עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NIGMS / MBRS (58,268 גרנט), NIH / NCRR / RCMI (גרנט G12-RR03034), מחקר גאורגיה לברית מימון מענק GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA מענק F31AI091484, אמורי CFAR מענק P30 A1050409. חקירה זו נערכה במתקן בנוי עם תמיכה ממחקר שיפור מתקני גרנט # C06 RR18386 מNIH / NCRR. תאי Jurkat, הקבוצה של 20 HIV-1 פפטידים NEF, כמו גם הארנב נגד HIV-1 הנף נסיוב התקבל מ-NIH איידס המחקר והתכנית מגיב הפניה (רוקוויל, מרילנד).

<ol>
	<li>Forsman, A., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+HIV+a+pathogen?.">Why is HIV a pathogen?.</a> Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).</li><li>Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+mechanisms+of+HIV+disease.">Pathogenic mechanisms of HIV disease.</a> Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).</li><li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+HIV+infection:+Stupid+may+not+be+so+dumb+after+all.">The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all.</a> Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++t+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).</li><li>Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Characterization+of+HIV+Type+1+Nef-Induced+Vesicle+Secretion.">Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).</li><li>Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הבנת המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של הנף כדי לתפעל את מסלול סחר exosomal יהיה שימושי במעכבי רומן הנדסי של הפרשת exNef. עיכוב של הפרשת exNef צריך לצמצם את דלדול CD4 תא T וה-CIA שכונן ה-HIV / איידס פתוגנזה. למען מטרה זו, פיתחנו מספר החומרים הכימיים והשיטות שאפשרו לנו לנתח את הגנטיקה ש...

עם כניסתו של טיפול אנטי retroviral, מגיפת האיידס בעולם המערבי כבר האט, אבל לא קוצץ, ואת התפשטות האיידס ממשיכה להיות נטל בריאות גדול ברחבי העולם. למעט שולי האפקטיבי המשפט התאילנדי RV144, חיסונים נגד איידס הראו כישלון בהגנה מפני זיהום עד כה. לכן, מחקר לתוך מטרות נוספות, פוטנציאל טיפולי עדיין מוצדק. יחד עם CD4 דלדול תאי T, הפעלה חיסונית כללית מתמשכת היא סימן היכר של ההידבקות ב-HIV. הפעלה חיסונית כרונית (CIA) מובילה לעלייה במחזור תא, subpopulations ימפוציטית הופעל ומובחן, תשישות והזדקנות תאית, והרג של תאי T ותאי B באמצעות הפעלה-induced מוות של תאים (AICD) 1,2,3, ו היא מבוססת היטב כאחד מהמנבאים החזקים של התקדמות מחלה 4,5,6,7,8,9,10,11,12. עם זאת, המנגנונים שבבסיס ה-CIA וCD4דלדול בהידבקות ב-HIV תא T להישאר להיות הובהר באופן מלא. ראיות מהמעבדה ואחרים שלנו הובילו אותנו למודל להתקדמות מחלה (איור 1) שבו חלבון ה-HIV הניפו (פקטור רגולציה שלילי) גורם להפרשתו בexosomes מHIV-1 תאים נגועים 13,14. exosomes המכיל הנף אלה (exNef) לגרום לאפופטוזיס במספר שושלות תאי CD4 כולל נגוע T-תאי 15,16. לחלופין, במונוציטים / מקרופגים דפוסי שינה exNef ביטוי גנים, ביטוי למשל ציטוקינים, ונראה לגרום למצב של הפעלה חיסונית לא מתוכננת. גוף זה של ראיות מצביע על תפקיד חשוב עבור exNef ב- CIA ודלדול CD4 T-תאים. הבנת המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של הנף כדי לתפעל את מסלול סחר exosomal יהיה שימושי במעכבי רומן הנדסי של הפרשת exNef. עיכוב של הפרשת exNef צריך לצמצם את דלדול תאי T מסוג CD4וה-CIA שפתוגנזה כונן ה-HIV / איידס. כדי לאסוף ראיות שהובילו למודל שלנו להתקדמות המחלה HIV / איידס ואת הנתונים הבאים שנבנו על מודל זה, פיתחנו מספר החומרים הכימיים והשיטות שאפשרו לנו לנתח את הגנטיקה של הפרשת exNef, ולהתחיל לקבוע את חלבונים תאיים מעורבים. בעבודה הראשונית, מצאנו כי החלבון הנף גורם לאפופטוזיס בתאים עוברים אורח והוא שוחרר מתאי extracellularly הנף-transfected ונגועים באיידס 15. פפטידים הנגזרים מ( תא סטרומה נגזר Factor-1, עם אלפא שחבור החלופי) SDF-1α כבר הראו בעבר כדי לשמור על חלק גדול מהפעילות המחייבת ואיתות של המולקולה באורך מלא 17. אנו משערים כי פפטידים של הנף אולי לשמר חלק מהפעילות אפופטוטיים של חלבון המלא, וכי הפפטידים האלה בהכרח יכילו תחום אפופטוטיים הנף (ים). לזהות פפטידים אלה, וכתוצאה מכך הנףתחום אפופטוטיים (ים), השגנו קבוצה של 20 HIV-1 פפטידים סריקה &#39;קערה ממחקר NIH האיידס ומגיב תכנית הפניה. פפטידים 20-AA אלה, כל חפיפת 10 חומצות אמינו של השכן שלו, נקראים במספר חומצות אמינו האחרונה שלהם, כלומר N20 משתרע &#39;קערה 1-20 חומצות אמינו, חומצות N30 משתרע 11-30&#39; קערת אמינו, וכו &#39;16. מצאנו כי חשיפת תאי T extracellularly לפפטידים ספציפיים חופפים שני תחומים 10-AA שונים באפופטוזיס המושרה החלבון הנף באורך מלא בתאים אלה. ניתוח בדיעבד של פפטידים הנגזרים אפופטוטיים הניפו אלה חשף את היכולת שלהם אינטראקציה פיזית עם קולט chemokine CXCR4 על פני השטח של תאי T, עם קינטיקה מחייבת שאפשרה פפטידים אלה כדי לעכב מחייבים תחרותיים בין CXCR4 ויגנד הטבעי שלו SDF-1α. לבסוף, האינטראקציה של פפטידים הנגזרים אפופטוטיים הניפו עם CXCR4 נמצאה כדי לגרום תגובת לחץ בתאי T אלה מובילים לאפופטוזיס. עדות זו אפשרה לנו quicתחומים הפונקציונליים של קלי המפה &#39;הקערה; תהליך זה היה לוקח הרבה יותר זמן שימוש בטכניקות סטנדרטיות מוטגניות DNA כגון mutagenesis סריקת אלאנין. הוא גם הראה שפפטידים שמקורם בהנף קצרים אלה נשמרים הפונקציה הביולוגית של הדומיינים אפופטוטיים בחלבון באורך מלא. לאחר שזיהיתי את תפקיד להנף תאי, כלומר אפופטוזיס של תאי T, בקשנו הבנה טובה יותר של איך הנף היה מופרש מהתאים. באמצעות סדרה של מבני &#39;קערה עברו מוטציה, מיפינו את מוטיבים חלבון&#39; קערה שמורה באבולוציה באזורי N-המסוף של שניהם HIV NEF, ו מק (וירוס כשל חיסוני קופי) הנף רזוס מקוק מקביל SIV, שהם קריטיים לexNef הפרשה 13. אחד מהמוטיבים האלה, אזור שינוי ההפרשה (SMR; 66VGFPV70), היה קריטי במיוחד, כתחליף אלאנין של כל אחד מחמש חומצות אמינו גם קטינה באופן משמעותי או יבוטל הפרשת exNef. כאשר נמסרו לתאים באמצעות C של המוטיב פעילhariot המשלוח מגיב חלבון, פפטיד המכיל SMR מצורף רצף פפטיד דגל (SMRwt) נמצא לעכב את הפרשת exNef משני תאים הניפו-transfected ונגוע באיידס 18. בהתבסס על הניסיון הקודם שלנו עם פפטידים, החלטנו להשתמש בפפטיד זה כדי להבהיר את המולקולות ומנגנונים העומדים בבסיס תפקידו של הנף SMR בהפרשת exNef. שימוש בפפטיד SMRwt כמו &quot;חלבון הפיתיון&quot; שלנו, אנחנו שותפים מחייבים הסלולר של SMR במשותף immunoprecipitated מlysates תא T נגוע 18. רצף פפטיד הדגל סיפק ידית נוחה ללכידת פפטיד SMRwt באמצעות שרף זיקה אנטי דגל. הממצא הקודם שלנו שואלין יחיד לאלאנין מוטציה בפפטיד SMRwt היה מספיק לביטול העיכוב של הפרשת exNef זיהה, פפטיד ספציפי מאוד שליטה נוחה (SMRmut) שהשתמשנו בו כדי לשלול חלבוני שיתוף immunoprecipitated לא ספציפיים לSMR. שימוש בפפטיד עם יםתחום pecific של עניין ולא לחלבון באורך מלא אפשר לנו לעקוף את הסינון של עשרות גורמים הסלולר אשר נקלטות על תחומים אחרים בהנף 19. ברגע שזיהינו את השותפים SMR-מחייבים, צעד הגיוני הבא היה להראות כי בני הזוג שזוהה סלולארי הכריכה הם חשובים לתפקוד הביולוגי 18. ההליך הרגיל כדי להשיג את זה הוא באמצעות מציאה רמות חלבון מירנה יעד חלבון ספציפית או siRNA, ולאחר מכן assay ההשפעה על התפקוד הביולוגי. בצענו מציאה מירנה, אשר מעכבת תרגום של mRNA היעד, צמצום ייצור של יעד זה, במקרה זה חלבון SMR מחייב. הפחתה זו של חלבון המטרה היא השפעה עקיפה, ואולי יש לו השפעה מאוחרת על הפונקציה הביולוגית ממוקד החלבון ממלא תפקיד בו כתוצאה מכך, אנחנו גם עובדים בטכניקת עיכוב הנוגדן פחות הנפוצה כדי לקבוע אם ישירות לשבש את פעילותו שלחלבון המטרה מפחית או מבטל את הפונקציה הביולוגית. בהליך זה, נוגדנים שהועלו נגד החלבון ממוקד הם transfected לתוך התא באמצעות מגיב מרכבה, ולתקשר ישירות עם חלבון המטרה או sequestering אותו מהאתר שלה של פונקציה, או חסימת תחום המחייב הרלוונטי שלה. עיכוב של חלבון המטרה באמצעות הליך זה משבש את תפקודו באופן ישיר, ויכול להשלים את הליכי מציאה RNA על ידי המאשר את חשיבותו של חלבון המטרה נוסף לפונקציה הביולוגית. אמנם מגיב מרכבה הוא יעיל במתן פפטידים וחלבונים לתאים; תהליך זה הוא זמן רב ומגביל את סוגי ניסויים, למשל חשיפות ממושכות או חוזרות ונשנות, ובמחקרים בבעלי החיים vivo ניתן לבצע את זה. כתוצאה מכך, הוספנו פפטיד רצף תא חודר (CPP) לפפטיד SMRwt (SMRwt-CPP) 18 ליצירת פפטיד שיכול להילקח על ידי תאים פסיבייםמתקשורת והתרבות. גרסה זו הייתה יעילה כמו לשעבר בהפרשת exNef עיכוב. העדויות מניסויים שפורסמו אלה מדגימה את היכולת של פפטידים קטנים המכילים מוטיבים פונקציונליים ספציפיים כדי להרגיז את הפונקציה של החלבון באורך מלא באמצעות עיכוב תחרותי, וכדי לבודד את החלבונים הנקשרים מוטיבים אלה. ניתן היה לצפות כי טכניקות אלה צריכים להיות שימושיות בהרבה פרוטוקולי ניסוי. הם צריכים גם להיות יעילים במעכבי פפטיד חדשניים הנדסיים של תהליכים תאיים רבים, פונקציה שניתן לשפר עוד יותר על ידי הצמדה לרצפי CPP.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורך מלא, במקרה שלנו ה-HIV-1 NEF, לא רק שומרים על התפקוד הביולוגי שלהם, אלא גם יכולים לעכב את הפונקציה של החלבון באורך מלא באופן תחרותי. קבוצה של 20 פפטידים סריקת NEF, 20 חומצות אמינו באריכות עם כל חפיפת 10 חומצות אמינו של השכן שלו, שתשמש לזיהוי מוטיבים בהנף אחראי לגרימת מות תאים מתוכנת שלה. פפטידים המכילים מוטיבים אפופטוטיים אלה מושרה אפופטוזיס ברמות דומות לחלבון הנף באורך מלא. הפפטיד שני, הנגזר משינוי אזור ההפרשה (SMR) של NEF, נשמרים היכולת ליצור אינטראקציה עם חלבונים תאיים המעורבים בהפרשה של הנף בexosomes (exNef). פפטיד SMRwt זה שימש כחלבון &quot;הפיתיון&quot; בשיתוף immunoprecipitation ניסויים כדי לבודד חלבונים תאיים הנקשרים באופן ספציפי למוטיב SMR של NEF. עיכוב transfection ונוגדן חלבון שימש לשבש את הימור האינטראקציה פיזיWeen הנף וmortalin, אחד מחלבוני SMR מחייבים המבודדים, ואת ההשפעה נמדד עם assay הפרשת exNef מבוסס פלורסנט. יכולתו של פפטיד SMRwt לגבור הנף באורך מלא לחלבונים תאיים הקושרים את מוטיב SMR, להפוך אותו למעכב הראשון של הפרשת exNef. וכך, על ידי שימוש בטכניקות שתוארו כאן, אשר מנצלים את התכונות הייחודיות של פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורך מלא, ניתן להאיץ את זיהוי של מוטיבים פונקציונליים בחלבונים ופיתוח של מעכבים של פונקציות פתוגניים המבוססים על פפטיד.

מיפוי מוטיבים ביולוגי תפקודיים באמצעות פפטידים. שני אזורים זוהו על חלבונים ש&#39;הקערה לגרום לאפופטוזיס. אפופטוזיס פפטיד מונחה נצפה (איור 2) עם תחילת הפפטיד N50 (aa30-50), הגיע לשיא של N60 (aa40-60) וN70 (aa50-70), והולך ופוחת לרמות רקע בפפטיד N100 (aa80-100). המוטיב המרכזי 1 (M1...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners at JoVE.com

זיהוי מבוסס פפטיד של מוטיבים פונקציונליים ושותפיהם המחייבים | אימונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

peptide-based-identification-functional-motifs-their-binding

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

12.3K Views.  Morehouse School of Medicine. טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.

Video: Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

ויזואליזציה של HIV-1 Gag מחייב את הענק Unilamellar שלפוחיות (בוס) ממברנות

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Unravelling תפקידו של מפעיל בקטריאלי מ פתוגן צמחים ללא לעיבוד בעזרת שמרי מסך דו-היברידי

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

בידוד של תאי פיטום, נגזר צפק ואיפיונן פונקציונלי עם Ca2 +-הדמיה, מבחני Degranulation

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

מבחני עבור קצב צמיחה ספציפיים והיכולת תא-איגוד של בנגיף

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...