وقد تم دعم هذه الدراسة من قبل مركز الصفرا ادمون والزنبق للعلوم الدماغ (SB الزمالة)، وراثي التراث الطبية الحيوية برنامج الشراكة العلوم من مؤسسة العلوم اسرائيل (منحة رقم 378/11، إلى HS) ومؤسسة الألمانية للالإسرائيلي العلمية البحث والتطوير (GIF) (منحة رقم 1093-32.2/2010، إلى HS).

1. إعداد الفيروسة البطيئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا HEK-293FT إلى 90٪ التقاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من ترنسفكأيشن تغيير المتوسطة الخلية إلى DMEM المصل خالية تستكمل مع 1 ملي الجلوتامين و 50 ملغ / مل البنسلين، الستربتوميسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في بالنقل الخلايا مع متجه pLKO.1-بورو ومع البلازميدات ترميز لR8.2 الدلتا والأنصاف VSV-G وميرنا من الفائدة، وذلك باستخدام 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل polyethylenimine باعتبارها الناقل 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع lentiviruses المعبأة في 24 ساعة و 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، مرشح من خلال 0.45 ميكرون التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز lentiviruses باستخدام تنبيذ فائق في 70،000 XG، لمدة 2 ساعة و 15 درجة مئوية، وقسامة وتخزينها في -70 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس عيار الفيروس عن طريق إصابة الخلايا HEK-293T مع الاستعدادات الفيروس المخفف متسلسل (من 1 إلى 10 -6 مل من ناقلات لكل بئر). يتم تقييم الناتج عيار (10 × 9 الجسيمات المعدية لكل مل من المستحسن الحد الأدنى من ~ 1) للتعبير عن جنرال الكتريكشمال شرق من الفائدة، وذلك باستخدام اختيار بوروميسين وعن طريق قياس GFP معربا عن الفيروسات عن طريق عد الخلايا الفلورسنت. </li></ol> لبروتوكول أكثر تفصيلا من إعداد الفيروسة البطيئة انظر 10. 2. إعداد الحيوانات لجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تشمل الجراحين زي ثوب الجراحية، والقفازات المعقمة، وكأب وقناع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الحيوان، ثم تخدير ذلك مع حقن IP من خليط الكيتامين، مع حجم يتناسب مع وزن الحيوان كما هو محدد لكل دواء. بالنسبة لمزيج من الكيتامين / زيلازين، وعادة ما يستخدم مجموعة جرعة من 80-200 ملغم / كغم من الكيتامين و 7-20 ملغ / كغ زيلازين بالنسبة للفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار حتى الحيوان هو تخدير كامل، ثم تحقق من عدم وجود منعكس الانسحاب في أطرافه الخلفية للحيوان عن طريق تمديد أطرافه ومن ثم الضغط عليه بإصبعك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الحيوان تحت الجلد مع Rimadyl، كما هو محدد في المربع، لتخفيف الألم. مجموعة الجرعة النموذجية لRymadil هو 5-10 ملغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة وترطيب العينين مع مرهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلاقة المنطقة الواقعة بين الأذنين اثنين مع آلة التشذيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الجلد مع بتدين. </li></ol> 3. تعرض الجمجمة والحفر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان داخل stereotact عن طريق ضبط قضبان في الشقوق الأمامية فقط إلى آذان الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط لجعل شق الأمامي الخلفي من حوالي 1.5 سم بين الآذان وابقائه مفتوحا مع المشابك جراحة (serfines). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف السطح من الجمجمة مع مسحة القطن حتى التقاطع بين الدرز الإكليلي والغرز السهمي؛ أي و bregma التقاطع بين الغرز الاكليلية واللامية، أي امدا، مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشير غيض من حقنة، التي عقدها stereotact، إلى نقطة bregma، في جميع المحاور الثلاثة. كتابة الإحداثيات. ويعتبر هذا نقطة الصفر كما ص.الباحث في جميع المحاور الثلاثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع المحقنة في المحور الرأسي بحيث أن حركة مستو لا تخدش الجمجمة وتحريك رأس المحقنة إلى الموقع الصحيح. حقن CA1 الحصين تتطلب ما يلي ينسق النسبية إلى bregma ب (ملم): -2 في المحور الأمامي / الخلفي، ± 1.8 في المحور الأفقي / الإنسي و-1.5 في محور ظهري / بطني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض غيض من حقنة حتى يلمس الجمجمة وبمناسبة بقعة مع علامة. إزالة حقنة الظهر لتجنب طعن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر حفرة ضحلة، إلا في عظم الجمجمة باستخدام الحفار غرامة. عقد الحفار ثابت حتى انها لن تستمر في حفر في أسفل الأنسجة اللينة. يمكنك منع هذا عن طريق مستقرا يد واحدة مع الأخرى وعن طريق حفر في نبضات قصيرة. </li></ol> 4. حقن من الفيروسة البطيئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب 0.5 مل من محلول الفيروسة البطيئة المركزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حقنة فوق حفرة وببطء خفضه عموديا حتى الجرميةالشطرنج سطح الجمجمة. الاستمرار في خفض حقنة في الدماغ ببطء شديد. في هذه الخطوة قد تحدث بعض النزيف الذي لا يدل بالضرورة على اختراق فاشلة. إذا كان النزيف يحدث امتصاص هذا الامر مع مسحة القطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مضخة الرقمية إلى 0.02 مل / دقيقة (سيتم حقن 0.5 ميكرولتر في 25 دقيقة) والبدء في ضخ. التسريب البطيء يسمح لنشر الفعال للفيروس في الأنسجة ويمنع عودة تدفق. في بعض أنواع حقنة النظر في إدراج الحقنة لعمق إضافي قدره 0.5 مم قبل أن يتراجع إلى إحداثيات الأصلي وغرس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد اكتمال التسريب انتظر 5 دقائق إضافية للسماح للمواد أن تنتشر في الدماغ بدلا من التقوقع في القناة التي شكلتها الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المحقنة ببطء شديد ومراقبة التدفقات الى الوراء. إذا لوحظ تدفق إلى الوراء في هذه الخطوة، وجزء من المواد حقن ربما كان خسر. </li></ol> 5. ختم الجرح والإنعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم عشرالجرح الإلكترونية مع histoacryl. تأكد من تجنب تسريب histoacryl في عيون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الحيوان الغشاء البريتونى (IP) مع 1 مل ملحي قبل ساخنة، لتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في قفص الانتعاش الذي يتم وضعه على وسادة ساخنة. مشاهدة هذا الحيوان في حين أنه يتعافى لمدة ساعة إضافية. </li></ol> في حالة فقدان الوزن، inappetance، يجب أن يتم تنفيذ ضعف / عدم القدرة على الحصول على الأعلاف أو المياه، الدولة المحتضرة أو العدوى، والقتل الرحيم للحيوان. طرق مقبولة للقتل الرحيم من القوارض والباربيتورات، ومواد التخدير المستنشق، CO 2، CO، أو كلوريد البوتاسيوم بالتزامن مع التخدير العام. بعد 4 إلى 6 أسابيع، وتقييم يتم تقييم الذاكرة الملاحة الحيوان في متاهة موريس المائية. سوف الفيروسة البطيئة عادة تصيب معظم الخلايا داخل المجال الحقن. 6. تقييم السلوكية في متاهة موريس المائية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدريب الحيوانات في Mالسوسن متاهة مائية. للتدريب الدقيق وبروتوكول الاختبار يرى 11. بعد كل محاكمة، يجف الحيوان بمنشفة جافة، والاستعاضة عنها في قفصه وتجديد المياه في الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار الحيوانات في متاهة موريس المائية لمدة 3 أيام متتالية، 4 تجارب كل يوم. كل يوم تضاف الحيوانات في متاهة في كل من 4 اتجاهات من المتاهة (شمال، جنوب، شرق وغرب) في ترتيب المتغيرة، على سبيل المثال يوم واحد: الشرق والغرب والشمال والجنوب، اليوم الثاني: الغرب والجنوب والشمال الشرقي. مسح الحيوانات بعد كل محاكمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الاختبار التجارب تتبع هذا الحيوان مع نظام تتبع مثل نظام تتبع Noldus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 12 عشر اختبار محاكمة، إدراج الحيوانية في خزان الماء دون منصة لدقيقة واحدة. هذا وسوف تستخدم لتحليل استراتيجية تبحث يأخذ الحيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات على النحو المقترح في 12. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

حقن المجسم من الفيروسة البطيئة هي طريقة سريعة نسبيا للتقييم في الجسم الحي على حد سواء أعلى أو أسفل تنظيم الجينات وmiRNAs مختلفة. البديل الرئيسي هو الفأر وراثيا الذي هو تقنية تستهلك الكثير أكثر شاقة والوقت ثم حقن الفيروسة البطيئة مباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، وتنظيم م?...

وقد تم مؤخرا تحدى دور لل miRNAs خاصة في أداء الجهاز العصبي عن طريق الحقن lentiviral في العديد من الدراسات. تم العثور على MiRNAs أن تكون حاسمة للحفاظ وإعادة تشكيل بنية المشبك 1 synaptogenesis، و2 و إعادة عرض المشبك وصيانة 3. هذه الدراسات تشير بقوة إلى أن miRNAs يشاركون، عبر آثار التنظيمية multileveled سواء في صياغة وتصل في الحفاظ على الناتج الرئيسي من الجهاز العصبي، والوظيفة المعرفية. حقن المجسم من جسيمات الفيروسة البطيئة إلى مناطق محددة في الدماغ القوارض تمكن بالبحث عن تغييرات في التشكل المشبك ونشاط الخلايا العصبية، وكانت تستخدم لإقامة أهمية وظيفية من خلال النصوص التي تبديها 4،5. قد تكون متورطة عدوى مباشرة من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ محددة جيدا مع ميرنا، معربا عن lentiviruses في دراسات الشيخوخة، واضطرابات المخ وتنكس عصبي؛ دراسات ميرناو في مجال التنظيم السلوكي 6-8 هي في حالة أقل بكثير المتقدمة، وحقن المجسم من ميرنا، معربا عن جسيمات الفيروسة البطيئة تليها الاختبارات السلوكية قد تكون مفيدة لمثل هذه الأغراض. وهناك طريقة أكثر بكثير شاقة لإحداث الزائد أو الناقص في التعبير ينطوي المهندسة وراثيا أو الضربة القاضية في الفئران خروج المغلوب. ويمكن لنظم وراثية تسمح بالمزيد من أجل السيطرة المشروطة والزمانية على التعبير (على سبيل المثال لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، ونظم تيت)، ولكن هذه بالكاد توفر خصوصية المكاني لإجراء الحقن، وهناك دائما تقريبا كمية معينة من التسرب. أيضا، الإجراءات الهندسية لا تتطلب عملية جراحية، ويمكن استخدامها في جميع أنحاء مختبرات مع استنساخ جيدة نسبيا، إلا أنها تكون أبطأ وتتطلب أكثر من ذلك بكثير القوى العاملة والموارد المالية. وبالإضافة إلى ذلك، والسيطرة الزمنية من الإفراط في أو تحت التعبير في حقن الفئران هي أكثر دقة بكثير بالمقارنة مع الفئران المعدلة وراثيا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNAs (miRNAs) هي عبارة عن جزيئات الحمض النووي الريبي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تنظيمية صغيرة حول 22 النيوكليوتيدات طويلة على أنه يجوز لكل هدف العديد من النصوص مرنا وخافت على كامل مسار الجين التعبير من خلال تدمير حمل و / أو ترجمة تثبيط هذه الأهداف. العديد من miRNAs تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على بنية الخلايا العصبية وظيفة وظائف المخ في المستوى العالي، ويتم البحث عن طرق لمعالجة مستوياتها لاستكشاف هذه الوظائف. هنا، نقدم طريقة مباشرة في الجسم الحي لدراسة العواقب المعرفية لل miRNAs القسري الزائدة في الفئران عن طريق الحقن المجسم من جزيئات الفيروس ميرنا ترميز. على وجه التحديد، والبروتوكول الحالي ينطوي على الحقن في المنطقة CA1 الحصين، الأمر الذي يسهم في توطيد الثدييات الذاكرة، والتعلم، واستجابات التوتر، ويقدم موقع الحقن مريحة. يتم قياس الإحداثيات وفقا لbregma الماوس، ويتم التحكم رقميا نضح الفيروس وأبقى بطيئة جدا.بعد الحقن، وختم الجرح الجراحة والحيوانات استرداد. Lentiviruses ترميز كواتم الصوت من الأهداف مرنا المقابلة تعمل على توريط ميرنا / الهدف التفاعل محددة مسؤولة عن تأثير الملاحظ، مع الفئران السذاجة، حقن الفئران بمحلول ملحي وحقن الفئران مع &quot;فارغة&quot; ناقلات الفيروسة البطيئة والضوابط. شهر واحد بعد الحقن، ويتم فحص الحيوانات في متاهة موريس المائية (MWM) لتقييم التعلم الملاحة وقدراتهم الذاكرة. وMWM هو خزان جولة مملوءة بالماء الملون مع منصة صغيرة مغمورة 1 سم تحت سطح الماء. الإشارات البصرية ثابت حول خزان تسمح للملاحة الفضائية (صوت وربما حقل المغناطيسي للأرض أيضا مساعدة الحيوانات في التنقل). ورصد كاميرا فيديو تتيح قياس مسار السباحة والوقت للعثور على وترقى المنصة. تدرس الماوس الأولى التي تركيب منصة خفية يوفر الهروب من السباحة القسري؛ ثم يتم اختباره لاستخدام هذا الهروب وجمعةinally، تتم إزالة منصة والاختبارات التحقيق فحص إذا كان الماوس يتذكر موقعه السابق. الاختبارات المتكررة على مدى عدة أيام متتالية تسليط الضوء على تحسن أداء الفئران اختبارها في الإختفاء أقصر لإيجاد وتحميل منصة، وطرق وأكثر مباشرة للوصول إلى منصة أو موقعه. عدم إظهار هذا التحسن تمثل ضعف في التعلم والذاكرة و / أو القلق، والتي قد ثم يتم اختبارها على وجه التحديد (على سبيل المثال في المتاهة زائد مرتفعة). هذا النهج يمكن التحقق من صحة لل miRNAs محددة ومحاضر الهدف في درس المعرفي و / أو العمليات المرتبطة بالتوتر.

حقن من 0.5 ميكرولتر الفيروسة البطيئة في المنطقة CA1 في حصين الماوس، مع معدل تدفق مبين في القسم بروتوكول غلة المجال المصابة من حوالي 1 ملم في محور منقاري-الذيلية، وحوالي 0.5 ملم في الإنسي الوحشي والأمامي الخلفي محاور (الشكل 3). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="always" sty...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome at JoVE.com

Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs لها أدوار هامة في بنية الدماغ ووظيفته. هنا نحن تصف طريقة لفرض ميرنا الحصين الإفراط في التعبير باستخدام حقن المجسم من الفيروسة البطيئة ميرنا، معربا عن هندسيا. يمكن لهذا النهج بمثابة وسيلة سريعة نسبيا لتقييم<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; آثار لل miRNAs الإفراط في المعبر عنها في مناطق محددة في الدماغ.

حقن المجسم من الرنا الميكروي، معربا عن Lentiviruses إلى CA1 الحصين ماوس المنطقة وتقييم حصيلة السلوكية

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

22.7K Views.  The Hebrew University of Jerusalem. MicroRNAs لها أدوار هامة في بنية الدماغ ووظيفته. هنا نحن تصف طريقة لفرض ميرنا الحصين الإفراط في التعبير باستخدام حقن المجسم من الفيروسة البطيئة ميرنا، معربا عن هندسيا. يمكن لهذا النهج بمثابة وسيلة سريعة نسبيا لتقييم في الجسم الحي آثار لل miRNAs الإفراط في المعب...

Video: Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

السلوكية Phenotyping من نماذج الأمراض الفئران مع محطة المتكاملة السلوكية (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

التقييم السلوكي للنظام الدهليزي ماوس الشيخوخة

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

تحليل شامل لديناميات النسخ من عينات المخ بعد تجربة السلوكية

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

تقييم التجريبية من الفأر المؤانسة باستخدام الآلي صورة نهج المعالجة

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

تطبيق المجسم حقن التقنية لدراسة التأثيرات الوراثية على سلوكيات الحيوان

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

تحفيز العصب المبهم كأداة للحث على اللدونة في مسارات ذات الصلة من أجل التعلم الانقراض

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

تقييم السلوكية السمع في 2 إلى الأطفال يبلغ من العمر 4: الإجراءات اثنين من الفاصل الزمني، استنادا المراقب، عن طريق الردود القائم على اللعب مكيفة

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

بطارية اختبار سلوكية لتكرار تقييم المهارات الحركية، والمزاج، والإدراك في الفئران

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

استخدام نظام متاهة قابل لإعادة التكوين لتعزيز قابلية استنساخ اختبارات الملاحة المكانية في القوارض

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

التحقق من صحة نموذج الفئران لمتلازمة أنجلمان باستخدام الاختبارات السلوكية

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

تسليط الضوء على المؤلف: مجموعة من الاختبارات السلوكية القابلة للتكرار للغاية للتحقق من صحة نموذج الفئران لمتلازمة أنجلمان 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

التوصيف السلوكي لنموذج فأر متلازمة أنجلمان

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...