نود أن نشكر Kacergis مايكل للمساعدة التقنية ووو Lianfeng للمناقشات وقراءة المخطوط. وأيد هذا العمل من قبل مهنة جائزة التنمية من المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (K08DK087941 لAAS)، والمعاهد الوطنية للصحة / NIDDK التدريب منحة (5T32DK007028 لECP)، واليسون الباحث الطبي الجديد في مؤسسة جائزة الشيخوخة (لAAS)، وتشارلز H . هود صحة الطفل مؤسسة جائزة بحوث (لAAS).

<ol>
	<li>Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+as+ubiquitous+fat+storage+organelles+in+C.+elegans.">Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans.</a> BMC Cell. 11, 96 (2010).</li><li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+function+in+novel+targets:+C.+elegans+as+a+model+organism.">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).</li><li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.+Toxicological+Sciences:+An+Official.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official.</a> Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).</li><li>Ashrafi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+fat+regulatory+genes.">Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes.</a> Nature. 421, 268-272 (2003).</li><li>Arda, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+modularity+of+nuclear+hormone+receptors+in+a+Caenorhabditis+elegans+metabolic+gene+regulatory+network.">Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).</li><li>Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polygenic+control+of+Caenorhabditis+elegans+fat+storage.">Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage.</a> Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).</li><li>Wang, M. C., O'Rourke, E. J., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+metabolism+links+germline+stem+cells+and+longevity+in+C.+elegans.">Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans.</a> Science. 322, 957-960 (2008).</li><li>O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+major+fats+are+stored+in+vesicles+distinct+from+lysosome-related+organelles.">C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles.</a> Cell Metab. 10, 430-435 (2009).</li><li>Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+bacterial+diet+on+fat+storage+in+C.+elegans.">The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans.</a> PLoS ONE. 4, e7545 (2009).</li><li>Yen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+fat+storage+quantitation+in+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+label+and+label-free+methods.">A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li><li>Rabbitts, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glo-3,+a+novel+Caenorhabditis+elegans+gene,+is+required+for+lysosome-related+organelle+biogenesis.">glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis.</a> Genetics. 180, 857-871 (2008).</li><li>Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-2,+an+insulin+receptor-like+gene+that+regulates+longevity+and+diapause+in+Caenorhabditis+elegans.">daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans.</a> Science. 277, 942-946 (1997).</li><li>Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rictor/TORC2+regulates+fat+metabolism,+feeding,+growth,+and+life+span+in+Caenorhabditis+elegans.">Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans.</a> Genes Dev. 23, 496-511 (2009).</li><li>McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C+elegans:+a+model+for+exploring+the+genetics+of+fat+storage.">C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage.</a> Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).</li><li>Hellerer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+lipid+storage+in+Caenorhabditis+elegans+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).</li><li>Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+screening+for+fat+regulatory+genes+with+SRS+microscopy.">RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy.</a> Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).</li><li>Fowler, S. D., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Nile+red,+a+fluorescent+hydrophobic+probe,+for+the+detection+of+neutral+lipid+deposits+in+tissue+sections:+comparison+with+oil+red.">Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red.</a> 33, 833-836 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Hope, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).</li><li>Perez, C. L., Van Gilst, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+13C+isotope+labeling+strategy+reveals+the+influence+of+insulin+signaling+on+lipogenesis+in+C.+elegans.">A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans.</a> Cell Metab. 8, 266-274 (2008).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans.">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Developmental Biology. 292, 381-392 (2006).</li><li>Wang, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiles+and+the+risk+of+developing+diabetes.">Metabolite profiles and the risk of developing diabetes.</a> Nature medicine. 17, 448-453 (2011).</li><li>Rhee, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+profiling+identifies+a+triacylglycerol+signature+of+insulin+resistance+and+improves+diabetes+prediction+in+humans.">Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).</li><li>Lewis, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+signatures+of+exercise+in+human+plasma.">Metabolic signatures of exercise in human plasma.</a> Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).</li><li>Rhee, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolite+profiling+identifies+markers+of+uremia.">Metabolite profiling identifies markers of uremia.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).</li><li>Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+analysis+of+three+neutral+glycosphingolipids+from+a+mixed+population+of+Caenorhabditis+elegans+(Nematoda:Rhabditida).">Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida).</a> Glycobiology. 7, 265-275 (1997).</li><li>Christie, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Lipid Methodology - Two. , 69-111 (1993).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li><li>Wahlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nat. Methods. , (2012).</li><li>Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nile+red+for+the+rapid+in+situ+quantitation+of+lipids+on+thin-layer+chromatograms.">Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms.</a> J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).</li><li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+C.+elegans.">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+Screening+and+Biosensing+with+Fluorescent+C.+elegans+Strains.">High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains.</a> J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).</li><li>Comizio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+body+lipid+and+triglyceride+response+to+energy+deficit:+relevance+to+body+composition+models.">Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models.</a> The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).</li><li>Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+wax+ters+and+other+lipids+by+the+marine+copepod,+Calanus+helgolandicus.">The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus.</a> J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+PPARalpha+in+maintaining+phospholipid+and+triacylglycerol+homeostasis+during+energy+deprivation.">Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation.</a> J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).</li><li>Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+lipid-globular+protein+mosaic+model+of+membrane+structure.">A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Turkish, A. R., Sturley, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neutral+lipid+biosynthesis:+an+evolutionary+perspective.">The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم مصالح متضاربة الكشف.

بروتوكول يسمح لتقديم السريع، وفحص نطاق واسع من مستويات الدهون في C. ايليجانس، والتي يمكن تكييفها بسهولة إلى شاشات إنتاجية عالية. على عكس الأساليب المستخدمة سابقا، والتي تنطوي على خطوة تثبيت مطولة في بارافورمالدهيد تليها دورات تجميد ذوبان الجليد العديد من 8،10، لدينا بروتوكول يتطلب بسيطة دقيقة 3-التثبيت في الأيزوبروبانول. وقد وجدنا أن من تلطيخ C. ايليجانس في الأيزوبروبانول 40٪، فإنها تصبح قابلة للاختراق بحرية إلى الأحمر النيل، دون استخدام خطوات إضافية تجميد ذوبان الجليد أو التثبيت. أيضا، والنيل الأحمر fluoresces انتقائي في حجرات مسعور في الطيف الأخضر 18،19،31، لا destaining ضروري. في المجموع، يمكن أن تؤخذ من الحيوانات لوحات للحيوانات رني صورة الملون وعلى استعداد لفي يزيد قليلا عن 2.5 ساعة. لا يمكن أن يؤديها غير مكلفة نسبيا هذا الأسلوب مع واستنساخ عالية. الأسلوب لا يعتمد على قدرة C. ايليجانس لامتصاص أو التركيزالصبغة، وبالتالي ليس لديها نفس القيود القائمة على استخدام أساليب التغذية الحيوية الأصباغ. نظرا للتكرار ودقة القياسات، وطريقة مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الجينات inactivations بواسطة رني. إذا تم تحديد الكميات المطلوبة من مستويات الدهون استنادا إلى تلطيخ مثبت الأحمر النيل، من المستحسن استخدام مكررات من 4-6 البيولوجية مع الضوابط المناسبة واختبار الإحصائية المطبقة. فمن المرجح أن الجين inactivations مما يؤدي إلى العديد من الحيوانات الصغيرة (بسبب استنساخ رني تسبب تأخر التنمية أو ألقي القبض عليهم) وتخرج من شاشة للمنظمين الدهون، بغض النظر عن أي اتصال التمثيل الغذائي للدهون. في حين أن برنامج تحليل الصور المستخدمة أننا حسابات للديدان من مختلف الأحجام من تطبيع كثافة مضان إلى منطقة دودة، قد الباحثين الفردية تحتاج أيضا إلى النظر في المقارنة بين مستويات الدهون تلطيخ من الحيوانات الصغيرة للحيوانات البرية من نوع المرحلة التنموية مماثلة. في<html> حالة الحيوانات الصغيرة أو القبض تنمويا مع كتلة واضحة منخفض الدهون، فإننا نقترح أن لا طريقة واحدة هي كافية لإثبات تغيير استقلاب الشحوم. يمكن أن يطلب عدة تجارب المتابعة، بما في ذلك SPE-GCMS، للتأكد من وظيفة الدهون التنظيم من هذه الجينات. لمنظم التمثيل الغذائي المعروفة fasn-1، SPE-GCMS تحليل مقارنة المتطابقة تنمويا الحيوانات N2 تحكم L2 كان ضروريا لتأكيد واضح النمط الظاهري قليل الدسم وجدت بالمقارنة مع الحيوانات مراقبة الكبار. بينما الدهون النيل تلطيخ حمراء أشارت انخفاض مستويات الدهون النسبي للسيطرة الكبار رني، بالمقارنة مع مرحلة المطابقة الحيوانات L2 رني السيطرة، ولم يحدث فارق واضح. وفقا لذلك، واستخدام أسلوب الثاني، أي الكمي البيوكيميائية لنسبة TAG / PL كان من الضروري تحديد ذلك fasn-1 هو المنظم الحقيقي لكتلة الدهون، كما fasn-1 رني تكون مميزة كيميائيا من مرحلة المطابقة الحيوانات L2 رني السيطرة. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; وفي حين نقدم التصوير وتجهيز منصة عالية الإنتاجية، ويمكن بسهولة المجهر تستقيم التقليدية يمكن استخدامها لالتقاط الصور من الديدان التي شنت على منصات الاغاروز 20 أو على الحجم تفلون التقليدية المطبوعة 8 حتي 12 الشرائح المجهر بشكل جيد . والقيد الوحيد هو أنه مع مضان أخضر من قطرات الدهون ملطخة photobleaches الأحمر النيل بسرعة ومنهجية وظروف التعرض موحدة تحتاج إلى استخدامها لضمان إمكانية المقارنة بين الصور. نجد أن المجهر مؤتمتة بالكامل مع شروط الحصول على الصور موحد يعمل على نحو أفضل في هذا الصدد. واحدة من نقاط القوة العظيمة من هذا البروتوكول هو أن يتم جمع الصور بعد يمكن حفظها لمستقبل إعادة التحليل. ويمكن استخدام نفس الصور لتحديد حجم الجسم، بالإضافة إلى محتوى الدهون. علاوة على ذلك، برامج الحاسوبية أصبحت أكثر تقدما، وهناك احتمال واحد للتحليل الدودة، وتوليد نتائج ذات دلالة إحصائيةمن بئر واحد. وبالتالي لدينا طريقة التي تستخدم عالية الإنتاجية المجهري لديها بعض المزايا على الشاشة المنهجيات التي تستخدم نشرت Biosort Copas لتحديد إشارات الفلورسنت 32،33. ومع ذلك، فإن المنهجيات مجانية بالتأكيد. دقيقة، الكيمياء الحيوية من تقرير المحتوى الدهني بواسطة SPE وGC / MS يؤكد تلطيخ حمراء النيل من مخازن الدهون الرئيسية في C. ايليجانس. على الرغم من أن الكميات المطلقة من تحقيق مثبت تلطيخ الأحمر والنيل البيوكيميائية تقرير الدهون غالبا ما لا تتطابق تماما، وكلاهما الأساليب إنتاج استنساخه للغاية، والنتائج ذات دلالة إحصائية التي توافق نوعيا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون مصممة هذه الطريقة لتلبية الاحتياجات المحددة من الباحثين الفرد الذي قد يتطلب مزيدا من التحليل لفئات منفصلة من الشحميات السفنغولية السكرية، الدهون الفوسفاتية، أو الدهون الثلاثية الموجودة في عينات مختلفة. تجدر الإشارة إلى أن مجموعات أخرى استخدمت تقنية أخرى ثان SPE لفصل الطبقات الدهنية قبل GC / MS 22. طبقة رقيقة اللوني (TLC) وارتفاع ضغط اللوني السائل (HPLC) والمزايا على SPE في أنها قد تكون قادرة على تحسين نسبة الدهون في منفصلة متميزة محايدة (على سبيل المثال TAG، diacylglycerols، والأحماض الدهنية الحرة، واسترات الكولسترول) من الدهون القطبية (فسفاتيديل، فسفاتيديل إيثانولامين) والدهون الإسفنجية جليكول. نختار SPE لأنه يتطلب حدا أدنى من بدء المواد (2،500-5،000 الديدان)، فإنه يؤكد على مخازن كبيرة للطاقة على المدى الطويل، والعلامات، والتي تشكل أكثر من جزء الدهون محايدة 4، وسريع، لا تتطلب معدات متخصصة أو لوحات. وينبغي التأكيد على أن تستند إلى خليط القياسية، SPE يفصل تماما من الكلمات الثابتة والمتنقلة، واستنساخه للغاية ويمكن الاعتماد عليها (انظر الشكل 5A). بينما الكميات وتحليل حمض الدهنية استرات الميثيل يتطلب GC / MS، هذا الجهاز يتوفر عادة، وإذا لم يكن محليا، قد عيناتأن تتولد على النحو الوارد أعلاه وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت النيتروجين حتى يتم ترتيب تحليلها من قبل متعاون أو خدمات تجارية GC / MS. الإخراج GCMS يحتوي على بيانات عالية الدقة على كل الأحماض الدهنية داخل كل نوع الدهون. هذا يسمح بتحديد الاختلافات بين العينات مقارنة مفصلة. وكمثال على ذلك، يمكن للمحقق تحديد ما إذا تم تغيير مستويات معينة من الأحماض الدهنية في وفرة أكبر بكثير من غيرها في DAF-2، LPD-3-1 أو fasn رني مقابل مكافحة النواقل. وهذا يمكن أن توفر أداة قوية جدا لذلك معلومات مفصلة عن الأنواع التي يتم تغيير في وفرة الدهون مع أي تلاعب التجريبية. لتحليلنا، ونحن في معظم الأحيان إلى تطبيع الشامل TAG الشامل PL. بينما يمكن أيضا البروتين DNA أو استخدامها لتطبيع الشامل الدهون بعد أن تقرر من قسامة من بيليه دودة sonicated، نجد أن هذه الأساليب تخضع إلى intالإنسان الخطأ roduced خلال جميع الخطوات pipetting والانتعاش في كل عينة من الاستخراج. ولهذا السبب اخترنا لاستخدام بدلا PL الشامل، وعامل تطبيع لدينا. معايير غير طبيعية قدم في بداية البروتوكول (tritridecanoin لTAG، 1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات-(1&#39;-RAC-الجلسرين) لPL) وتنفذ من خلال جميع الخطوات لاستخراج الطور الصلب و FAME إعداد، وضمان الانتعاش الكمي وممثل لكل من والكسور TAG PL. لا يمكن ضمان نفس بذل المحققون إذا استخدام البروتين أو الحمض النووي لتطبيع الشامل TAG. نعتقد PL أن تكون أقوى مقياس يمكن من خلالها مقارنة مستويات TAG عبر عينات، كما هو موضح في وقت سابق ان وبدقة فقط تغيير PL من قبل نفس الحوافز إحداث تحولات كبيرة في مستويات الشامل TAG والتجويع الموسعة على سبيل المثال أو زيادة ممارسة 34 - 36. ويعتقد PL أن تلعب دورا الهيكلية، وضمان سيولة الغشاء الخلوي والأسواق العالمية ضغطهاgrity والأدوار يشير بدلا من تخزين الطاقة 37-39. في أيدينا، فإن نسبة TAG / PL الأكثر تطابقا يطابق ما يتم الحصول على تلطيخ من الدهون مثبت القائم مع أحمر النيل، وتتفق مع تلك التي وجدت من قبل الجماعات الأخرى 21. ويستخدم استراتيجية بديلة من قبل المختبر واتس، حيث يتم حساب النسبة المئوية للدهن TAG مقابل الدهون الكلية 9،22،29. استخدام أنواع غير أصلية من وTAG القياسية PL يضمن أنه سيتم إدراج أي الأحماض الدهنية الأصلية في حساب التطبيع. ويستند بحتة اختيار طول السلسلة على ضرورة هذه المعايير لعدم التدخل في أطياف الشامل من الأحماض الدهنية الأصلية. لقد وجدنا أن الأحماض الدهنية من 13:00 17:00 وخدمة أفضل لهذا الغرض. فمن الممكن، وبالنظر إلى خصائص كيميائية مختلفة من الأحماض الدهنية سلسلة أقصر، أن لدينا معايير الأحماض الدهنية غير طبيعية قد لا تكون ممثلة لاسترداد جميع الأحماض الدهنية سلسلة ذات طول أو سلاسل مع فرقمؤشرات التشبع erent. وبالتالي فمن الممكن أنه خلال SPE أو GCMS أننا قد نرى الاختلافات في كفاءة تنقية أو الكشف الدهون من بين أطوال السلسلة مختلفة. بناء على هذا، والتأين مختلفة من الأحماض الدهنية المختلفة في GCMS، فإنه ليس من الممكن لجعل عبارة عن وفرة مطلقة من الحمض الدهني أي معين. لذلك، ما قارنا بين عينات فقط ضمن الكميات المتوفرة تجربة واحدة من الحمض الدهني أي معين. يمكن إذا كان أحد يريد أن quantitate على الاطلاق الأحماض الدهنية، واحدة بطريقة يمكن تحقيق هذا من شأنه أن يكون لتشغيل عينة أعدت على النحو الوارد أعلاه ارتفعت مع كمية معروفة من إصدار ثابت المسمى isotopically C 13 من ذلك أو الأحماض الدهنية مماثلة، بحيث يمكن أن يكون تميز على أساس كتلة أيون الأصل في MSD، على سبيل المثال. نظرا لأننا تقارن سوى كميات النسبية للفئات الدهون أو أي حمض الدهنية نظرا، لدينا TAG 13:00 17:00 والمعايير PL تخدم هذا الغرض على نحو كاف، على الأقل من حيث التكلفة، إلىأؤكد التأهيل وممثل عن كل فئة الدهون. حتى هذه النقطة، كان هناك عدم وجود توافق في الآراء حول تفسير بعض النتائج التي حصل عليها مختلف المنهجيات، وإلى أي المنهجيات السائدة ينبغي أن يكون. وينبغي أن يلاحظ عموما أن يعتبر مثاليا لا أسلوب واحد في عزلة لدراسة التمثيل الغذائي للدهون في C. ايليجانس. ومع ذلك، باستخدام الفحص متعددة وطرائق التحقق من الصحة، يمكن للمرء أن تحقيق الثقة في البيانات التي تم الحصول عليها على الجينات التنظيمية الدهون. وبالتالي، فإننا نعتزم لبروتوكول لدينا لتكون بمثابة مؤشر للعمل في المستقبل في مجال C. ايليجانس البحث الدهون.

حفظ المسارات الأيضية بين البشر والديدان الخيطية Caenorhabditis ايليجانس يجعل من كائن نموذج قوي لدراسة السمنة. بينما C. ايليجانس لم يكن لديك الخلايا الشحمية مخصصة لتخزين الدهون في الثدييات مثل، فإنها مخزن الدهون الثلاثية في قطرات الدهون (1) وتملك العديد من المنظمين من نفس تخزين الدهون واستخدام الطاقة 2،3. لفحص لمستويات الدهون في C. ايليجانس، تم اقتراح عدة أساليب مع مستويات مختلفة من سهولة ونجاح. وقد دعا مؤخرا استخدام مرة واحدة مشتركة من الأصباغ، فلوري الحيوية 4-7 في السؤال، وهذه الكواشف ثبت أن تلطيخ مقصورة متميزة من مستودع تخزين الدهون الرئيسية للC. ايليجانس 1،8-11. مثبت على أساس غير الفلورية الأصباغ، مثل الأسود والنفط السودان الحمراء O-، في حين نجحت في تسليط الضوء على قطرات الدهون في الدودة 12-14، كما لم يكن لديك مجموعة كبيرة ديناميكية لتحديد الكميات وfluoresالأصباغ 8،13،15 المائة. وعلاوة على ذلك، الأساليب المتبعة حاليا في تثبيت الأصباغ لكلا الفلورية وغير الفلورسنت، تستغرق وقتا طويلا وتنطوي على عدة خطوات تجميد ذوبان الجليد و / أو استخدام المواد الكيميائية السامة 1،9،10. تم إبلاغ الإدارة عن استخدام الدهون BODIPY محددة النظير التي تحمل علامات لتسليط الضوء على قطرات الدهون عند تغذية الديدان تعيش مع وضع العلامات على المدى القصير 15. ولكن هذا يعتمد على امتصاص الصبغة ومنحازة لذلك من قبل C. ايليجانس المناولة والتمثيل الغذائي للBODIPY النظير الأحماض الدهنية. بديل للدهون، التي أنشئت لتلطيخ الأصباغ هي التسمية خالية ومتماسكة لمكافحة ستوكس نثر رامان (CARS) أو نثر رامان حفز (SRS) المجهري، والتي تستفيد من خصائص مميزة الذبذبات من الجزيئات الدهنية لتصور مخازن الدهون 10،16، 17. ومع ذلك، المعدات المتخصصة مكلفة ضروري لهذا الأسلوب، والإنتاجية منخفضة في أحسن الأحوال. لتلبية حاجة للanaly وسريعة قابلة للتطويرالهيئة العامة للاستعلامات من مخازن الدهون محايدة في C. ايليجانس البحث الأيضية، ونحن نقدم رواية وطريقة استنساخه للغاية من مثبت القائم على النيل تلطيخ الدهون الحمراء. الخواص الطيفية والفيزيائية والكيميائية للدهون الأحمر صبغ النيل لحث على التحول الأصفر والذهب الأطياف في ذروة الإثارة في الانبعاثات، والسماح لها يتألق في الطيف الأخضر عند الانبعاثات فقط في بيئة غنية بالدهون يمكن، ولكن ليس في البيئات القطبية أكثر 18 ، 19. بالتالي يمكن الكشف عن قطرات الدهون بعد تلطيخ بسيطة عن طريق استخدام فلتر الفلورية الخضراء (GFP) تعيين البروتين للفحص المجهري مضان. سهولة والقدرة على تحمل تكاليف هذه التقنية تجعل من مناسبة بشكل مثالي لشاشات إنتاجية عالية. علينا أن نبرهن أيضا مقترن، طريقة دقيقة جدا لتحديد البيوكيميائية من الدهون الثلاثية والدهون الفوسفاتية باستخدام الصلبة استخراج الغاز والمرحلة الطيف اللوني الشامل. البيوكيميائية قياس الدهون يرتبط بتصميم المجهرية النيل الأحمر القائم على C. ايليجانس كرة القدموينبغي أن تستخدم ر الشامل، وتأكيدا للنتائج التي بعزم الدهون المجهرية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 96-دبوس المكرر </td><td> نونك </td><td> 250520 </td><td></td></tr><tr><td> LB آجار </td><td> الولايات المتحدة الحيوية </td><td> L1500 </td><td></td></tr><tr><td> الاغاروز </td><td> إينفيتروجن </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettors الميكانيكية </td><td> Biohit M الخط </td><td> M10، M100، M300 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettor الإلكترونية </td><td> Biohit E الخط </td><td> E1200 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 </td><td> سيجما </td><td> P0662 </td><td> الأس الهيدروجينى 6.0 المعقم بواسطة التعقيم </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 </td><td> سيجما </td><td> M2643 </td><td> تعقيم بواسطة النمسويoclaving </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> سيجما </td><td> C2661 </td><td> تعقيم بواسطة التعقيم </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> S5886 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ملغ / مل نسبة الكولسترول في الدم </td><td> سيجما </td><td> C8667 </td><td> في الإيثانول بنسبة 100٪ </td></tr><tr><td> 200 ملغ / مل كربنيسيلين </td><td> الولايات المتحدة الحيوية </td><td> C1100 </td><td> فلتر المعقم 0،2 μ </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> الولايات المتحدة الحيوية </td><td> I8500 </td><td> فلتر المعقم 0،2 μ </td></tr><tr><td> 100 ملغ / مل أمبيسيلين </td><td></td><td></td><td> فلتر المعقم 0،2 μ </td></tr><tr><td> 5 ملغ / مل التتراسيكلين </td><td></td><td></td><td> في الإيثانول بنسبة 100٪ </td></tr><tr><td> Bacto آجار </td><td> BD </td><td> 214040 </td><td></td></tr><tr><td> 96-TC جيدا لوحات </td><td> BD-FALCفي </td><td> 353072 </td><td> ل96-جيدا رني </td></tr><tr><td> لوحات مستطيلة A / T </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 242811 </td><td> لختم رني </td></tr><tr><td> LB وسائل الإعلام </td><td> الولايات المتحدة الحيوية </td><td> L1530 </td><td> أعدت وفقا لتعليمات الشركة الصانعة </td></tr><tr><td> 96-الآبار العميقة كتل الفحص حسنا </td><td> كورنينج </td><td> COSTAR 3960 </td><td> كتلة مستطيلة مقايسة V-الأسفل </td></tr><tr><td> 96-الضحلة جيدا بلوك الفحص حسنا </td><td> كورنينج </td><td> COSTAR 3956 </td><td> الجولة كتلة مقايسة V-الأسفل </td></tr><tr><td> العقيمة ختم فيلم </td><td> VWR </td><td> 89134-432 </td><td></td></tr><tr><td> الألومنيوم ختم فيلم </td><td> كورنينج </td><td> COSTAR 6570 </td><td> Thermowell ختم الشريط ل96-وحات جيدة </td></tr><tr><td> M9 العازلة </td><td> رؤية الأمل وآخرون 20 </tد&gt; <td></td><td> انظر أدناه وصفة </td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> بيو راد </td><td> 161-0407 </td><td></td></tr><tr><td> النيل الأحمر </td><td> إينفيتروجن </td><td> N-1142 </td><td></td></tr><tr><td> الأيزوبروبانول </td><td> الصياد </td><td> BP2632-4 </td><td></td></tr><tr><td> 96-PIN الشافطة </td><td> VP العلمية </td><td> VP177A-1 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ملثمون جيدا مجهر الشرائح تفلون </td><td> الحرارية العلمية </td><td> عرف </td><td> يمكن أيضا طلب Trevigen 96-جيدا Cometslide </td></tr><tr><td> 96-جيدا الذهب خاتم Coverslides </td><td> الحرارية العلمية </td><td> عرف </td><td> يمكن استخدام الثانية ايضا 96-جيدا Cometslide </td></tr><tr><td> في آبار عميقة لوحة PCR </td><td> VWR </td><td> 89049-178 </td><td></td></tr><tr><td> غير معقمة لاصقة الفيلم </td><td> VWR </td><td> 60941-070 </td><td></td></tr><tr><td> مجهر عالية الإنتاجية </td><td> لايكا </td><td> DM6000 مؤتمتة بالكامل مع مرحلة قبل 96-جيدا </td><td> مع مجموعة 49002 صفاء مرشح GFP والهدف 2X </td></tr><tr><td> حمام Sonicator </td><td> Diagenode </td><td> Bioruptor XL </td><td></td></tr><tr><td> الكلوروفورم </td><td> سيجما </td><td> 366927-4L </td><td></td></tr><tr><td> الميثانول </td><td> الصياد </td><td> أوبتيما F456-4 </td><td></td></tr><tr><td> فسفوليبيد القياسية </td><td> افانتي الدهون القطبية </td><td> 830456P </td><td> 1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات-(1&#39;-RAC-الجلسرين) </td></tr><tr><td> الدهون الثلاثية القياسية </td><td> NuChek الإعدادية </td><td> T-135 </td><td> tritridecanoin </td></tr><tr><td> Wiretrol 50 ميكرولتر الماصة </td><td> الصياد </td><td> 21-176-3A </td><td> دروموند Scientfic </td></tr><tr><td>الأسيتون </td><td> سيجما </td><td> 320110-4L </td><td></td></tr><tr><td> حمض الكبريتيك </td><td> الصياد </td><td> A300-500 </td><td></td></tr><tr><td> الهكسان </td><td> الصياد </td><td> أوبتيما H306-1 </td><td></td></tr><tr><td> SPE السيليكا العمود </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 60108-317 </td><td> Hypersep SI، 100 سرير الراتنج ملغ </td></tr><tr><td> المرحلة الصلبة المنوع اللوني </td><td> سيجما </td><td> 57265 </td><td> Supelco Visiprep 24-DL </td></tr><tr><td> البورسليكات Pipets </td><td> الصياد </td><td> 13-678-27F </td><td> حجم 10 مل </td></tr><tr><td> البورسليكات باستور Pipets </td><td> الصياد </td><td> 13-678-8B </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب الثقافة البورسليكات </td><td> الصياد </td><td> 14-961-27 </td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات أنابيب الخيوط </td><td> VWR </td><td> 14235-460</td><td> 8 مل القدرات </td></tr><tr><td> قبعات الفينولية للأنابيب الثقافة </td><td> الصياد </td><td> 14-823-211 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS الاوتوماتيكى قوارير </td><td> اجيلنت </td><td> 5188-6592 </td><td></td></tr><tr><td> مباراة دولية مع منتخب قوارير الاوتوماتيكى </td><td> اجيلنت </td><td> 5185-5861 </td><td></td></tr><tr><td> GC / MS </td><td> اجيلنت </td><td> 6890 GC / MSD 5973 </td><td> تجهيزه مع عمود Supelcowax-10 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الديدان الخيطية وسائط النمو (NGM): لمدة 25 لوحات رني 96-حسنا، التحضير 1 L من NGM: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> منزوع الأيونات الماء </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 3 ز </td></tr><tr><td> الاغاروز </td><td> 17 غرام </td></tr><tr><td> Bacto ببتون </td><td> 2.5 غرام </td></tr><tr><td colspan="2"> دورة السائل الأوتوكلاف 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مع قضيب تحريك. السماح لتبرد إلى 60 درجة مئوية مع التحريك على مجموعة صفيحة ساخنة في 60 ° C. ثم يضاف ما يلي: </td></tr><tr><td> 1 M MgSO 4 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 5 ملغ / مل الكولسترول </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 1 M KH 2 PO 4 (الرقم الهيدروجيني 6.0) </td><td> 25 مل </td></tr><tr><td> 1 M CaCl 2 </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 200 ملغ / مل كربنيسيلين </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> 1 M IPTG </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td colspan="2"> الاستغناء في لوحات رني 96-أيضا. المحل في 4 درجات مئوية حتى استخدام أسابيع لتصل إلى 2. </td></tr></tbody></table> مستطيلة آجار LB أمبيسيلين / التتراسيكلين لوحات (A T /): لمدة 20 لوحات A / T، L التحضير 1 من وسائل الإعلام: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td&gt; الكاشف </td><td> كمية </td></tr><tr><td> منزوع الأيونات الماء </td><td> 1 L </td></tr><tr><td> أجار LB (US الحيوية) </td><td> 32 غرام </td></tr><tr><td> 2 M هيدروكسيد الصوديوم </td><td> 1.5 مل </td></tr><tr><td> Bacto أجار </td><td> 2.5 غرام </td></tr><tr><td colspan="2"> دورة السائل الأوتوكلاف 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة مع قضيب تحريك. السماح لتبرد إلى 60 درجة مئوية مع التحريك على مجموعة صفيحة ساخنة في 60 ° C. ثم يضاف ما يلي: </td></tr><tr><td> التتراسيكلين </td><td> 3 مل </td></tr><tr><td> 100 ملغ / مل أمبيسيلين </td><td> 0.5 مل </td></tr><tr><td colspan="2"> الاستغناء 45 مل في كل لوحة. مخزن في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام، ما يصل إلى 4 أسابيع. </td></tr></tbody></table> LB نمو البكتيريا وسائل الإعلام: لمدة 4 L، كافية لزراعة وresuspending 25 96 كتل جيدا مزيج بودرة LB 62 ز (US بيولوجيALS)، 4 L المياه المقطرة، و 4.8 مل 2 M هيدروكسيد الصوديوم. الأوتوكلاف في 1 L أو L مأخوذة 0.5، دورة السائل، و 40 دقيقة. ويمكن تخزين ما يصل إلى 1 سنة في زجاجات محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة. إذا تجاهل غائم. 100 ملغ / مل أمبيسيلين خلط مسحوق 5 غ الأمبيسلين والماء منزوع الأيونات إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. تصفية تعقيم 0،2 μ، موزعة في 1 مليلتر مأخوذة في وتجميد -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. 5 ملغ / مل التتراسيكلين إضافة مسحوق 1،25 ز التتراسيكلين لمل ايثانول 250 100٪. تخلط جيدا حتى يذوب تماما وتخزينها في -20 درجة مئوية في وعاء محكم الضوء. 200 ملغ / مل كربنيسيلين مزيج بودرة 10 غ كربنيسيلين والماء منزوع الأيونات إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. تصفية تعقيم 0،2 μ، موزعة في 1 مليلتر مأخوذة في وتجميد -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. 5 ملغ / ملكولسترول إضافة إلى 1،25 ز الكولسترول مل ايثانول 250 100٪. تخلط جيدا وتخزينها في C ° 4 لمدة تصل إلى 6 أشهر. 1 M MgSO 4 حل 120،37 ز MgSO 4 في الماء 800 مل منزوع الأيونات. جلب الحجم النهائي إلى 1 L. الأوتوكلاف 40 دقيقة دورة السائل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 1 M CaCl 2 حل 110،98 ز CaCl 2 في الماء 800 مل منزوع الأيونات. جلب الحجم النهائي إلى 1 L. الأوتوكلاف 40 دقيقة دورة السائل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 1 M KH 2 PO 4، 6،0 درجة الحموضة حل 136،09 ز KH 2 PO 4 في الماء 800 مل منزوع الأيونات. درجة الحموضة إلى 6.0 وجلب الحجم النهائي إلى 1 L. الأوتوكلاف 40 دقيقة دورة السائل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. M9 الاحتياطي: لROU L-1 نحنجعل tinely دفعات L 8-10 حل 3 غ KH 2 PO 4 و 6 ز نا 2 HPO 4 و 5 ز كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgSO 4 في 900 مل. جلب الحجم النهائي للقسامة L. 1 في زجاجات 100-500 مل والأوتوكلاف 40 دقيقة على دورة السائل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 10 N هيدروكسيد الصوديوم حل هيدروكسيد الصوديوم في 400 غ ماء 800 مل منزوع الأيونات، والسماح لتبرد وتقديمهم إلى وحدة تخزين النهائي للمخزن L. 1 في 50 مل أنابيب في درجة حرارة الغرفة. 1 M IPTG إضافة إلى 23،81 ز IPTG منزوع الأيونات الماء وجلب الحجم الإجمالي إلى 100 مل. تصفية تعقيم 0،2 μ، موزعة في 1 مليلتر مأخوذة في وتجميد -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. البيض إعداد بليتش / هيدروكسيد الصوديوم الحل: 20 مل تكفي لإعداد بيضة واحدة إضافة 4 مل التبييض، 1 مل 10 N هيدروكسيد الصوديوم، 5 مل H 2 O، و10 ملM9 عازلة لأنبوب 50 مل المخروطية البولي بروبلين. على الفور قبل الاستخدام. الحل الأسهم الحمراء النيل إضافة 50 مل الأسيتون 100٪ ل25 ملغ مسحوق أحمر النيل. تخلط جيدا وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في ضوء محكم حاوية parafilmed. ويمكن تخزينها لأشهر بهذه الطريقة. النيل حل تلطيخ الحمراء: ل500 مل، كافية لتلطيخ 30 × 96-وحات جيدة إضافة 3 مل الأسهم الحمراء النيل حل ل500 مل الأيزوبروبانول ت / ت 40٪. تخزن في درجة حرارة الغرفة في زجاجة احباط الملفوفة. إعداد فورا قبل الاستخدام. فسفوليبيد القياسية تزن 7،6 ملغ فسفوليبيد القياسية، 1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero-3-الفوسفات-(1&#39;-RAC-الجلسرين)، في كوب زجاجي. حل في 20 مل كلوروفورم 02:01: الميثانول (25 nanomoles في 50 ميكرولتر). تبقي مغطاة رقائق الألومنيوم حتى الاستخدام.ويمكن أيضا أن تظل في مستوى C ° -80 في قنينة زجاجية مع غطاء محكم الفينول لمدة 1 سنة. الدهون الثلاثية القياسية تزن 6،8 ملغ الدهون الثلاثية القياسية، tritridecanoin، إلى كأس زجاجي. حل في 30 مل كلوروفورم 02:01: الميثانول (16.7 nanomoles في 50 ميكرولتر). تبقي مغطاة رقائق الألومنيوم حتى الاستخدام. ويمكن أيضا أن تظل في مستوى C ° -80 في قنينة زجاجية مع غطاء محكم الفينول لمدة 1 سنة. </td></tr></tbody></table>

biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in caenorhabditis elegans

والديدان الخيطية C. كما برز ايليجانس نموذجا هاما لدراسة مسارات الوراثية الحفظ تنظيم التمثيل الغذائي للدهون من حيث صلته السمنة والأمراض البشرية المرتبطة به. المنهجيات السابقة عدة وضعت لتصور C. وقد أثبتت ايليجانس الدهون الثلاثية الغنية مخازن الدهون لتكون خاطئة، وتسليط الضوء مقصورات الخلوية الأخرى من قطرات الدهون. أساليب أخرى تتطلب معدات متخصصة، تستغرق وقتا طويلا، أو تسفر عن نتائج غير متسقة. ونحن نقدم ل، استنساخه السريع، مثبت على أساس تلطيخ حمراء النيل طريقة للكشف السريع والدقيق من قطرات الدهون محايدة في C. ايليجانس. خطوة قصيرة في تثبيت الأيزوبروبانول 40٪ يجعل الحيوانات قابلة للاختراق تماما إلى اللون الأحمر النيل، والذي يستخدم بعد ذلك لوصمة عار الحيوانات. الخواص الطيفية لهذه الصبغة محبة للدهون يسمح لها بقوة وبشكل انتقائي يتألق في الطيف الأصفر والأخضر عند فقط في بيئة غنية بالدهون يمكن، ولكن ليس في أكثرالقطبية البيئات. وهكذا، يمكن أن قطرات الدهون يمكن تصور على المجهر الفلورسنت مجهزة بسيطة GFP قدرة التصوير إلا بعد خطوة قصيرة النيل تلطيخ حمراء في الأيزوبروبانول. السرعة، القدرة على تحمل التكاليف، واستنساخ هذا البروتوكول جعلها مناسبة بشكل مثالي لشاشات إنتاجية عالية. علينا أن نبرهن أيضا وسيلة لتحديد الاقتران البيوكيميائية من الدهون الثلاثية والدهون الفوسفاتية باستخدام الغاز اللوني الطيفي الشامل. وينبغي استخدام هذا البروتوكول أكثر صرامة وتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها من الدهون تقرير الأحمر النيل المجهرية. ونحن نتوقع أن هذه التقنيات سوف تصبح معايير جديدة في مجال C. ايليجانس البحث الأيض.

ويرد مثال لوحة المصورة التي تم اتخاذها خلال سير العمل تلطيخ الدهون في الشكل 1. الضوابط الخاصة للدهون عالية (DAF مستقبلات الأنسولين-2 رني)، والدهون منخفضة (LPD-3 البروتين المطلوبة لتخزين الدهون حبيبات في الأمعاء رني)، والدهون الصغيرة ومنخفضة (fasn-1 سينسيز الأحماض الدهنية رني)، وناقلات الفارغة ( التحكم) تظهر الاختلافات في كثافة مضان وفقا لمستويات الدهون من الحيوانات، والمبالغ التي يحددها الدهون المقابلة GC / MS تحليل (الشكل 2). نلاحظ أن الجين يؤدي إلى inactivations القبض تنمويا والحيوانات الصغيرة سوف تظهر في كثير من الأحيان أن يكون أقل بكثير من الدهون السيطرة الحيوانات الكبار، بغض النظر عن أي اتصال التمثيل الغذائي للدهون (الشكل 3). ويجب أن يتم تحليل الثانوي، بما في ذلك تحليل الدهون والكيمياء الحيوية تلطيخ مع SPE-GCMS من الحيوانات البرية من نوع السيطرة من مرحلة تنموية مماثلة لضمان صحةصغيرة أو القبض تنمويا مشاهدات إيجابية. في حالة fasn 1-رني (الشكل 2)، L2 الحيوانات في اعتقال وأو L3 مرحلة اليرقات، ويكون أقل من الدهون تلطيخ رني تحكم الكبار، ولكن مماثلة في وفرة لL2-L3 الحيوانات المرحلة رني التحكم (وصمة عار في المئة من الدهون من رني تحكم الكبار: 49.9 ± 4.5٪ لfasn 1-رني و 20.2 ± 2.1٪ لL2 التحكم رني، و 64.7 ± 1.3 لمراقبة رني L3). بدلا من ذلك، أشار التحليل الكيميائية الحيوية أقل TAG / PL نسبة من المرحلة L2 مطابقة الحيوانات السيطرة N2 (TAG / PL: 22.5 ± 2.9 لfasn 1-رني و 46.1 ± 3.4 لمرحلة المطابقة رني السيطرة، P ≤ 0.05). وبالتالي يمكن في هذه الحالة أن يقر ذلك عن طريق تحليل البيوكيميائية التي fasn-1 له دور في تخزين الدهون بدلا من الحد فقط لمرحلة محددة في كتلة الدهون. تحليل متابعة الديدان المصورة تعتمد اعتمادا كبيرا على منصة الحسابية مثل خلية باستخدام التعريفوWormToolbox 30. بالنسبة للأعداد الصغيرة من الصور، قد يتم استخدام تحليل الصور متاحة للجمهور منصة مثل يماغيج، متاحة بحرية من المعاهد الوطنية للصحة. لتحليلنا، استخدمت البرامج النصية فريدة مطلب أول من تحديد البئر، وبعد ذلك لاستبعاد تلك الآبار فارغة أو مع فقاعات، والتمييز بين الحطام صغيرة من الديدان. وكان دليل مراقبة الجودة اللازمة لوضع علامة الصور للاستبعاد وذلك للأسباب المذكورة أعلاه. وجدنا أن كثافة تجريبيا المئين 90 بكسل دودة عبر حسنا، لتطبيع منطقة الدودة عبر حسنا، قدمت متسقة متري من تلطيخ كثافة في جميع مراحل التنمية دودة (الشكل 3). دمج كتلة الدهون الإجمالية فوق منطقة الدودة، على العكس من ذلك، من شأنه أن يحرز الديدان الصغيرة مكافئ مشرق مع الديدان قاتمة كبيرة. لأن أسلوبنا لا دمج إشارة الفلورسنت الكاملة على منطقة دودة، في اتخاذ المئوية كثافة، والتغيرات في حجم الدودة في حد ذاتها لا تفعلر التحيز قياس كثافة. بدلا من ذلك، يتم قياس الفروق في توزيع كثافة بكسل. ومع ذلك، على الرغم من هذا، وينظر الفروق وضوحا في تلطيخ بكسل توزيع كثافة بين الحيوانات من مراحل نمو مختلفة، لذلك من المهم أن دراسة تأثير الجينات على أي رني ضد الحيوانات من مرحلة تنموية قابلة للمقارنة (الشكل 3). ويظهر التباين بين متوسط ​​مكررات في الشكل 4 تشير إلى استنساخ عالية من التلوين بطريقة الدهون. نلاحظ أن قوة هذه الطريقة تعتمد بشكل كبير على الحصول على صور ذات جودة لكل لوحة، في ظل ظروف الإضاءة موحدة، وذلك باستخدام مرات التعرض متطابقة، والحد الأدنى مع فقاعات، والحطام، أو الانتقال من الديدان في آبار أخرى. تم إجراء SPE على مختلط مسبقا، تنقية معايير لتحديد الدرجة التي يمكن أن الكلمات لا يمكن فصلها عن PLS (الشكل 5A). في هذا التحليل، حققنا ق 100٪وأشار eparation من TAG وPL، وغياب كامل من الأحماض الدهنية المستمدة من 17:00 PL في العينة TAG وغياب المقابلة كاملة من الأحماض الدهنية المستمدة من 13:00 TAG في العينة PL (الشكل 5A). هكذا هو SPE كفاءة عالية في فصل الطبقات الدهنية. هذا التحليل لا يشير إلى أنه سيتم تنقية كافة العلامات ذات أطوال مختلفة سلسلة من مكافئ SPE والكشف عنها بواسطة GCMS بكفاءة مماثلة. فإنه يؤكد فقط أن يتم فصل تماما والدهون TAG PL في المجموع عن بعضها البعض. يظهر نموذج GC-MS أثر للحيوانات البرية N2 نوع تؤخذ عن طريق استخراج المرحلة الصلبة وإعداد FAME في الشكل 5B. ولكل من TAG PL، يمكن تحديد قمم على أساس الوقت الاحتفاظ الأم وابنتها والأيونات على الطيف الشامل، والمساحة الكلية تحت القمم التي تم تحديدها لتطبيع مجال المعايير الداخلية لكل منها. لتحديد مقدار تطبيع من TAG، ومنطقةفي جميع قمم كروماتوغرام TAG، باستثناء معيار 13:00، أضيفت معا ومقسوما على مساحة تحت الذروة 13:00. وبالمثل، لتحديد المبلغ تطبيع PL إجمالي المساحة تحت كل القمم، باستثناء معيار 17:00، أضيفت معا ومقسوما على مساحة تحت الذروة 17:00. ثم يتم استخدام القيم تطبيع للTAG وعينات PL لحساب النهائي TAG / PL نسبة للعينة: <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1.jpg" alt="المعادلة 1" fo:content-width="2.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq1highres.jpg"/> تجدر الإشارة إلى أن البيانات من SPE-GCMS تسمح بإجراء تحليل أكثر تعقيدا بكثير من الأحماض الدهنية الموجودة في كل جزء من الدهون حسابية بسيطة من مجموع نسبة TAG PL. على سبيل المثال، يمكن دمج المحقق ذروة واحدة الموافق الحمض الدهني واحد وفرة مقارنة تطبيع عبر عينات (مثل جomparing في N2 البرية من نوع DAF-2 مقابل رني منطقة متكاملة من ذروة الذروة 18:00 مقسوما على مستوى 13:00، تطبيع الشامل لPL الإجمالية مقسومة 17:00 PL منطقة ذروة قياسية): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2.jpg" alt="المعادلة 1" fo:content-width="4.873in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq2highres.jpg"/> يتعين على المحقق اختيار، سيكون من الممكن أيضا لتحديد النسبة المئوية للحمض الدهني أي المعطى في كسور أو PL TAG كنسبة مئوية من المبلغ الإجمالي من الأحماض الدهنية quantitated (18:00 باعتبارها المثال في جزء TAG الديدان في N2 ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3.jpg" alt="المعادلة 1" fo:content-width="4.123in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180eq3highres.jpg"/><img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"ALT = &quot;الشكل 1&quot; FO: المحتوى العرض = &quot;3.25in&quot; FO: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50180/50180fig1highres.jpg&quot; /&gt; الشكل 1. سير العمل النموذجي للتجربة بشكل عام. يوم 1، وختمها لوحات المجمدة رني على مكتبة أمبير / تيت لوحات أجار والمحتضنة في LB C. ° 37 يوم 2، وتستخدم الأمبير / تيت لوحات على الثقافات البذور السائل من الحيوانات المستنسخة رني في كتل الآبار العميقة. اليوم 3، تتركز البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وتحويلها إلى لوحات رني 96-أيضا. اليوم 4، L1 فقس البيض C. وأضاف ايليجانس لوحات رني في السائل ويترك ليجف. اليوم 7، يتم جمع الحيوانات في السائل، وصبغت بألوان حمراء النيل في الأيزوبروبانول 40٪، التي شنت على الشرائح تفلون 96-حسنا، وتصويرها باستخدام المجهر عالية الإنتاجية. <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2.jpg" alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig2highres.jpg"/> الشكل 2. مثبت القائم على النيل بقع حمراء كبيرة <em&gt; C. وتظهر ايليجانس مخازن الدهون. مجال مشرق الممثل والصور GFP مضان من N2 الديدان تتغذى على fasn-1 (صغير، قليل الدسم)، LPD 3 (قليل الدسم)، ومراقبة (ناقلات الفارغة)، أو DAF-2 (الدهون عالية) رني استنساخ. تم تجهيز العينات وفقا للبروتوكول (التخطيطي في الشكل 1). الحيوانات ثابتة، ملطخة باللون الأحمر النيل، ونتيجة المصورة في مستويات الدهون مقارنة تم الحصول عليها من قياس الدهون البيوكيميائية. وتظهر الأيزوبروبانول الثابتة النيل الأحمر مستويات مضان، تم الحصول عليها من لا يقل عن 6 مكررات البيولوجية، في الصف الأول. وتظهر مستويات الدهون الثلاثية الكمي، وهذا انعكاس للمخازن الدهون عموما محايدة عندما تطبيع فسفوليبيد إلى مستويات العام (TAG / PL)، التي اتخذت في الفترة من 4 مكررات البيولوجية، في الصف الثاني. من المهم أن نلاحظ أن الكميات المطلقة من تحقيق مثبت تلطيخ الأحمر والنيل البيوكيميائية تقرير الدهون غالبا ما لا تتطابق تماما. في هذه الحالة، على الرغم من النوعيةمماثلة، fasn-1 (رني) لديها اكثر مختلفة الشامل الدهون الثلاثية مقابل سيطرة طرق البيوكيميائية مما تشير إليه المجهر، LPD-3 يختلف نسبيا، وDAF-2 (رني) هو أقل مختلفة، على الرغم من كل الاختلافات ذات دلالة إحصائية عالية و وكانت قياسات متكررة للغاية. البيانات المعروضة هي متوسط ​​± SEM (*، P ≤ 0.01؛ **، P ≤ 0.0001 النسبي للسيطرة، والتي تحددها المفردة، واثنين من الذيل اختبار-T افتراض الفرق متساوية). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. كتلة الدهون التي يحددها تلطيخ تثبيت أحمر النيل في مراحل اليرقات مختلفة. الحيوانات كانت تزرع على OP50 البكتيريا والتي تجمع على L1، L2، L3، L4 ومراحل النمو حامل الكبار. تم التقاط الصور بعد تثبيت تلطيخ وتحليلها باستخدام برنامج نصي مطلب مخصصة لتحديد المئين ال 90 سو كثافة بكسل فوق منطقة الدودة التي تم تحديدها. لاحظ أن مستويات الدهون من الحيوانات ويزيد إلى حد كبير من هذا الحيوان يتطور إلى L2 L4 المرحلة، ومن ثم انخفاضا طفيفا حيث يبدأ الحيوان لتحويل السعرات الحرارية نحو انتشار للسلالة الجرثومية في المرحلة الكبار. البيانات المعروضة هي متوسط ​​± SEM ليعيد 6-8 (**، P ≤ 0.0001 نسبة إلى حامل الكبار، والتي تحددها المفردة، واثنين من الذيل اختبار-T). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. استنساخ عالية عبر البيولوجية مستقلة مكررات. أظهرت هو مؤامرة مبعثر من شدة مضان أحمر النيل عبر البيولوجية مكررات (ن = 6-8). لكل تكرار، وتطبيع جميع القيم إلى كثافة متوسط ​​الضوابط ناقلات الفارغة. البيانات المعروضة هي متوسط ​​± SEM (**، P ≤ 0.0001 النسبي للسيطرة، والتي تحددها المفردة، واثنين من الذيل اختبار افتراض-Tالفرق متساوية). <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5.jpg" alt="الشكل 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50180/50180fig5highres.jpg"/> الشكل 5. GC-MS chromatograms من SPE فصل المعايير والبرية وفرة TAG نوع PL. (A) وترد GC-MS آثار الانفصال SPE من TAG والمعايير PL. لاحظ غياب كامل من الأحماض الدهنية في تتبع 13:00 PL وعدم وجود المقابل للحامض الدهني 17:00 في تتبع TAG، مشيرا الى الفصل التام بين TAG (tritridecanoin) من PL (1،2-diheptadecanoyl-SN-glycero -3-الفوسفات-(1&#39;-RAC-الجلسرين)). (B) A الطيف الكامل للممثل TAG وPL من عينة من نوع البرية N2 الحيوانات التي تتغذى رني مكافحة ناقلات (HT115 البكتيريا مع L4440 رني ناقلات الفارغة). تم حقن عينة واحدة من ميكروليتر إلى GCMS 6890/5973N اجيلنت وفقا للبروتوكول، وحددت قمم الفردية عن طريق شبكة شعيريةالوقت ntion وطيف الكتلة منها. الاختصارات: حمض سيكلو الحلقي، الدسمة، ISO: ISO-الميثيل حمض سلسلة متفرعة الدهنية؛ GLA، وحمض غاما اللينولينيك. ALA، حمض اللينولينيك ألفا؛ DGLA، dihomo حمض اللينولينيك غاما؛ EPA، وحمض الدهني <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50180/50180fig5large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

التقييم المجهري الكيميائي الحيوي والإنتاجية العالية لكتلة الدهون في Caenorhabditis Elegans | الأحياء | فيديو

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

نقدم قوية أساليب الكيمياء الحيوية والمجهرية لدراسة<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; مخازن الدهون. A، بسيطة السريع، وتحديد إجراءات تلطيخ الفلورسنت الدهون التصوير الحبرية روافع الخواص الطيفية للأحمر محبة للدهون النيل صباغة. ثم نقدم قياس الدهون الثلاثية والبيوكيميائية باستخدام الدهون الفوسفاتية الصلبة استخراج الغاز والمرحلة الطيف اللوني الشامل.

الكيمياء الحيوية والعليا تقييم مجهرية مرت من كتلة الدهون في<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

biochemical-high-throughput-microscopic-assessment-fat-mass

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Fundamentals

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Unit 1

Chemistry of Life

Biochemistry of the Cell

SCIENTISTS IN ACTION

20.4K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. نقدم قوية أساليب الكيمياء الحيوية والمجهرية لدراسة Caenorhabditis ايليجانس مخازن الدهون. A، بسيطة السريع، وتحديد إجراءات تلطيخ الفلورسنت الدهون التصوير الحبرية روافع الخواص الطيفية للأحمر محبة للدهون النيل صباغة. ثم نقدم قياس الدهون الثلاثية والبيوكيميائية...

Video: Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

الفرز الفائق الإنتاجية وBiosensing مع نيون C. ايليجانس سلالات

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

الكمية والآلي عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق شاشات رني في C. ايليجانس</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

الجمع بين النوكليوتيدات والاستخراج البروتين في ايليجانس كاينورهابديتيس

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...