نشكر باخوس طنوس A.، دكتوراه، مدير تطوير وإنتاج النواقل في مركز العلوم العصبية من مستشفى ماساتشوستس العام، تشالزتاون، ماساتشوستس، لتزويدنا ناقلات rAAV-EGFP، والعضو الذكري جون للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل منحة R01 NS050408 (لJS) من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية.

تمت الموافقة على إجراء العمليات الجراحية التي وصفها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) من جامعة كولومبيا. 1. إعداد المعدات والفيروسات تعليق الجسيمات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف وتطهير المعدات وتعقيم الأدوات الجراحية وارتفاع درجة V التي سيتم استخدامها لإصلاح فقرة L1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب وماصات زجاجية شطبة. نستخدم ماصات التي يبلغ قطرها 40 ميكرون من طرف ومشطوف بزاوية 20 درجة. تعقيم ماصات زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإطار التجسيمي، تحميل حاقن محقنة مكروية على أن تتلاعب وتوصيل حاقن إلى وحدة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق واحدة من ماصات زجاجية إلى محقنة مكروية استخدام عدة المناسب الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المكبس من محقنة مكروية وملء المحاقن مع الزيوت المعدنية. ويمكن إضافة - ((2،5 ثنائي ميثيل-4-(2،5-dimethylphenylazo) phenylazo)-2-نفثول 1) إلى الزيوت المعدنية لزيادة الخامس من النفط O الأحمرisibility. معاودة الغطاس ودفعها إلى كل الطريق إلى الحافة. تجنب بعناية خلق فقاعة الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التعليق جسيمات الفيروس في خزانة السلامة الأحيائية. ذوبان الجليد الفيروس المجمدة على الجليد، وفقط قبل الاستخدام، مع تخفيف العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة إلى تركيز الجسيمات المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج محقنة مكروية في ماسك على حاقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 5 ميكرولتر من التعليق الفيروس على ورقة بلاستيكية صغيرة، على سبيل المثال Parafilm. خفض غيض ماصة الزجاج في انخفاض وسحب الغواص لملء محقنة مكروية. خلق فقاعة الهواء الصغيرة في الطرف ماصة لمنعه من انسداد. </li></ol> 2. الثقب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد منطقة الجراحة من قبل القضاء وسادة التدفئة مقاعد البدلاء مع مطهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس. نستخدم التخدير استنشاق isoflurane مع (3٪ خلال الاستقراء، -3٪ 2٪ خلال الصيانة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مواد التشحيم على كل عين لحماية العينين من الجفاف خلالالعملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الفراء من أسفل الظهر إلى الرقبة من الفأرة وتطهير الجلد بالتناوب مع مناديل من مطهر موضعي مثل الكلورهيكسيدين أو البوفيدون اليود والايثانول 70٪. عزل الموقع أعد جو معقم و مطهر مع ثنى الجراحية والتسلل الى موقع شق مع بوبيفاكايين (0.25٪، 1:10 المخفف مع المالحة الفسيولوجية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الجلد في نهاية الذيلية من القفص الصدري على طول خط الوسط (2-3 سم) وفصل اللفافة التي تغطي العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأن الحبل الشوكي يتوقف عن النمو في وقت سابق خلال التنمية ما بعد الولادة من العمود الفقري، العمود الفقري الجزء L4 تقع تحت الفقرة القطنية الأولى (L1). يقع فقرة L1 الذيلية للفقرة التي تحمل الزوج الأخير من أضلاعه. تحديد وفضح L1 فقرة عن طريق إزالة العضلات والأربطة في العمود الفقري الصغيرة الملحقة سطحه الظهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع قليلا وعقد L1 فقرة مع ملقط أدسون. استخدام ملقط الثقب مخصصة لإزالة العصب الظهرين من فقرة (العمود الفقري والصفيحة) وفضح الحبل الشوكي. تجنب إتلاف الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس على لوحة التسخين في إطار التجسيمي. رصد درجة حرارة الماوس أثناء العملية اللاحقة. </li></ol> 3. حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح فقرة L1 مع ارتفاع درجة V. يجب على المسامير تثبيت العمود الفقري بحيث لا ينتقل فقرة أثناء التنفس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل محقنة مكروية أقرب بحيث غيض ماصة فوق موقع الثقب. خفض المكبس حتى ترى التعليق الخروج من فيروس ماصة. إزالة قطيرة مع طرف القطن المعقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع رأس ماصة في جزء منقاري الأكثر من الحبل الشوكي المكشوفة. مركز ماصة أعلاه تلم الوسيط الخلفي، ثم نقل معلومات سرية 500 ميكرومتر أفقيا. تلميح لخفض السطح من الحبل وثقب الأم الجافية، أو إذا كنت تعمل مع ماصة الزجاج unbeveled، استخدم قنية الصلب مشطوف لثقب دأورا. خفض غيض من ماصة 300 ميكرومتر الزجاج في الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 1 ميكرولتر من التعليق الفيروس بمعدل من 200 NL / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الحقنة، انتظر على الأقل 2 دقيقة قبل التراجع ببطء ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 3،3 حتي 3،5 في الجزء الأكثر الذيلية من الحبل الشوكي يتعرض لتحقيق توزيع كامل للناقلات فيروسية في L4 الجزء الشوكي. توجد مواقع الحقن 2 منقاري والذيلية للجزء L4 لتجنب تلف الأنسجة في المنطقة المستهدفة. </li></ol> 4. اختتام الجرح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإفراج فقرة من L1 المشابك الدرجة V وإزالة الماوس من الإطار التجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة لفافة مع vicryl 5.0. فآسيا مغلق يوفر غطاء لموقع الثقب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجلد مع خيوط النايلون أو الدبابيس الجراحية. </li></ol> 5. بعد العملية الجراحية العناية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الماوس لقفص الانتعاش مع الفراش، لينة nonparticular. وضعه على رانه الجانب للتنفس مريح. رصد الحيوان حتى يتم تنبيه بشكل كامل، ويبدأ حركيا الشرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحن نقدم تسكين بعد الجراحة لمدة 72 ساعة يوميا مع حقنة تحت الجلد من كاربروفين (5.0 ملغ / كلغ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد الانتعاش بعد الجراحة عن طريق التفتيش يوميا لمدة 3 أيام الأولى، ثم مرة كل يومين أو 3 أيام في الأسبوع حتى اكتمال التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخيوط الجراحية أو المواد الغذائية الجلد 7 إلى 10 أيام بعد العملية، عندما التئام الجروح كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوان بعد الانتهاء من التجربة. </li></ol>

<ol>
	<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).</li><li>Couto, L. B., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector-mediated+RNA+interference.">Viral vector-mediated RNA interference.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li><li>Davidson, B. L., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system.">Viral vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).</li><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn.">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).</li><li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus.">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).</li><li>Lo, L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cre-dependent,+anterograde+transsynaptic+viral+tracer+for+mapping+output+pathways+of+genetically+marked+neurons.">A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons.</a> Neuron. 72, 938-950 (2011).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8, 745-752 (2011).</li><li>Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sensory+axon+regeneration+in+adult+spinal+cord.">Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord.</a> J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).</li><li>Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulation+of+intraspinal+plasticity+after+spinal+cord+injury+alters+the+severity+of+autonomic+dysreflexia.">Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia.</a> J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).</li><li>Lutz, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsymptomatic+restoration+of+SMN+rescues+the+disease+phenotype+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).</li><li>Chen, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dsAAV+type+2-mediated+gene+transfer+of+MORS196A-EGFP+into+spinal+cord+as+a+pain+management+paradigm.">dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).</li><li>South, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+deletion+of+the+NR1+subunit+of+the+NMDA+receptor+in+adult+spinal+cord+dorsal+horn+reduces+NMDA+currents+and+injury-induced+pain.">A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain.</a> J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).</li><li>Tappe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+scaffolding+protein+Homer1a+protects+against+chronic+inflammatory+pain.">Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain.</a> Nat. Med. 12, 677-681 (2006).</li><li>Colle, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+intracerebral+delivery+of+AAV5+vector+encoding+human+ARSA+in+non-human+primate.">Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate.</a> Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).</li><li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Transplantation+of+Mouse+Neural+Stem+Cells+into+the+Spinal+Cords+of+Mice+Infected+with+Neurotropic+Mouse+Hepatitis+Virus.">Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus.</a> J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).</li><li>Snyder, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+for+spinal+cord+and+motor+neuron+gene+delivery.">Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery.</a> Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).</li><li>Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+serotype+6+(rAAV2/6)-mediated+gene+transfer+to+nociceptive+neurons+through+different+routes+of+delivery.">Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery.</a> Mol. Pain. 5, 52 (2009).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian.</a> 8, 148-154 (1994).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

التجسيمي حقن الخلايا العصبية التي تستهدف ناقلات يسمح الحبل الشوكي لتطبيقات مثل رسم خرائط شبكة الخلايا العصبية على أساس الفيروس عبر التشابك نشر أو 6،7 optogenetic تشريح 8، التوجيه محور عصبي خلال التجديد من الاصابة 9،10، أو العلاج الجيني لمنع أو علاج تنكس عص...

التكنولوجيات المتقدمة من التلاعب الجيني الشرطية في الماوس تمكين نهج متعدد الأوجه لاستكشاف مسارات وظيفية واتصالات متشابك في الجهاز العصبي المركزي. يمكن تنظيمها من قبل جينات منقولة الصغيرة جزيء المستجيبات مثل الدوكسيسيكلين بناء على transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها، والتي يمكن أن تكون مصممة لتكون بمثابة المنشط أو قامع من النسخ الجيني، أو عقار تاموكسيفين الاعتراف تحور يجند ملزم المجال من مستقبلات هرمون الاستروجين 1 . ويتحقق عادة لا رجعة فيه تعديل التحوير من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) recombinases. لجنة المساواة العرقية (أسباب إعادة التركيب) وFLP (flippase إنزيم إعادة التركيب) حفز الختان، أو انعكاس إزفاء من شظايا الحمض النووي التي يحيط بها loxP (بؤرة X معبر أكثر، P1) أو FRT (flippase هدف الاعتراف) مواقع على التوالي 1. وتشمل التطبيقات تفعيل الجينات أو إسكات وحمض النووي الريبي محرض (RNA) تدخل <sup<html> &gt; 2. ويمكن استخدام تعبير شرطي من الصحفيين الفلورسنت أو الأنزيمية مثل غالاكتوزيداز β-الفوسفاتيز القلوية أو لتسمية الخلايا العصبية ودراسة منظمتهم الموضعية والاتصال 3. مشاريع الطفرات واسعة النطاق في أمريكا الشمالية ( <a href="http://www.norcomm.org/index.htm" target="_blank">http://www.norcomm.org/index.htm</a> ) وأوروبا ( <a href="http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm" target="_blank">http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm</a> ) على انتاج مكتبات الجنينية الماوس استنساخ الخلايا الجذعية مع أهداف الجينات المشروطة والفخاخ التي سوف تغطي في نهاية المطاف جينوم الفأر بأكمله. قد عبرت الفئران المولدة من هذه الحيوانات المستنسخة مع عدد من خطوط توسيع الماوس التي تعبر عن recombinases DNA تحت المروجين أو مواضع معينة للسكان خاصة من الخلايا العصبية للتلاعب الجيني انتقائية ( <a href="http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index.php" target="_blank">http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP</a> ). = &quot;jove_content&quot;&gt; ومع ذلك، قد تقيد التلاعب الجيني للسكان متميزة من الخلايا العصبية أو مناطق معينة ذات أهمية لا يمكن أن يتحقق عن طريق الوراثية وحدها التي تستهدف إذا لم يعلم أحد المروجين محددة للسكان الخلايا العصبية في المصالح أو لا عبرت عنها جميع الخلايا العصبية في المنطقة من الفائدة. في الحبل الشوكي، قد تتطلب تقييد التصاميم التجريبية المكاني للتلاعب الجيني إلى واحد أو جزأين رأسي ذنبي. حقن التجسيمي من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية أو FLP يسمح الحد إعادة التركيب الجيني لمناطق في الحبل الشوكي للفئران التي يتم يحيط شظايا الحمض النووي عن طريق loxP أو مواقع FRT، ما يسمى الأليلات floxed أو flrted. على عكس إعادة ترتيب DNA التأسيسي، الذي من شأنه أن يؤدي من التهجين للحيوانات مع الفئران معربا عن recombinase، فإن هذه الاستراتيجية توفر أيضا السيطرة الزمنية على تفعيل الجينات أو إسكات. floxed ناقلات فيروسية أو ترميز الجينات المحورة تعاملت تقديم خيار عكس التلاعب الجيني في الفئران التعبير عن corresponding المصب recombinase من المروج الخلايا العصبية الخاصة. ناقلات المؤتلف مع تقارب عدة لالخلايا العصبية متاحة 4. ويشيع استخدام ذات قدرة عالية (جبان) اتش، فيروس الغدة المرتبطة بها، وفيروس الهربس البسيط الفيروسة البطيئة ناقلات الموجهات العصبية. اختيار الفيروس مناسبة لسؤال البحث هو جزء حاسم من التصميم التجريبي. حجم التحوير، طرق التوصيل، خصوصية العدوى إلى الخلايا العصبية بدلا من الخلايا الدبقية، فعالية العدوى، والآثار الجانبية السامة والتهابات تحتاج إلى النظر فيها 4. نحن هنا وصف حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري في النخاع الشوكي، وهي تقنية التي نستخدمها لتنظيم الجينات الشرطية في أبحاثنا على بيولوجيا الأعصاب من الألم. القرن الظهري يتلقى مساهمات من الخلايا العصبية الحسية الجسدية وارد الأولية بما في ذلك الخلايا العصبية nociceptive. interneurons المحلية معالجة المعلومات قبل الخلايا العصبية الإسقاط من يجاريهاالقرن الظهري إلى الدماغ 5. علينا أن نبرهن إصابة الخلايا العصبية القرن الظهري في النخاع المستوى القطاعي L4 مع فيروس الغدة المرتبطة المؤتلف الموجهات العصبية (rAAV) التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء تعزيز (EGFP) تحت المروج الفيروس المضخم للخلايا النشطة جوهري.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم المادة </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td></td></tr><tr><td> قاعدة العمود الفقري لوحة </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> 912 </td><td></td></tr><tr><td> أداة صغيرة الحيوان التجسيمي </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> 900 </td><td></td></tr><tr><td> الماوس رئيس التخدير الغاز حامل </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> 923-B </td><td></td></tr><tr><td> يتصاعد قاعدة قابل للتعديل </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> 982 </td><td></td></tr><tr><td> V ارتفاع درجة </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> 987 </td><td></td></tr><tr><td> صغيرة التحكم في درجة الحرارة الحيوانية النظام </td><td> ديفيد KOPF الصكوك </td><td> TCAT-2LV </td><td></td></tr><tr><td> أدسون ملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11006-12 </td><td></td></tr><tr><td> الثقب ملقط </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11223-20 </td><td></td></tr><tr><td> UltraMicroPump (واحد) مع SYS-Micro4 المراقب </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> UMP3-1 </td><td></td></tr><tr><td> محقنة مكروية، 65RN </td><td> هاميلتون </td><td> 7633-01 </td><td></td></tr><tr><td> RN ضغط المناسب، 1 ملم </td><td> هاميلتون </td><td> 55750-01 </td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج الشعيرات الدموية </td><td> أدوات الدقة العالم </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Microgrinder </td><td> Narishige </td><td> EG-44 </td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord

حقن Intraparenchymal من ناقلات فيروسية يمكن التلاعب الجيني في المشروطة السكان متميزة من الخلايا العصبية أو مناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي. ونحن يبرهن على وجود تقنية الحقن التجسيمي الذي يسمح استهدفت التعبير الجيني أو إسكات في القرن الظهري في النخاع الشوكي الماوس. الإجراء الجراحي هو وجيزة. أنه يتطلب استئصال الصفيحة الفقرية لفقرة واحدة، تنص على الانتعاش السريع للحيوان والحركة دون عوائق من العمود الفقري. حقن تسيطر عليها وحدة تخزين صغيرة ناقلات التعليق على سرعة منخفضة واستخدام محقنة مكروية مع قنية الزجاج مشطوف تقليل الآفة الأنسجة. الاستجابة المناعية المحلية لمكافحة ناقلات يعتمد على الخصائص الذاتية للفيروس المستخدمة؛ في تجربتنا، فمن قاصر وقصير الأجل عند استخدام المؤتلف الفيروس المرتبط بالفيروس الغدي. A الجين مراسل مثل البروتين المعززة الفلورية الخضراء يسهل توزيع الرصد المكاني للناقلات، وفعالية وSPECI الخلويةficity من ترنسفكأيشن.

غلة ترنسفكأيشن ناجحة قوية التعبير الجيني في الخلايا العصبية من القرن الظهري للحقن (الشكل 1)، يجنب القرن الظهري من الجانب المقابل، والقرن البطني والعقد الجذرية الظهرية. <img src="/files/ftp_upload/50313/50313fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشك?...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord at JoVE.com

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

ناقلات فيروسية تسمح للتلاعب الجيني المستهدفة. ونحن يبرهن على وجود طريقة للتعبير الجين المشروط أو الاجتثاث في الحبل الشوكي الماوس، وذلك باستخدام حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري، وهو موقع بارز للاتصال متشابك بين الحسية الجسدية الأولية afferents والخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

stereotaxic-injection-viral-vector-for-conditional-gene-manipulation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

30.1K Views.  Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). ناقلات فيروسية تسمح للتلاعب الجيني المستهدفة. ونحن يبرهن على وجود طريقة للتعبير الجين المشروط أو الاجتثاث في الحبل الشوكي الماوس، وذلك باستخدام حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري، وهو موقع بارز للاتصال متشابك بين الحسية الجسدية الأولية afferents والخل...

Video: Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

الحبل الشوكي الكهربية ثانيا : خارج الخلية التصنيع الكهربائي شفط

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

إجراء لغرس الدائرة العمود الفقري للالطولية<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من الحبل الشوكي ماوس

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

الحقن المباشر لناقل لينتيفيرال يسلط الضوء على عدة مسارات الحركية في الحبل الشوكي الفئران

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...