كان مدعوما هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS / MBRS (جرانت 58268)، المعاهد الوطنية للصحة / NCRR / RCMI (جرانت G12-RR03034)، جورجيا بحوث التحالف التمويل في شكل منح GRA.VAC08.W، المعاهد الوطنية للصحة / NIAID / NRSA منحة F31AI091484، [إموري] CFAR منحة P30 A1050409. وقد أجريت هذا التحقيق في مركز أو قاعة للالتي شيدت مع الدعم من مرافق لبحوث التحسين جرانت # C06 RR18386 من المعاهد الوطنية للصحة / NCRR. الخلايا Jurkat، فإن مجموعة من 20 فيروس نقص المناعة البشرية-1 الببتيدات نيف، فضلا عن تم الحصول على أرنب المضادة-فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف مصل ضدي من المعاهد الوطنية للصحة الإيدز بحوث &amp; برنامج الكاشف المرجعي، (روكفيل، MD).

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

فهم الآليات الكامنة وراء قدرة نيف للتلاعب سوف مسار الاتجار exosomal تكون مفيدة في الهندسة مثبطات رواية من exNef إفراز. وينبغي أن تثبيط من exNef إفراز يقلل من CD4 نضوب T-الخليوي وكالة المخابرات المركزية الامريكية أن الآلية المرضية محرك الأقراص فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز....

مع ظهور العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، وقد تباطأ وباء الإيدز في العالم الغربي، ولكن ليس تقليصها، ويستمر انتشار فيروس نقص المناعة البشرية إلى أن تكون عبئا صحيا كبيرا في جميع أنحاء العالم. مع استثناء من فعالية هامشية RV144 التايلاندية محاكمة، وقد أظهرت حتى الآن لقاحات فيروس نقص المناعة البشرية فشل للحماية من العدوى. وهكذا، والبحث في مزيد من الأهداف، والإمكانات العلاجية لا تزال يبرره. جنبا إلى جنب مع نضوب CD4 T-الخلية، وتنشيط المناعة المعمم الثابتة هو السمة المميزة لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية. هذا التنشيط المناعي المزمن (سي آي ايه) يؤدي إلى زيادة في حجم الخلية، مجموعات سكانية فرعية لمفاوي تنشيط ومتباينة، واستنفاد الخلوية والشيخوخة، وقتل الخلايا T والخلايا B عن طريق تنشيط الناتج عن موت الخلية (AICD) 1،2،3، و راسخة بأنها واحدة من أقوى المؤشرات على تطور المرض 4،5،6،7،8،9،10،11،12. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء CIA وCD4تبقى خلايا T نضوب في عدوى فيروس نقص المناعة البشرية إلى توضيح بشكل كامل. الأدلة من مختبرنا وغيرها أدت بنا إلى نموذج لتطور المرض (الشكل 1) حيث البروتين نيف فيروس نقص المناعة البشرية (عامل تنظيم سلبي) يحرض إفراز في exosomes من HIV-1 الخلايا المصابة 13،14. هذه exosomes المحتوية نيف-(exNef) لحث على موت الخلايا المبرمج في عدد من الأنساب الخلية بما في ذلك CD4 المعافين خلايا تي 15،16. بدلا من ذلك، في حيدات / الضامة exNef يغير أنماط التعبير الجيني، على سبيل المثال التعبير خلوى، ويبدو أن إحداث حالة من التنشيط المناعي غير المجدولة. هذه الهيئة من الأدلة تشير إلى دور مهم لexNef في وكالة المخابرات المركزية ونضوب CD4 T-الخلية. فهم الآليات الكامنة وراء قدرة نيف للتلاعب سوف مسار الاتجار exosomal تكون مفيدة في الهندسة مثبطات رواية من exNef إفراز. وينبغي تثبيط إفراز exNef يقلل من استنزاف CD4 T-الخليةوكالة المخابرات المركزية أن المرضية حملة فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز. لجمع الأدلة التي أدت إلى نموذجنا لفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز تطور المرض والبيانات اللاحقة التي بنيت على هذا النموذج، ونحن وضعت عددا من الكواشف رواية والمنهجيات التي سمحت لنا لتحليل الجينات من exNef إفراز، والبدء في تحديد البروتينات الخلوية المعنية. في العمل الأولي، وجدنا أن البروتين نيف يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا المارة ويتم تحريرها خارج الخلية من الخلايا نيف-transfected والمصابين بفيروس الإيدز 15. قد الببتيدات المشتقة من (الخلية اللحمية المستمدة عامل-1، مع بديل ألفا الربط) SDF-1α ثبت سابقا أن تحتفظ بالكثير من النشاط ملزمة ويشير للجزيء كامل طول 17. نحن تكهن بأن الببتيدات من نيف قد يحمل في طياته بعض النشاط أفكارك من البروتين الكامل، والتي من شأنها أن تحتوي هذه الببتيدات بالضرورة المجال أفكارك نيف (ق). لتحديد هذه الببتيدات، وبالتالي نيفمجال أفكارك (ق)، وحصل على مجموعة من 20 HIV-1 نيف الببتيدات المسح الضوئي من المعاهد الوطنية للصحة أبحاث الإيدز وبرنامج الكاشف المرجعي. هذه الببتيدات 20-AA، تتم تسمية كل متداخلة 10 الأحماض الأمينية من جارتها، من قبل عدد من مشاركة حمض أميني بهم، أي N20 يمتد نيف الأحماض الأمينية 1-20، N30 يمتد الأحماض الأمينية نيف 11-30، الخ 16. وجدنا أن تعريض خلايا تي خارج الخلية إلى الببتيدات محددة تداخل المجالات اثنين 10-AA متميزة في بروتين نيف كامل طول يسببها موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا. كشف تحليل لاحقة من هذه الببتيدات أفكارك نيف المستمدة من قدرتها على التفاعل الجسدي مع مستقبلات chemokine CXCR4 على سطح الخلايا التائية، مع حركية الملزمة التي سمحت هذه الببتيدات لمنع تنافسية ملزمة بين CXCR4 ويجند الطبيعية SDF-1α. وأخيرا، تم العثور على التفاعل الببتيدات أفكارك نيف المشتقة &#39;مع CXCR4 للحث على الاستجابة للضغط النفسي في هذه الخلايا T-مما أدى إلى موت الخلايا المبرمج. هذه الأدلة سمح لنا QUICالمجالات الوظيفية KLY خريطة نيف و؛ وهي عملية قد استغرقت وقتا أطول بكثير باستخدام تقنيات الحمض النووي للطفرات قياسية مثل ألانين الطفرات المسح. كما أوضحت أيضا أن هذه الببتيدات نيف المستمدة قصيرة الاحتفاظ الوظيفة البيولوجية من المجالات أفكارك في بروتين كامل طول. وبعد تحديد دور للنيف خارج الخلية، أي موت الخلايا المبرمج للخلايا تي، سعينا إلى فهم أفضل للكيفية التي كان يفرزها نيف من الخلايا. باستخدام سلسلة من بنيات نيف تحور، ونحن تعيين حفظها للغاية الزخارف بروتين نيف في المناطق N-محطة من فيروس نقص المناعة البشرية على حد سواء نيف، ولها المكاك ريسوس يعادل SIV ماك (قردي فيروس نقص المناعة) نيف، التي تعتبر بالغة الأهمية لexNef إفراز 13. كان، انتقد بشكل خاص، كبديل ألانين من أي من الأحماض الأمينية الخمس إما تقلص إلى حد كبير أو إلغاء إفراز exNef؛ واحدة من هذه الزخارف، وإفراز تعديل المنطقة (66VGFPV70 SMR). عندما سلمت إلى الخلايا عن طريق C الحافز النشطتم العثور على بروتين hariot الكاشف التسليم، الببتيد يحتوي على SMR تعلق على تسلسل الببتيد FLAG (SMRwt) لتثبيط إفراز exNef من كلا نيف-transfected والخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية 18. وبناء على تجربتنا السابقة مع الببتيدات، قررنا استخدام هذا الببتيد لإلقاء الضوء على الجزيئات والآليات الكامنة وراء دور نيف SMR في exNef إفراز. باستخدام الببتيد SMRwt كما لدينا &quot;البروتين الطعم&quot;، اشتركنا في immunoprecipitated شركاء ملزم الخلوية من SMR من المعافين لست] خلية T-18. قدمت تسلسل الببتيد FLAG مقبض مريحة لالتقاط الببتيد SMRwt باستخدام راتنج تقارب المضادة للFLAG. لدينا الحقائق السابقة أن حمض أميني أساسي واحد لألانين طفرة في الببتيد SMRwt كان كافيا لإلغاء تثبيط لها من exNef إفراز تحديد مريحة، الببتيد سيطرة محددة للغاية (SMRmut) التي استخدمناها لاستبعاد البروتينات المشترك immunoprecipitated يست محددة لSMR. باستخدام الببتيد مع لياليمجال pecific من الفائدة بدلا من بروتين كامل طول سمح لنا لتجاوز فحص العشرات من العوامل الخلوية التي تربط إلى المجالات الأخرى في نيف 19. مرة واحدة حددنا شركاء SMR ملزم، كان الخطوة المنطقية التالية لاظهار أن الشركاء ملزم الخلوية التي تم تحديدها هي مهمة لوظيفة البيولوجية 18. الإجراء العادي لتحقيق ذلك هو أن مستويات البروتين ضربة قاضية باستخدام الهدف ميرنا البروتين محددة أو سيرنا، وبعد ذلك فحص تأثير على الوظيفة البيولوجية. أجرينا ضربة قاضية ميرنا، الذي يثبط ترجمة لمرنا الهدف، والحد من إنتاج هذا الهدف، في هذه الحالة بروتين SMR ملزم. هذا التخفيض من البروتين الهدف هو أثر غير مباشر، وربما له تأثير تأخر عن وظيفة بيولوجية البروتين المستهدفة تلعب دورا فيها وبناء على ذلك، قمنا بتوظيف أيضا أقل شيوعا الضد تقنية تثبيط لتحديد ما إذا تعطيل مباشرة النشاط منالبروتين الهدف يقلل أو يلغي الوظيفة البيولوجية. في هذا الإجراء، رفع أجسام مضادة ضد بروتين المستهدفة و transfected في الخلية باستخدام عربة الكاشف، والتفاعل بشكل مباشر مع البروتين الهدف إما أنه عزل من موقعه من وظيفة، أو عرقلة المجال الخاص به الملزمة ذات الصلة. تثبيط البروتين الهدف من خلال هذا الإجراء يعطل مباشرة وظيفتها، ويمكن أن تكمل إجراءات ضربة قاضية RNA عن طريق زيادة التأكيد على أهمية البروتين الهدف إلى الوظيفة البيولوجية. بينما عربة الكاشف فعال في تقديم الببتيدات والبروتينات في الخلايا، وهذا هو عملية تستغرق وقتا طويلا ويحد من أنواع التجارب، على سبيل المثال التعرض لفترات طويلة أو متكررة والدراسات على الحيوانات في الجسم الحي التي يمكن القيام بها. ونتيجة لذلك، واضاف نحن الببتيد (CPP) تسلسل لاختراق الخلية إلى SMRwt الببتيد (SMRwt-CPP) 18 لإنشاء الببتيد التي يمكن اتخاذها من قبل الخلايا بشكل سلبيمن وسائل الإعلام الثقافة. وكان هذا الإصدار فعالة مثل السابق في إفراز exNef معرقلة. الأدلة من هذه التجارب نشرت يدل على قدرة الببتيدات الصغيرة التي تحتوي على زخارف وظيفية محددة لاستعداء ظيفة البروتين كامل طول عن طريق تثبيط تنافسية، وعزل البروتينات التي تربط هذه الزخارف. ويتوقع المرء أن هذه التقنيات ينبغي أن تكون مفيدة في كثير من البروتوكولات التجريبية. وينبغي أيضا أن تكون فعالة في الهندسة رواية مثبطات الببتيد العديد من العمليات الخلوية؛ دالة التي يمكن تعزيزه من خلال الربط إلى متواليات CPP.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

الببتيدات قصيرة محددة مستمدة من الزخارف الموجودة في البروتينات كامل طول، في حالتنا HIV-1 نيف، في الحفاظ ليس فقط وظيفة بيولوجية، ولكن يمكن أيضا أن تمنع بشكل تنافسي وظيفة البروتين كامل طول. واستخدمت مجموعة من 20 نيف الببتيدات المسح، 20 الأحماض الأمينية في الطول مع كل متداخلة 10 الأحماض الأمينية من جارتها، لتحديد العناصر الزخرفية في نيف المسؤولة عن تحريض له من موت الخلايا المبرمج. الببتيدات التي تحتوي على هذه العناصر الزخرفية التي يسببها موت الخلايا المبرمج أفكارك عند مستويات مماثلة لبروتين نيف كامل طول. A الببتيد الثانية، والمستمدة من إفراز تعديل المنطقة (SMR) من نيف، والإبقاء على القدرة على التفاعل مع البروتينات الخلوية تشارك في إفراز نيف في exosomes (exNef). وقد استخدم هذا الببتيد SMRwt باسم &quot;الطعم&quot; البروتين في التجارب المشتركة مناعي لعزل البروتينات الخلوية التي تربط خصيصا لعزر SMR نيف و. تم استخدام البروتين ترنسفكأيشن والأجسام المضادة تثبيط لتعطيل جسديا الرهان التفاعلوقد تم قياس وين نيف وmortalin، واحد من البروتينات SMR ملزم المعزولة، وتأثير مع القائم الفلورسنت exNef فحص إفراز. قدرة الببتيد SMRwt لتكومبيتي نيف كامل طول لالبروتينات الخلوية التي تربط بين عزر SMR، وجعلها المانع الأول من exNef إفراز. وهكذا، من خلال توظيف التقنيات الموضحة هنا، والتي تستفيد من خصائص فريدة من نوعها من الببتيدات قصيرة محددة مستمدة من الزخارف الموجودة في البروتينات كامل طول، يمكن للمرء أن الإسراع في تحديد الدوافع الوظيفية في البروتينات وتطوير مثبطات القائم على الببتيد من الوظائف المسببة للأمراض.

رسم الخرائط الدوافعع وظيفي بيولوجيا باستخدام هضميدات. وقد تم تحديد اثنين من المناطق بشأن البروتينات نيف التي تحفز على موت الخلايا المبرمج. وقد لوحظ موت الخلايا المبرمج-يحركها الببتيد (الشكل 2) بداية مع الببتيد N50 (AA30-50)، وتبلغ ذروتها في N60 (aa40-60) وN70 (aa50...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

التعرف على العناصر الوظيفية وشركائها الملزمين على أساس الببتيد | علم المناعة والعدوى | فيديو

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

تم وصفها تقنيات لتشريح الآليات الكامنة وراء من إفراز من فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف في exosomes. تم استغلال الببتيدات قصيرة محددة المستمدة من NEF وترنسفكأيشن البروتين لتحديد هيكل، وظيفة، والشركاء ملزم من نيف للسفر إفراز تعديل المنطقة. هذه الإجراءات ديك صلة عامة بالموضوع في العديد من الدراسات الآلتي.

تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

peptide-based-identification-functional-motifs-their-binding

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

12.3K Views.  Morehouse School of Medicine. تم وصفها تقنيات لتشريح الآليات الكامنة وراء من إفراز من فيروس نقص المناعة البشرية-1 نيف في exosomes. تم استغلال الببتيدات قصيرة محددة المستمدة من NEF وترنسفكأيشن البروتين لتحديد هيكل، وظيفة، والشركاء ملزم من نيف للسفر إفراز تعديل المنطقة. هذه الإجراءات ديك صلة عامة ب...

Video: Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

التالية في الوقت الحقيقي تأثير العوامل الالتهاب الرئوي الحاد الفوعة في نموذج الفأر الالتهاب الرئوي عن طريق البكتيريا للإضاءة الحيوية

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

تصور HIV-1 الكمامة ملزم لالعملاق Unilamellar الحويصلة (GUV) الأغشية

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

عزل خلايا ماست المستمدة من الغشاء البريتوني وعلى التوصيف الوظيفي مع Ca2 +-التصوير وفحوصات تحبب

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

فحوصات لمعدل نمو محددة وملزمة خلية قدرة فيروس الروتا

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...