نشكر Haruya اونو، شينودا Kosaku، وشارب لويس، Tomoda إيمي، ورويز لورين للمناقشة، والمساعدة التقنية والمساعدة التحريرية على المخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DK087853)، من برنامج للبحوث الطبية الحيوية والاختراق من شركة فارم لAsubio SKULA أيده SHARE زمالات الدكتوراه من جامعة كوبنهاغن ومشروع الاتحاد الأوروبي FP7 DIABAT (HEALTH-F2 -2٬011-278٬373) لمادسن ليز وكارستن كريستيانسن. نعترف أيضا مركز DERC منحة (NIH P30 DK063720).

1. إعداد متوسطة الهضم 5 مل جعل الفئران بنسبة 5 في الأنسجة (حوالي 1 مل / ج 1 الدهنية الأنسجة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن في أنزيمات الهضم: - D Collaginase: 1.5 U / مل (1108874103، 1 غرام، روش، 70334223) - Dispase II: 2.4 U / مل (04942078001، 0980 ملغ / ليو، روش، 11466200) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 مل PBS وتخلط جيدا لإذابة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة CaCl 2 قبل فقط لهضم الأنسجة عند تركيز النهائي من 10 ملم </li></ol> 2. تشريح الأنسجة الدهنية من الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ تشريح بعناية، ومباشرة بعد الفئران (6-8 أسابيع من العمر) وضحى. العمل العقيمة مع الإيثانول يرش على الفراء الماوس قبل فتحه. وضع الأنسجة مباشرة في برنامج تلفزيوني نظيفة، BAT بين الكتفين منفصلة وتحت الجلد WAT الأربية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لBAT بين الكتفين: يكون وضع الماوس مع الجزء الخلفي حتى تواجه، وقطع مفتوحة على طول الظهر وعلى طول الطريق إلى الرقبة. البنيويمكن الاطلاع على الأنسجة الدهنية تحت الجلد الحق بين الكتفين (بين الكتفين). ويمكن رؤية BAT وفصين، فراشة الشكل. وينبغي لA طبقة رقيقة من الدهون البيضاء التي تغطي BAT يمكن إزالتها بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لWAT تحت الجلد (الأربية WAT): إزالة الجلد. تم العثور على الأربية WAT مباشرة تحت الجلد على كلا الجانبين، بدءا تقريبا على ظهره ويذهب إلى جانب، داخل الفخذين وأسفل نحو الخصية. </li></ol> 3. قطع وهضم الأنسجة الدهنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التلوث بسرعة جميع، مثل العضلات، والشعر والهيكل العظمي والنسيج الضام من أقسام الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجف بسرعة على الورق الأنسجة لعدم تمييع المتوسطة تشريح مع PBS ووضعه على طبق جاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الهضم المتوسطة (CaCl أضاف 2 قبل الهضم) واللحم المفروم النسيج الى قطع صغيرة. تخلط جيدا جدا من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل. نقل الأنسجة المفروم في 50 مل أنابيب مع بقية م الهضمedium، مزيج أكثر من pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلاصة في 37 ° C مع التحريض المستمر عند 150 دورة في الدقيقة ل 40-50 دقيقة. تأكد من كل 10-15 دقيقة للتأكد من عملية الهضم يسير على ما يرام ومنع الإفراط في الهضم. </li></ol> ملاحظة: تصحيح المتوسطة الهضم والوقت الهامة. النسيج يحتاج إلى هضم بشكل جيد، ولكن يمكن أن تلحق الضرر الهضم الزائدة الخلايا. 4. تصفية خلية تعليق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف الهضم عن طريق إضافة 5 مل المتوسطة كاملة (FPS DMEM/F12 تحتوي على 10٪ وP / S). يجب أن تكون الخلايا تقريبا متجانسة تماما. مزيج جيد من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن SVF أن ينظر إليه باعتباره بيليه البني على الجزء السفلي من الأنبوب. نضح في طبقة زيتية على رأس خلية شحمية ناضجة وأكثر من طبقة السائل - الحفاظ على بيليه وحلها في المتوسط ​​10 مل كاملة. تخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية (50-70 ميكرون قطر) على مدى 50 جديد<html> مل أنبوب تصفية والتعليق الخلية. </li></ol> 5. لوحة خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب الطرد المركزي 15 مل ب 700 وXG لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة وبيليه اعادة تعليق في المتوسط ​​10 مل كاملة. ماصة وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقدير عدد لوحات المطلوبة. قد تختلف هذه ويعتمد على حجم بيليه. والقاعدة العامة هي لوحات 2 من 10 سم الفئران في الفترة من 5 WAT لوحة واحدة والأربية 10 سم لBAT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا المغلفة لوحة على أطباق الكولاجين (R &amp; D) في المتوسط ​​كاملة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 ساعة بعد الطلاء الخلايا والمتوسطة الرشفة، وغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة المتوسطة. هذه الخطوة مهمة لأن ذلك يمكن أن إزالة خلايا الدم الحمراء، وخلايا المناعة وغيرها من الملوثات. </li></ol> 6. التفريق خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وسائل الصيانة والحث. </li></ol> صيانة المتوسطة استكمال المتوسطة مع إضافة: الأنف والحنجرة &quot;&gt; الأنسولين، اضرب النهائي. 5 ميكروغرام / مل (5 ملغ / مل الأوراق المالية، و*** 100 ميكرولتر من حمض الخليك في 10 مل O 2 H لإعداد يحمض حموضة المياه 2.5. الأسهم المتجر حل الأنسولين في الماء المحمض. في -20 ° C) 3،3 &#39;،5-Triiodo-L-ثيرونين (T3)، اضرب النهائي. 1 نانومتر (10 ميكرومتر الأسهم، *** حل هيدروكسيد الصوديوم 1N في T3 وإضافة إلى جعل 10 متوسطة الأسهم ميكرومتر. سيغما القط # T-2877) المحل في 4 درجات مئوية، وحسن لمدة أسبوع الحث المتوسطة صيانة المتوسطة التي تحتوي على مركبات التالية: اندوميثاسين، اضرب النهائي. 125 ميكرومتر (0.125 M الأسهم في الإيثانول، سيغما القط # I-7378). يجب أن تكون ساخنة الإندوميتاسين إلى 60 درجة مئوية إلى أن تحل. ديكساميثازون، اضرب النهائي. 2 ميكروغرام / مل (2 ملغ / مل في جورب الإيثانول، سيغما القط # D-1756) 3-الاستيوفينون-1-الميثيل (IBMX)، اضرب النهائي. 0.5 مم (0.25 M الأسهم في DMSO، سيغما القط # I-5879) روزيجليتازون، اضرب النهائي. 0.5 ميكرومتر(10 ملم في DMSO الأسهم، سيغما القط # R-2408) ملاحظة: تحقق الحث الطازجة المتوسطة في كل مرة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا الشحمية الأساسية لالتقاء 95-97٪ في المتوسط ​​كاملة (متموجة ولكن ليس معبأة جدا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير كامل المتوسطة منتظمة مع الحث المتوسطة (يوم 0) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة (يوم 2)، تغيير المتوسطة والمتوسطة الصيانة مع روزيجليتازون (0.5 ميكرومتر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 48 ساعة إضافية (يوم 4)، تغيير والمتوسطة صيانة جديدة مع روزيجليتازون (1 ميكرومتر) ل2-3 أيام إضافية. 6-7 أيام بعد إضافة وسيلة تحريض، وخلايا متباينة تماما حتى تنضج الخلايا الدهنية وتمتلئ قطرات النفط. سوف تظهر حول قطرات 3-4 أيام بعد التعريفي. </li></ol> ملاحظة: متوسط ​​تتغير كل 2-3 أيام حتى يتم متباينة تماما الخلايا. ويمكن الآن أن تحصد الخلايا والتعبير مرنا من Ucp1 وآلات موسيقية أخرىويمكن قياس R البني خلية شحمية محددة من الجينات QRT-PCR. وسوف تستخدم لطخة ويسترن للكشف عن البروتينات.

<ol>
	<li>Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity:+genetic,+molecular,+and+environmental+aspects.">Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).</li><li>Rothwell, N. J., Stock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+cafeteria+and+tube-feeding+on+energy+balance+in+the+rat.">Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat.</a> The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).</li><li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue:+function+and+physiological+significance.">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans.">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).</li><li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men.">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).</li><li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults.">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).</li><li>Zingaretti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+UCP1+demonstrates+that+metabolically+active+adipose+tissue+in+the+neck+of+adult+humans+truly+represents+brown+adipose+tissue.">The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans:+effects+of+cold+exposure+and+adiposity.">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).</li><li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRDM16+controls+a+brown+fat/skeletal+muscle+switch.">PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch.</a> Nature. 454, 961-967 (2008).</li><li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+(PPARgamma)+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent,+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes.">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).</li><li>Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fat+interacts+with+QTLs+controlling+induction+of+Pgc-1+alpha+and+Ucp1+during+conversion+of+white+to+brown+fat.">Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat.</a> Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).</li><li>Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cold-induced+recruitment+of+brown+adipose+tissue+thermogenesis.">Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.</a> Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adipose+organ.">The adipose organ.</a> Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).</li><li>Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+brown+adipocytes+in+white+adipose+tissue+during+CL+316,243-induced+reversal+of+obesity+and+diabetes+in+Zucker+fa/fa+rats.">Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats.</a> International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).</li><li>Hansen, J. B., Kristiansen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+circuits+controlling+white+versus+brown+adipocyte+differentiation.">Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation.</a> The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).</li><li>Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARy+agonists+induce+a+white-to-brown+fat+conversion+through+stabilization+of+PRDM16+protein.">PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein.</a> Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding.">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transdifferentiation+properties+of+adipocytes+in+the+adipose+organ.">Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).</li><li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation.">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).</li><li>Petrovic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+(PPARgamma)+activation+of+epididymally+derived+white+adipocyte+cultures+reveals+a+population+of+thermogenically+competent,+UCP1-containing+adipocytes+molecularly+distinct+from+classic+brown+adipocytes.">Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).</li><li>Rong, J. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+mitochondrial+biogenesis+is+suppressed+in+db/db+and+high-fat+diet-fed+mice+and+improved+by+rosiglitazone.">Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone.</a> Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).</li><li>Wilson-Fritch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+remodeling+in+adipose+tissue+associated+with+obesity+and+treatment+with+rosiglitazone.">Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone.</a> The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).</li><li>Sell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonism+increases+the+capacity+for+sympathetically+mediated+thermogenesis+in+lean+and+ob/ob+mice.">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice.</a> Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).</li><li>Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+thiazolidinedione,+NC-2100,+which+is+a+weak+PPAR-gamma+activator,+exhibits+potent+antidiabetic+effects+and+induces+uncoupling+protein+1+in+white+adipose+tissue+of+KKAy+obese+mice.">A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice.</a> Diabetes. 49, 759-767 (2000).</li><li>Vernochet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBPalpha+and+the+corepressors+CtBP1+and+CtBP2+regulate+repression+of+select+visceral+white+adipose+genes+during+induction+of+the+brown+phenotype+in+white+adipocytes+by+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+agonists.">C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).</li><li>Tai, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+nuclear+receptor+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+promotes+brown+adipocyte+differentiation.">Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).</li><li>Sugii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPARgamma+activation+in+adipocytes+is+sufficient+for+systemic+insulin+sensitization.">PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

هنا نقدم نظام موثوق الخلوية لدراسة تطوير خلايا بيج / برايت في الخلايا الشحمية مثقف الأولية في الفئران. بالمقارنة مع العديد من خطوط الخلايا خلد المتاحة، هذا النظام من المرجح أن تقدم أهمية تعزيز للبراوننج من الدهون البيضاء في الجسم الحي. <p class="jove_content" style=";text-align:r...

<html> السمنة هي زيادة في جميع أنحاء العالم بشكل كبير وتعتبر الآن واحدة من الاهتمامات الأكثر خطورة على الصحة العامة 1. ويرتبط هذا الشرط لmisbalance في استهلاك الطاقة النسبية للإنفاق والنتائج في تخزين الطاقة الزائدة كما الدهون في الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT). ويرتبط WAT الموسع مع زيادة كتلة الجسم والوزن، في حين بني الأنسجة الدهنية لديه القدرة على تبديد الطاقة الزائدة لإنتاج الحرارة. بالتالي يمكن BAT يعمل وحماية ضد كل من البرد والسمنة 2،3. ويتحقق ذلك عن طريق uncoupling من نقل الإلكترون في الميتوكوندريا من Uncoupling البروتين 1 (UCP1). ويعتبر هذا البروتين علامة مميزة لتوليد الحرارة بلارعدة في BAT 3. كشفت العديد من الدراسات في السنوات الأخيرة أن يكون البشر البالغين 4-8 و BAT وظيفية، وبالتالي التلاعب BAT في البشر يمكن أن يكون التدخل العلاجي المحتملة في المعركة ضد البدانة والأمراض المرتبطة بها. jove_content &quot;&gt; الأدلة الحالية تشير إلى أن نوعين من الخلايا الشحمية البنية موجودة في القوارض،&quot; الكلاسيكية &quot;أو&quot; الموجودة من قبل &quot;براون الدهون تطور خلال المرحلة السابقة للولادة وتشكل مستودعات مخصصة الدهنية في منطقة بين الكتفين البني والأنسجة الطرفية الأخرى من ناحية أخرى. ، وهو &quot;محرض&quot; شكل من أشكال الدهون البني (يسمى الخلايا برايت أو البيج) تطور خلال المرحلة ما بعد الولادة ويظهر يتخلل في الأنسجة الدهنية البيضاء. يتم فصل أيضا النوعين من الخلايا الشحمية من أصول بنى التنموية المختلفة. على الرغم من أن القائمة من قبل الخلايا الشحمية البنية تنشأ عن مثل myoblastsic Myf5 السلائف، ومحرض برايت / بيج الخلايا يتخلل في WAT تنشأ من النسب غير Myf5 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، المسارات التنظيمية لهذا النوع من الخلايا ومن المرجح أن يكون مختلفا عن بني Myf5 المشتقة يمكن الخلايا الشحمية 11. تفعيل وتطوير الخلايا بيج (أي &quot;براوننج&quot; من الدهون البيضاء) ردا على التعرض للبرد المزمن وإلىβ3-المستقبلات ناهضات منبهات أو PPARγ في البالغين 12-14. الخلايا بيج / برايت من المحتمل أن تكون هدفا واعدا العلاجية للتلاعب من ميزان الطاقة الإجمالي ويمكن أن تصبح جزءا من المحتمل علاج السمنة، وبالتالي، فإنه من المهم أن نفهم الآليات الجزيئية الدقيقة ومسارات الإشارات التي تتحكم في الإشارات البيئية تطوير البيج الخلايا. لفهم التحكم الجزيئي للبراوننج من الدهون البيضاء، في التجارب المختبرية هي الأنسب والتفريق بين preadipocytes يحدث بشكل غير متزامن وليس وأنه من الصعب للكشف عن خلايا في 15 الموقع. على الرغم من أن الدراسات على التنمية خلية شحمية وحتى الآن تم تنفيذ خطوط الخلايا في المقام الأول على مثل 3T3-L1، F442A-3T3 أو HIB1، وهذه خطوط الخلايا يبدو تفتقر إلى توقيع الجزيئي للخلايا البيج. من ناحية أخرى، معزولة عن الخلايا الشحمية الأساسية WAT تحت الجلد هي الأكثر احتمالا أن ألخص في بروسسليالي براوننج من الدهون البيضاء في الأزياء حكم ذاتي الخلية. هنا نقدم بروتوكول لعزل الفعال لجزء من انسجة والأوعية الدموية والأنسجة الدهنية لإحداث براوننج من الدهون البيضاء استجابة لمنبهات PPARγ. وقد تبين أن تكون روزيجليتازون وسيطا فعالا خاصة في إنضاج هذه الخلايا. كما اقترح سابقا 16، يمكن استخدام هذا النظام لخدمة الخلوية نظام موثوق الخلوية لدراسة تطوير خلايا بيج / برايت.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> Collaginase D </td><td> روش </td><td> 11088874103 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase II </td><td> روش </td><td> 04942078001 </td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM المتوسطة </td><td> الصياد </td><td> 10017-CV </td><td> مع الجلوكوز ز / لتر 2،5 &amp; L-الجلوتامين دون البيروفات الصوديوم </td></tr><tr><td> الأنسولين </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> T3 (3،3 &#39;،5-Triiodo-L-ثيرونين) </td><td> سيجما </td><td> T-2877 </td><td></td></tr><tr><td> اندوميثاسين </td><td> سيجما </td><td> I-7378 </td><td></td></tr><tr><td> ديكساميثازون </td><td> سيجما </td><td> D-1756 </td><td></td></tr><tr><td> IBMX </td><td> سيجما </td><td> I-5879 </td><td></td></tr><tr><td> روزيجليتازون </td><td> سيجما </td><td> R-2408 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> أطباق الكولاجين مطلية </td><td> BD </td><td> 354450 </td><td> لوحات 10 سم </td></tr><tr><td> 70 ميكرون فلتر </td><td> BD الصقر </td><td> 352350 </td><td> مصفاة الخلية، و 70 ميكرومتر النايلون 1/ea </td></tr></tbody></table>

isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells

الخلايا الشحمية البني لديها القدرة على فك الارتباط بين سلسلة الجهاز التنفسي في الميتوكوندريا وتبديد الطاقة الكيميائية في شكل حرارة. هو فعل شديدة تطوير UCP1 إيجابية الخلايا الشحمية براون في الأنسجة الدهنية البيضاء (ما يسمى الخلايا البيج أو برايت) من خلال مجموعة متنوعة من العظة البيئية مثل التعرض للبرد المزمن أو منبهات PPARγ، لذلك، وهذا نوع من الخلايا لديها امكانات كهدف العلاجية ل السمنة العلاج. ورغم أن معظم خطوط خلية شحمية خلد لا يمكن تلخيص عملية &quot;إنضاج&quot; من الدهون البيضاء في الثقافة والخلايا الشحمية الأساسية معزولة عن جزء الأوعية الدموية اللحمية في النسيج تحت الجلد الدهنية البيضاء (WAT) توفير نظام موثوق الخلوية لدراسة السيطرة الجزيئية لتطور الخلايا بيج / برايت . نحن هنا وصف بروتوكول للعزلة فعالة من preadipocytes الابتدائية ولإحداث تمايز الخلايا إلى البيج / برايت في الثقافة. ويمكن تقييم تأثير براوننج عن طريق التعبير عن علامة الدهون انتقائية البنيالمتطلبات البيئية مثل UCP1.

يمكن الوصول إلى إنضاج الخلايا الشحمية من الأساسي من خلال قياس التعبير مرنا من Ucp1 وغيرها من البني الجينات الدهون محددة أو انتقائية من قبل QRT-PCR. المقدمة في الشكل 1 هي بيانات التعبير الجيني في الخلايا الشحمية WAT المستمدة الأربية الأولية. وقد حثت الخلايا للت...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells at JoVE.com

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

يمكن أن تكون متباينة preadipocytes البيضاء الابتدائية معزولة عن الأنسجة الدهنية في الفئران البيضاء إلى خلايا بيج / برايت. قدم هنا هو نظام موثوق لدراسة نموذج الخلوية الجزيئية لتنظيم &quot;براوننج&quot; من الدهون البيضاء.

العزلة وتمايز الخلايا إلى خلايا الأوعية الدموية اللحمية بيج / برايت

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

isolation-differentiation-stromal-vascular-cells-to-beigebrite

Research

JoVE Journal

Biology

38.5K Views.  University of California, San Francisco. يمكن أن تكون متباينة preadipocytes البيضاء الابتدائية معزولة عن الأنسجة الدهنية في الفئران البيضاء إلى خلايا بيج / برايت. قدم هنا هو نظام موثوق لدراسة نموذج الخلوية الجزيئية لتنظيم "براوننج" من الدهون البيضاء.

Video: Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal stem cells, MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs). Both cell types are key players in maintaining the integrity of tissue and are probably also involved in regenerative processes and tumor formation.
To study their biology and function in a comparative manner it is important to have both cells types available from the same donor. It may also be beneficial for regenerative purposes to derive MSCs and ECFCs from the same tissue.
Because cellular therapeutics should eventually find their way from bench to bedside we established a new method to isolate and further expand progenitor cells without the use of animal protein. Pooled human platelet lysate (pHPL) replaced fetal bovine serum in all steps of our protocol to completely avoid contact of the cells to xenogeneic proteins.
This video demonstrates a methodology for the isolation and expansion of progenitor cells from one umbilical cord.
All materials and procedures will be described.

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

This protocol describes the isolation and subsequent expansion of mesenchymal stromal cells and endothelial colony forming cells without the use of animal serum to generate autologous pairs for experimental transplantation purposes.

العزلة والحيوان التوسع الحرة المصل الحبل السري الإنسان المستمدة الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCS) وغشائي خلايا مستعمرة السلف التشكيل (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

عزل CD146<sup&gt; +</sup&gt; خلايا المقيم الرئة الجذعية الوسيطة اللحمية من الجرذ الرئتين

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) provide a consistent ex vivo cellular system that are functionally like that of in vivo adipocytes. Use of ADSCs in biomedical research allows for cellular investigation of adipose tissue metabolic regulation and function. ADSC differentiation is necessary for adequate adipocyte expansion, and suboptimal differentiation is a major mechanism of adipose dysfunction. Understanding changes in ADSC differentiation is crucial to understanding the development of metabolic dysfunction and disease. The protocols described in this manuscript, when followed, will yield mature adipocytes that can be used for several in vitro functional tests to assess ADSC metabolic function, including but not limited to assays measuring glucose uptake, lipolysis, lipogenesis, and secretion. Rhesus macaques (Macaca mulatta) are physiologically, anatomically, and evolutionarily similar to humans and as such, their tissues and cells have been used extensively in biomedical research and for development of treatments. Here, we describe ADSC isolation using fresh subcutaneous and omental adipose tissue obtained from 4&#8211;9-year old rhesus macaques. Adipose tissue samples are enzymatically digested in collagenase followed by filtration and centrifugation to isolate ADSCs from the stromal vascular fraction. Isolated ADSCs are proliferated in stromal media followed by approximately 14&#8211;21 days of differentiation using a cocktail of 0.5 &#956;g/mL dexamethasone, 0.5 mM isobutyl methylxanthine, and 50 &#956;M indomethacin in stromal media. Mature adipocytes are observed at approximately 14 days of differentiation. In this manuscript, we describe protocols for ADSC isolation, proliferation, and differentiation in vitro. Although, we have focused on ADSCs from rhesus macaque adipose tissue, these protocols can be utilized for adipose tissue obtained from other animals with minimal adjustments.

In this article, we describe isolation of rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) using an enzymatic tissue digestion protocol. Next, we describe ADSC proliferation which includes cell detachment, counting and plating. Lastly, ADSC differentiation is described using specific adipogenic inducing agents. Additionally, we describe staining techniques to confirm differentiation.

عزل وتكاثر وتمايز الخلايا الجذعية المشتقة من المكاك الريسوس الدهنية

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

عزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية عالية الجودة للقياسات المتزامنة لتيار الكالسيوم2+ العابر وتيار الكالسيوم من النوع L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...