يكمل الأخريين إن الرب المقالات الأخيرة. الأولى، من قبل فوكودا والزملاء، يصف استخدام المقايسات ligated حلقة اللفائفية لتقييم امتصاص البكتيريا المسببة للأمراض من قبل خلايا M PP 12. الآخر، من خلال Geem والزملاء، ويصف العزلة وتوصيف البلدان النامية والضامة من الغشاء المخاطي المعوي الماوس، لكنه يستثني صراحة من ذكر المكتب الصحفى تحليل ال 13.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> بند </td><td> شركة </td><td> القط. # </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> مجمع أكتوبر </td><td> الأنسجة تيك </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> 7x7x5 ملم قاعدة قوالب </td><td> Fisherbrand </td><td> 22-363-552 </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge القلم </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Superfrost زائد الشرائح </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 4951 </td><td></td></tr><tr><td> حافة شفرة شعيرة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 4280L </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD11c-PE </td><td> eBioscience </td><td> 17-0114-82</td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD45R/B220-APC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553092 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD3-FITC </td><td> BD Pharmigen </td><td> 561798 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD4-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553652 </td><td></td></tr><tr><td> المضادة للماوس CD8-PE </td><td> BD Pharmigen </td><td> 553032 </td><td></td></tr><tr><td> مكافحة CD19-الماوس PercP </td><td> BioLegend </td><td> 115531 </td><td></td></tr><tr><td> هانك حل متوازن الملح (HBSS) دون الحمراء الفينول </td><td> فيشر العلمية </td><td> 14175-079 </td><td></td></tr><tr><td> 70 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> BD الصقر </td><tد&gt; 352350 </td><td></td></tr><tr><td> الطحال التفكك متوسطة </td><td> وقف تقنيات الخليوي </td><td> 7915 </td><td></td></tr><tr><td> مصل الماعز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16210-072 </td><td></td></tr><tr><td> FC بلوك </td><td> ATCC 2.4.G2 </td><td> HB-197 </td><td> Supes تم الحصول عليها من خط الخلية 2.4.G2 </td></tr><tr><td> منحني مقص </td><td> FST </td><td> 14061-09 </td><td></td></tr><tr><td> ناظم البرد </td><td> لايكا </td><td> 3050S </td><td></td></tr><tr><td> FACS Calibur </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الكونتيسة خلية مكافحة </td><td> إينفيتروجن </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الهيماتوكسيلين </td&gt; <td> ريتشارد ألان </td><td> 7211 </td><td></td></tr><tr><td> يوزين </td><td> ريتشارد ألان </td><td> 71304 </td><td></td></tr><tr><td> الفورمالين محلول مائي </td><td> Starplex العلمية </td><td> 3661 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة. </td></tr></tbody></table>

isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine peyer's patches

بقع باير (PPS) جزءا لا يتجزأ من أنسجة الأمعاء المرتبطة اللمفاوية (GALT) ولعب دورا محوريا في الأمعاء والترصد المناعي التوازن. يتم أخذ عينات باستمرار مستضدات الجسيمات والجراثيم في لمعة الأمعاء من قبل خلايا M PP في ظهارة جريب المرتبطة (FAE) ونقلها إلى شبكة الكامنة وراء الخلايا الجذعية (DCS)، الضامة، والخلايا الليمفاوية. في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكولات التي هي ذكر المكتب الصحفى الفئران (ط) فصل في تعليق خلية واحدة وتعرض لالتدفق الخلوي و (الثاني) والتي أعدت للcryosectioning المناعية. لالتدفق الخلوي، ذكر المكتب الصحفى لفصل ميكانيكيا ثم يصفى من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لتوليد تعليق خلية واحدة خالية من الخلايا الظهارية والحطام الكبيرة. بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى (من أربعة الفئران)، وهذه الطريقة سريعة وقابلة للتكرار غلة يبلغ عدد سكانها&gt; 2.5 × 10 6 خلايا مع&gt; بقاء الخلية 90٪. لجديدة، cryosectioningذكر المكتب الصحفى لاي مغمورة معزولة في قطع الأمثل المتوسطة (OCT) درجة الحرارة، الأداة الإضافية المجمدة في النيتروجين السائل، ثم مقطوع باستخدام cryomicrotome. أقسام الأنسجة (5-12 ميكرون) هي الهواء المجفف، ثابتة مع الأسيتون أو الميثانول، وثم تعرض لimmunolabeling.

تحليل تدفق cytometric من المعلقات monodisperse من الخلايا PP مجموع يكشف عن تمييز واضح بين استعدادات جيدة الخلية والفقراء. في الخلية الاستعدادات جيدة مع بقاء أكثر من 80٪، فإن الغالبية العظمى من الخلايا إظهار مبعثر إلى الأمام عالية (FSC)، وهو مؤشر على حجم الخلايا عالية، وانخفاض مبعث?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches at JoVE.com

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer&#039;s Patches

هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وcryosections PP لالمناعية.

عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

isolating-immunostaining-lymphocytes-dendritic-cells-from-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

32.4K Views.  New York State Department of Health. هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وc...

Video: Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

جيل ووسمها الفئران خلايا نخاع العظام المستمدة من البلورات النانوية مع شجيري Qdot تتبع للدراسات

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

عزل خلايا الرئة ماوس شجيرى

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

عزل الخلايا الجذعية متعلق بالنخاع الشوكي والخلايا الظهارية من الغدة الصعترية الإنسان

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer&#039;s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both microbial and dietary. Given an increasing understanding that these luminal antigens help shape the immune response and that education of immune cells within the intestine is critical for a number of systemic diseases, there has been increased interest in characterizing the intestinal immune system. However, many published protocols are arduous and time-consuming. We present here a simplified protocol for the isolation of lymphocytes from the small-intestinal lamina propria, intraepithelial layer, and Peyer&#39;s patches that is rapid, reproducible, and does not require laborious Percoll gradients. Although the protocol focuses on the small intestine, it is also suitable for analysis of the colon. Moreover, we highlight some aspects that may need additional optimization depending on the specific scientific question. This approach results in the isolation of large numbers of viable lymphocytes that can subsequently be used for flow cytometric analysis or alternate means of characterization.

There is growing interest in the quantitative characterization of intestinal lymphocytes owing to increasing recognition that these cells play a critical role in a variety of intestinal and systemic diseases. In this protocol, we describe how to isolate single cell populations from different small-intestinal compartments for subsequent flow cytometric characterization.

العزلة وتدفق Cytometric توصيف الفئران الصغيرة المعوية اللمفاويات

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

العزلة وتنشيط الخلايا الليمفاوية الفئران

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

عزل الخلايا الليمفاوية من الماوس صغيرة المعوية المناعي

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...