هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا تمنح MOST104-2311-B-010-010-MY3، MOST106-2321-ب-010-012، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية في منح المؤسسات الوطنية-EX106-10429NI، ومنحة "البرنامج مركز بحوث المناطق" الموصى بها من وزارة التربية من خلال مركز أبحاث الدماغ، جامعة يانغ مينغ الوطنية في تايوان، ، ومنح "زمالات ما بعد الدكتوراه" MOST106-2811-ب-010-031 (س-أ)، MOST105-2811-ب-010-036 و MOST106-2811-ب-010-030 (حاء-مجموعة).

عليها البروتوكولات الحيوانية الموضحة هنا بالعناية بالحيوان ولجان جامعة يانغ مينغ الوطنية استخدام.
1. إعداد الحامل للمواليد الجراء في الجهاز ستيريوتاكسيك
<ol><li>جعل علبة الرأس: قص الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل (طويلة 15 ملم) في الشكل الذي يناسب رأس الجراء الأطفال حديثي الولادة عن طريق إزالة 1/5 لجدار الأنبوبة.</li>
	<li>أن مربع تلميح ماصة مع الحجم الصحيح الذي يناسب مع قاعدة التمثال لجهاز ستيريوتاكسيك، وإزالة الغطاء العلوي. إلصاق درج الرأس بإعدادها في الخطوة 1، 1 ونسيج كاسيت تضمين على القاعدة علبة تلميح بمادة لاصقة ساخنة-ذوبان. ارتفاع كاسيت تضمين الأنسجة هو 7 مم، الذي يستخدم لدعم ألجرو في الرقبة والجسم في موقف ثابت الرأس.</li>
	<li>ضع الإعداد كلها في جهاز ستيريوتاكسيك قياسية.</li>
</ol>2-إعداد 30 جرام الحقن بالإبر الفولاذ المقاوم للصدأ
<ol><li>قبل تنظيف 30 إبر المحاقن ز التي نقع عليها في كلوروفورم لمدة 3 أيام.</li>
	<li>استخدام الملقط بعناية وبطء سحب الإبرة من مركزها البوليبروبيلين في غطاء كيميائية.</li>
	<li>أغسل الإبر مع الإيثانول المطلقة لمدة 20 دقيقة تليها يشطف الإيثانول 70% ل 3 × 10 دقيقة على شاكر 50 لفة في الدقيقة. واسمحوا الهواء الإبر الجافة، وتخزين الإبر تنظيفها في مربع نظيف في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى الاستخدام.</li>
</ol>3-إعداد محول لأنابيب Microinjection
<ol><li>قم بتوصيل المحاقن ميكروليتير إبرة حقن 30 جرام مع أنبوب البولي إثيلين PE10 (أنبوب PE10). إعداد محول أنابيب (أنابيب PE20) البولي إثيلين PE20 لسد إبرة الحقن والمحاقن ميكروليتير. استخدام المحول ضروري، لأن قطر الأنبوب PE10 أصغر بكثير من أن الإبرة للمحاقن ميكروليتير ز 26.</li>
	<li>إعداد الأنابيب للمحاقن ميكروليتير: الاتصال إبرة حقن 30 جرام تنظيفها مسبقاً مع 5 سم أنبوب PE20، وختم التقاطع مع الغراء الفورية. هذا محول الأنابيب قابلة لإعادة الاستخدام. ملاحظة: إذا كانت الإبرة لحقنه microinjection ز 30، إعداد (الخطوة 3.1) واستخدام هذا المحول (الخطوة 3، 3) ليس من الضروري.</li>
	<li>قم بتوصيل مهايئ الأنابيب (أعد الخطوة 3.1) مع حقنه ميكروليتير (10 ميليلتر).</li>
	<li>قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب PE10 (لا تزيد عن 60 سم) على الإبرة 30 جرام من محول أنابيب PE20. جبل إبرة حقن ز 30 جديدة على الطرف الآخر من أنبوب PE10.</li>
</ol>4-تحميل أنبوب Microinjection مع يعقم الماء المقطر وصبغ والفيروسات
<ol><li>إزالة المكبس المحاقن ميكروليتير. استخدام المحاقن ز 25 لتحميل المحاقن ميكروليتير ولها أنبوب PE متصلة مع يعقم الماء المقطر لإزالة الهواء من الأنبوب.</li>
	<li>وضع المكبس مرة أخرى إلى المحاقن ميكروليتير، ودفع المكبس حتى 2 ميليلتر من بقايا الماء المقطر في البرميل. لا تدع حجم الماء المقطر أصبح أقل من 2 ميليلتر.</li>
	<li>جبل بعناية المحاقن ميكروليتير على ضخ حقنه معدل التدفق الجزئي.</li>
	<li>"الماصة؛" كميات صغيرة من صبغة 0.1% الأخضر سريع (أعد في المحلول الملحي 0.9% وتصفيتها مع 0.22 ميكرومتر التصفية) والسوائل الفيروس بقطعة من بارافيلم.</li>
	<li>سحب كمية صغيرة من الهواء لجعل فقاعة هواء مرئية على مفترق الطرق بين 30 جرام حقن إبرة وأنبوب PE10 متبوعاً بتحميل ميليلتر 0.7 الخضراء السريعة التي تمت تصفيتها في الأنبوب اختبار تدفق السوائل في الأنابيب microinjection.</li>
	<li>سحب آخر كمية صغيرة من الهواء لجعل فقاعة هواء ثاني متبوعاً بتحميل الفيروسات السوائل في الأنابيب microinjection.</li>
	<li>إرفاق وتأمين إبرة microinjection ز 30 في الذراع لجهاز ستيريوتاكسيك.</li>
</ol>5-تخدير فئران حديثي الولادة بانخفاض درجة حرارة الجسم
<ol><li>ألجرو في الأكمام قفاز مطاط وتزج أنه في الثلج المجروش حتى الرقبة لمدة 5 دقائق.</li>
	<li>قرصه القدمين ألجرو مع الملقط للتأكد من استجابة انسحاب لا من قدميه.</li>
	<li>وضع ألجرو الأكمام قفاز مطاط في علبة الرأس ووضع بعض الثلج المجروش حول الأكمام مطاط للحفاظ على البارد للتخدير انخفاض درجة حرارة الجسم.</li>
	<li>تطبيق مرهم البيطرية في عيون ألجرو لمنع جفاف بينما تحت التخدير إذا كان ذلك ممكناً.</li>
</ol>6-microinjection
<ol><li>إعداد عملية جراحية معقمة بمحو الصك ستيريوتاكسيك تماما مع الإيثانول 70%. تعقيم الأدوات الجراحية بغمر لهم في الإيثانول 70%.</li>
	<li>فرك رأسه ألجرو مع الإيثانول 70%. تحديد موقع لامدا معلما في الجمجمة وعلامة لامدا بقلم ماركر. تهدف نصيحة إبرة إلى لامدا، وتعيين الأمامي الخلفي (AP) واحداثيات الآنسي الجانبي (ML) كصفر.</li>
	<li>تحريك ذراع الحقن إلى الموقع المستهدف وفقا لإحداثيات س وص للموقع المستهدف. للمخطط يوم بعد الولادة (ف) 2 الجراء، الإحداثيات: وكالة اسوشييتد برس، مم +2.4 لياقته لامدا؛ مل، تيار الأفقي مم من خط الوسط؛ الظهري-البطني (DV)، مم و− من الجمجمة. وضع علامة على موضع الصبغة الخضراء سريعة في أنبوب PE10 بقلم.</li>
	<li>إسقاط إبرة حقن 30 غ ببطء لاختراق عن طريق الجلد والجمجمة ومن ثم إحضار تلميح إبرة حتى يتوقف على سطح الجمجمة. تعيين تنسيق DV كصفر.</li>
	<li>إسقاط إبرة حقن 30 غ ببطء حتى تصل إلى تنسيق DV من الموقع المستهدف. الانتظار لمدة 1 دقيقة للسماح حمة استئناف شكل عادي. قم بتشغيل برنامج microinjection (100 nL/دقيقة).</li>
	<li>تأكد من أن علامة الصبغة الخضراء سريعة تتحرك في أنبوب PE لضمان يتم حقن السائل فيروس في المخ.</li>
	<li>انتظر 1 دقيقة بعد انتهاء microinjection، وثم ببطء وتدريجيا إحضار الإبرة للارتفاع 1/2 من عمق العنف المنزلي خلال 30 ثانية. وبعد 30 ثانية، سحب الإبرة ببطء من الرأس ألجرو.</li>
	<li>كرر الخطوة 6، 2 إلى 6.7 حتى يتم إكمال ميكروينجيكشنز من جميع المواقع المستهدفة.</li>
</ol>7-بعد الجراحة استرداد ألجرو
<ol><li>الاحماء ألجرو لمدة 20 دقيقة في حاضنة 33 درجة مئوية. تحقق من استرداد ألجرو من انخفاض حرارة الجسم التخدير كل 5 دقائق حتى ألجرو قد استعاد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.</li>
	<li>العودة ألجرو إلى السد بعد ألجرو هو تعافي تماما.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models.">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).</li><li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+for+neuroscientists.">DREADDs for neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li><li>Knopfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+optical+indicators+for+the+analysis+of+neuronal+circuits.">Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).</li><li>Tau, G. Z., Peterson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+development+of+brain+circuits.">Normal development of brain circuits.</a> Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).</li><li>Mitchell, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+neurodevelopmental+disease.">The genetics of neurodevelopmental disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).</li><li>Sahin, M., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+circuits,+and+precision+therapies+for+autism+and+related+neurodevelopmental+disorders.">Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders.</a> Science. 350 (6263), (2015).</li><li>Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+microinjection+of+viral+vectors+expressing+Cre+recombinase+to+study+the+role+of+target+genes+in+cocaine+conditioned+place+preference.">Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference.</a> J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).</li><li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice:+a+neurosurgical+point+of+view.">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).</li><li>Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microinjection+technique+for+targeting+regions+of+embryonic+and+neonatal+mouse+brain+in+vivo.">A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo.</a> Brain Res. 1307, 43-52 (2010).</li><li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+controls+synaptic+wiring+of+corticostriatal+circuits+and+vocal+communication+by+opposing+Mef2c.">Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c.</a> Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).</li><li>Gerfen, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neostriatal+mosaic:+multiple+levels+of+compartmental+organization+in+the+basal+ganglia.">The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia.</a> Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).</li><li>Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+regional+viral+injection+in+neonatal+mice+enables+structural+and+functional+interrogation+of+defined+neuronal+populations+throughout+targeted+brain+areas.">Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas.</a> Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في الدراسة الحالية، ونظهر أسلوب ستيريوتاكسيك بسيطة وموثوق بها لحقن الفيروسات إف في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. ونحن ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل الفئران في P2 وثم تحليل تعبير الجينات مراسل في P14. ووجدنا إف ترانسدوسيد الخلايا الح...

الدراسات الحديثة لهيكل ووظيفة المخ عادة ما تتطلب التحوير الوراثي لجينات معينة في الخلايا العصبية. وقد تم إنشاؤها للتحقيق في وظائف جينات مختلفة، الفئران المحورة وراثيا تحمل الآليلات متحولة، بما في ذلك بشكل روتيني خروج المغلوب والمغلوب في الآليلات. جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار أسلوب قياسي لتسليم المخدرات وتتبع وفيروسات أخرى الكواشف محلياً إلى مناطق معينة من أدمغة القوارض1،2. تطبيق جراحة الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المحورة وراثيا يسمح أحد للتلاعب وراثيا بوظيفة الجينات ونشاط الخلايا العصبية في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في الدماغ الماوس. التلاعب الخلية بنوع خاص يوفر نهج قوية فك الوظائف العصبية في مجمع الدوائر العصبية من المخ3،،من45.
تبدأ التنمية العصبية للجهاز العصبي في المراحل الجنينية المبكرة، والعمليات الإنمائية التي تستمر بعد الولادة حتى فترة الأحداث. ويشمل نضج الجهاز العصبي بعد الولادة الأسلاك متشابك دقيقة من الدوائر العصبية، هو أمر ضروري للوظائف الفسيولوجية والإدراكية ل الدماغ6. ولذلك، دراسة الأحداث التنموية التي تحدث في windows وقت حديثي الولادة مهم ليس فقط لفهم التنمية العصبية الطبيعية، ولكن كما يجوز تقديم رؤى في الآلية المرضية للنماء العصبي والاضطرابات العصبية7 ،8. على الرغم من أن أساليب جراحة المخ ستيريوتاكسيك للقوارض الكبار متاحة2،9، البروتوكولات القليلة المتاحة على شبكة الإنترنت لعملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الفئران حديثي الولادة10،11. في الواقع، ميكروينجيكشنز ستيريوتاكسيك من الكواشف في أدمغة الفأر المواليد الجراء صعبة، لأن رأس ألجرو الولدان هشة جداً لتكون ثابتة في الجهاز ستيريوتاكسيك القياسية. على الرغم من ذلك، يتم تطبيق عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك على الفئران المعدلة وراثيا ممكنة للفئران حديثي الولادة12. وهنا يصف لنا طريقة بسيطة مع إعداد محلية صنع لإجراء عملية جراحية في الدماغ ستيريوتاكسيك في الجراء الماوس حديثي الولادة. علينا أن نظهر أن هذا الأسلوب يسمح أحد لحذف الجينات فلوكسيد مشروط ميكروينجيكتينج ريكومبيناسي إف-الإعراب عن "الحمض النووي لجنة المساواة العرقية" في المخطط لمراسل جينات الفئران والفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد إفراجاً مشروطاً. هذا الأسلوب ينطبق أيضا على تسليم المواد الكاشفة في المخطط الولدان من الفئران البرية من نوع.

<table><tbody><tr><td>30G PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton MICROLITER Syringe</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>80300</td><td>30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Micro Flow Rate Syringe Pump</td><td>Longer Precision Pump Co.</td><td>TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td><td></td></tr><tr><td>25G syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Standard Stereotaxic Instruments</td><td>RWD Life Science</td><td>68037</td><td>Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td></tr><tr><td>Anti-FOXP2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000</td></tr><tr><td>BX63 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lot # CS0987, 5.506x10&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td><td>N/A</td><td>1x10&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt; (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>The Jackson Labtorary&amp;nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>The Jackson Labtorary&amp;nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2&lt;sup&gt;fl/fl&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline</td><td>Corning&amp;nbsp;cellgro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

يتم التعبير عن العديد من الجينات في أدمغة الأجنة، وبعضهم يعبر عن استمرار في الدماغ بعد الولادة. لهذه الجينات، وأعرب عن إصرار أنها قد تعمل لتنظيم عملية التنمية و/أو الوظيفة الفسيولوجية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة. للتحقيق في الوظائف العصبية الحيوية من جينات محددة في الدماغ، من الضروري إلغاء تنشيط الجينات في الدماغ. هنا، نحن تصف طريقة ستيريوتاكسيك بسيطة لإلغاء تنشيط التعبير الجيني في المخطط الفئران المحورة وراثيا في إطارات زمنية الولدان. كانت ميكروينجيكتيد الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في المخطط Ai14 مراسل جينات الفئران في يوم بعد الولادة (ف) 2 بجراحه الدماغ ستيريوتاكسيك. تم الكشف عن الجينات مراسل تدتوماتو في المخطط P14، مما يوحي نجاح لجنة المساواة العرقية-لوكسب يتوسط جزئ الحمض النووي في الخلايا سترياتال ترانسدوسيد إف. كذلك نحن التحقق من صحة هذا الأسلوب من ميكروينجيكتينج الفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية في الفئران P2Foxp2fl/فلوريدا . وسم مزدوجة للتجارة والنقل و Foxp2 أظهرت أن الخلايا إيجابية بروتينات فلورية خضراء تفتقر إلى إيمونوريكتيفيتي Foxp2 في المخطط P9، مما يوحي بفقدان البروتين Foxp2 في لجنة المساواة العرقية اجفب إف ترانسدوسيد سترياتال الخلايا. مجتمعة، هذه النتائج تبرهن حذف وراثية فعالة بالفيروسات إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية ستيريوتاكسيكالي ميكروينجيكتيد في فئات معينة من السكان الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة من الفئران المعدلة وراثيا فلوكسيد. وفي الختام، لدينا تقنية ستيريوتاكسيك يوفر منبرا سهلة وبسيطة للتلاعب بالجينات في أدمغة الفأر حديثي الولادة. هذا الأسلوب لا يمكن استخدامها فقط لحذف الجينات في مناطق معينة من أدمغة الأطفال حديثي الولادة، ولكن أيضا يمكن استخدامه لحقن العقاقير الدوائية، تتبع الخلايا العصبية، أوبتوجينيتيكس المعدلة وراثيا والبروتينات تشيموجينيتيكس، مؤشرات نشاط الخلايا العصبية و الكواشف الأخرى في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة.

للمجموعة الأولى من التجربة، ونحن ميكروينجيكتيد 200 nL فيروسات AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (إف-اجفب-لجنة المساواة العرقية، 1/10 إضعاف في الفوسفات مخزنة المالحة دولبيكو) التي تعبر عن ريكومبيناسي الحمض النووي Cre تنصهر مع التجارة والنقل في المخطط P2 من الفئران Ai14. الفئران Ai14 إكسبريس تدتو...

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains at JoVE.com

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Views.  National Yang-Ming University. يصف لنا على بروتوكول لجراحة ستيريوتاكسيك مع جهاز ثابت رئيس محلية صنع الكاشفات ميكروينجيكتينج في المخطط للعقول الماوس الأطفال حديثي الولادة. هذا الأسلوب يتيح التلاعب بالجينات في الخلايا العصبية في مناطق معينة من أدمغة الفأر حديثي الولادة.

Video: Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Developmental Biology

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

التجسيمي جراحة الآفات Excitotoxic من مناطق محددة في الدماغ في الجرذ الكبار

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

توسيع الجنينية والكبار الخلايا الجذعية العصبية من قبل<em&gt; في الرحم</em&gt; الصعق الكهربائي أو حقن التجسيمي الفيروسية

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

التلاعب الجيني من الفأرة النامية من خلال المهاد<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

حقن الفيروسي Intracerebroventricular من حديثي الولادة ماوس الدماغ للاستمرار وانتشار تنبيغ العصبية

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-، Hippocampus-، Thalamus-، Hypothalamus-، الجانبي الحاجزي Nucleus- والمخطط محددة<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation للفي C57BL / 6 الماوس

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

نهج مجسم زاوية قابلة للتكيف لتقنيات علم الأعصاب تنوعا

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

Rodent Stereotaxic Surgery

Stereotaxic (or stereotactic) surgery is a method used to manipulate the brain of living animals. This technique allows researchers to accurately target deep structures within the brain through the use of a stereotaxic atlas, which provides the 3D coordinates of each area with respect to anatomical landmarks on the skull. After the skull is exposed, anesthetized animals are mounted on a specialized instrument known as a stereotaxic frame, which enables the precise placement of experimental tools at the defined coordinates. Stereotaxic surgery is a versatile approach that can be used to generate lesions, manipulate gene expression, or deliver experimental agents to the brain.This video-article provides a general overview of the principles behind stereotaxic surgery, including instructions for using a stereotaxic atlas and the stereotaxic frame, and an introduction to reading the Vernier scale for measurement of probe movements. The subsequent discussion outlines the steps required to perform the surgical procedure. Lastly, a broad range of technical applications are presented, such as the insertion of electrical probes to measure brain activity and genetic manipulation of brain tissue.

Stereotaxic (or stereotactic) surgery is a method used to manipulate the brain of living animals. This technique allows researchers to accurately target ...

جراحة ستيريوتاكسيك للتلاعب بالجينات في خلايا أدمغة الفأر الولدان سترياتال

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video