وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01DK080971 والأحداث مؤسسة أبحاث السكري منحة 37-2009-44. كما أننا نقدر الدعم الذي تلقته من مركز جامعة كاليفورنيا سان دييغو لطب الاطفال أبحاث السكري (PDRC).

1. ترنسفكأيشن من HEK293 طبقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد HEK293 المتوسطة الخلية عن طريق إضافة إلى 500 زجاجات مل من DMEM (مع 4.5 جم / مل الجلوكوز وأحمر الفينول ودون الجلوتامين): 50 مل FBS، 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين حل، 5 مل 100X حل L-الجلوتامين و 500 ميكرولتر الأمفوتريسين B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة من HEK293 الخلايا في 24 لوحة جيدا باستخدام 0.5 مل من وسائل الاعلام HEK293 لكل بئر. تأكد من أن الخلايا تنتشر بالتساوي في جميع أنحاء الجزء السفلي من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الخلايا HEK293 تصل إلى 100٪ confluency، بالنقل مع 0.8 ميكروغرام من البلازميد ترميز البروتين من الفائدة (تدرج في ناقلات التعبير الثدييات) و 2 ميكرولتر من Lipofectamine 2000 وفقا لبروتوكول Lipofectamine. لقد اختارت لاستخدام pcDNA 3.3 العمود الفقري مصممة للتعبير في خلايا الثدييات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، بعد 6 ساعة من الحضانة، وتبادل وسائل الإعلام ترنسفكأيشن موضح في البروتوكول Lipofectamine مع HEK293 وسائل الإعلام العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم التعبير عن المتواجد transfectedفي، مجموعة فرعية من transfected الآبار وزراعة الأنسجة يمكن أن تستخدم لكشف مناعي من البروتين المعبر عنه أو عن تحليل لطخة غربية التعبير البروتين باستخدام التقنيات القياسية. </li></ol> 2. تثبيت اختياري من HEK293 الخلايا معربا عن بروتين Transfected Transfected HEK293 الخلايا يمكن ان تكون ثابتة بلطف من أجل تسهيل coculture في وسائل الإعلام التي قد تكون ضارة للعيش HEK293 الخلايا (على سبيل المثال الخطوة 3.9 أدناه) أو للسماح للكفاءة إعداد مقدما من لوحات لعدة تجارب في كل مرة (انظر أيضا المناقشة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء دراسات تجريبية لتحديد مسار الوقت للتعبير عن البروتين في الخلايا HEK293. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد transfecting طبقة الخلايا HEK293، نضح وسائل الإعلام من الخلايا في نقطة زمنية ما بعد ترنسفكأيشن المرتبطة أعلى مستوى من التعبير. إذا كان هذا يحدث داخل ساعة 24 الأولى، لا نضح حتى 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل سعادةK293 الخلايا بلطف مع D-PBS ثم إضافة 500 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA)، واحتضان في RT لمدة 30 دقيقة. (لجعل 4٪ PFA حل، وتبدأ مع حل 16٪ في برنامج تلفزيوني 1X وتمييع 01:04 مع 1X PBS.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة، وغسل بلطف الخلايا 3 مرات واحتضان في برنامج تلفزيوني O / N عند 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة، ثم إضافة برنامج تلفزيوني وترك في 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها (قد تختلف أقصى وقت التخزين اعتمادا على البروتين المعبر عنه. نحن تخزين HEK293 الخلايا transfected للتعبير عن الأشكال الإسوية neuroligin لمدة تصل الى 2 أسابيع من دون تغييرات كبيرة في الآثار الملاحظة على إفراز الأنسولين). </li></ol> 3. شارك في زراعة من INS-1 خلايا بيتا مع HEK293 خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد INS-1 وسائل الاعلام من خلال إضافة إلى 500 مل المتوسط ​​1640 (مع الجلوكوز وأحمر الفينول ودون الجلوتامين): 50 مل FBS، 5 مل 100X البنسلين / الستربتوميسين، 5 مل 100X حل L-الجلوتامين، 5 مل البيروفات الصوديوم، و 500 ميكرولتر الأمفوتريسين B، 500 ميكرولتر بيتا المركابتويثانول (هذا هو مطابق تقريبا لميدىأم تستخدم عادة لثقافة جزيرة الأولية باستثناء إضافة بيتا المركابتويثانول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلوي متجرد (أو مزيل الخلية غير الأنزيمية آخر)، INS-1 حصاد الخلايا في حوالي 70-80٪ confluency قبالة الجزء السفلي من قارورة ثقافة T75. وسوف توفر كل قارورة تقريبا ما يكفي من خلايا لمدة 48 بئرا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغزل أسفل الخلايا في جهاز الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1،200 دورة في الدقيقة، في resuspend مزيج 50/50 من INS-1 وسائل الإعلام كلوة الجنين البشري. لقارورة متكدسة 70-80٪ من INS 1 خلايا، في resuspend ما يقرب من 25 مل من وسائل الإعلام المختلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام HEK293 الخلايا التي تم إصلاحها في بارافورمالدهيد بدلا من HEK293 الخلايا الحية، resuspend الخلايا INS-1 في 100٪ INS-1 وسائل الإعلام بدلا من وسائل الإعلام المختلطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 10 مل ماصة، إزاحة الخلايا من بيليه لجعل التعليق خلية متجانسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح لإزالة وسائل الإعلام على الخلايا HEK293. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة P1000، إضافة بلطف 500 ميكرولتر من INS-1 الخلية التعليق على طبقة الخلايا كلوة الجنين البشري على طول الجانبين سو البئر. بعد كل 6 آبار، واستخدام 10 مل ماصة لresuspend الخلايا INS-1 مرة أخرى لضمان تعليق خلية متجانسة. وصفت الخطة الشاملة للcoculture مجموعة المتابعة في الشكل 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 24-48 ساعة اعتمادا على بروتوكول التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب أكثر من 48 ساعة فترة coculture، استخدم الخطوات الاختيارية في القسم 2 أعلاه لإصلاح الخلايا HEK293. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام القوارض فصلها الأولية أو الجزر الإنسان [انظر على سبيل المثال البروتوكولات قبل إن الرب في 11-15]، وضمان أن وسائل الإعلام المناسبة مثل RPMI مع 5 مل القلم / بكتيريا، 5 مل L-التخمة، 0.5 مل الأمفوتريسين-B يستخدم بدلا من وسائل الاعلام INS-1. على الرغم من أن يمكن لأحد أن استخدام الخلايا جزيرة فصلها في 24 لوحة جيدا، من الناحية العملية نظرا لوجود عدد كبير من الجزر الصغيرة يحتمل أن تكون حاجة، فمن المستحسن أن يتم النظر في التوسع لتصل إلى 48 لوحة جيدا (يتطلب أقل الخلايا جزيرة لكل بئر). على 48 لوحة جيدا، تضيف نحو 100 الجزر بقيمة dissociaالخلايا تيد في لوحة لبدء. اعتمادا على فعالية من التفكك وطريقة استخدامها، قد تكون هناك حاجة أقل الجزر. </li></ol> 4. الجلوكوز حفز افراز الانسولين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن مسبقا الخلايا في 250 ميكرولتر من 2.5 ملي الجلوكوز في KRB (بيكربونات العازلة كريبس-قارع الأجراس) مدة لا تقل عن 1 ساعة. ليحضن مسبقا، وإزالة المتوسطة coculture واستبدالها فورا مع KRB. وينبغي أن يتم هذا التبادل بئر واحدة في وقت واحد للحد من التعرض للINS-1 الخلايا للأوكسجين البيئية. نضح بيد واحدة بينما pipetting لو(2.5 ملم) KRB انخفاض الجلوكوز مع الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل KRB حضن مسبق إلى 250 ميكرولتر من إما 2.5 ملم أو 20 ملم الجلوكوز في KRB العازلة بئر واحدة في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان ذلك مناسبا للتجربة محددة، ويمكن أن يضاف secretagogues إضافية مثل 100 IBMX ميكرومتر لإنتاج أكثر قوة حفز الأنسولين استجابة إفرازية. فصل خلايا بيتا جزيرة الابتدائي على وجه الخصوص هي استجابة ضعيفة إلى زيادة تركيزات الجلوكوز ألونه، لذلك ينبغي النظر هنا خاصة إضافة IBMX أو غيرها secretagogues 16،17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة من الحضانة، ونقل وسائل الإعلام لmicrofuge أنابيب وتدور 1،500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 200 ميكرولتر من طاف واستخدام هذا لتحليلها من قبل الأنسولين RIA أو ELISA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد المحللة الخلية، إضافة 100 ميكرولتر من RIPA العازلة تحلل الخلية (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1.0٪ IGEPALCA-630 أو Nonidet P-40، 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS، 50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0) مع مثبطات الأنزيم البروتيني لل لوحة فورا بعد إزالة وسائل الإعلام واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار المحللة لمدة 15 دقيقة في XG 10،000 وإزالة 50 ميكرولتر من طاف للتحليل بواسطة الأنسولين RIA أو ELISA. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion.">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li><li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets.">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li><li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas.">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, 159-167 (2009).</li><li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-secreting+cell+lines:+classification,+characteristics+and+potential+applications.">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li><li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+build+a+central+synapse:+clues+from+cell+culture.">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion.">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li><li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common.">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neurexin,+neuroligin,+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion.">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li><li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function.">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li><li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells:+a+comparison+of+methods.">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+I:+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue.">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125 (2009).</li><li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pancreatic+islet+isolation:+Part+II:+purification+and+culture+of+human+islets.">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli:+enhanced+Ca2++and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets.">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li><li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads.">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li><li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line:+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins.">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li><li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages.">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9 (2010).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

طريقة coculture الموصوفة هنا يوفر وسيلة فعالة لتحديد أهمية الفسيولوجية للبروتينات بيتا على سطح الخلية، الغشاء محددة، وعلى وجه التحديد من المجالات الخاصة بهم خارج الخلية. من قبل خلايا بيتا زراعة الخلايا أو ورم جزيري (مثل الخلايا INS-1 يعمل هنا) في اتصال مع خلايا HEK293 عرض بروت...

نحن هنا وصف طريقة لتسهيل التحقيقات في كيفية المجالات خارج الخلية البروتينات عبر الغشاء محددة تؤثر على إفراز الأنسولين. تحقيقات أسلوب آثار تفاعلات البروتين في المصالح مع البروتينات (أو ربما الجزيئات الأخرى) على سطح البنكرياس خلايا بيتا. الأسلوب يسمح التحقيقات لكيفية بروتينات سطح الخلية التي أعربت عنها خلايا بيتا أو بواسطة الخلايا المجاورة الأخرى (مثل الخلايا البطانية، الخلايا العصبية، خلايا ألفا البنكرياس) تؤثر على وظيفة خلايا بيتا من خلال التفاعلات العابر للخلايا (أي من خلال التفاعل مع الشركاء التفاعل على سطح مجاور خلايا بيتا). الغشاء البلازمي الخلوي يحتوي على مجموعة معقدة من البروتينات الهيكلية والوظيفية التي تخدم كجسر للبيئة خارج الخلية. عن طريق تشكيل اتصالات العابر للخلايا أو عن طريق بدء الأحداث يشير البلاستيك، يمكن أن التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيقوظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز 1. كما كشفت، على سبيل المثال، من أهمية خارج الخلية EphA-ephrinA وneuroligin-2 التفاعلات في تنظيم الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، أصبح من أي وقت مضى أكثر وضوحا أن زيادة معرفة التفاعلات التي تحدث بين البروتينات خارج الخلية على سطوح المجاورة خلايا بيتا ستكون ذات أهمية كبيرة لاكتساب فهم كامل من إفراز الأنسولين، بيتا خلية النضج وظيفية والحفاظ على توازن الجلوكوز 1-3. والهدف من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو تمكين التحقيقات من آثار على وظيفة خلايا بيتا من التفاعلات العابر للخلايا التي تنطوي على الغشاء محددة أو البروتينات خلاف ذلك، على سطح الخلية المرتبطة. من قبل خلايا بيتا شارك في زراعة الخلايا مع HEK293 transfected مع بنيات التعبير المختلفة، والآثار على بايتا وظيفة الخلية من مختلف البروتينات على سطح الخلية أو المتغيرات تحور منه يمكن أن يكون بحثها بكفاءة. ويتم إنجاز هذا دون الحاجة إلى بالنقل خلايا بيتا أنفسهم. توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا خلايا بيتا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط تحليلات آثار التفاعلات خارج الخلية المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة، وعلاوة على ذلك، لا تسمح الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات على أو في نفس الخلية لتمييزها عن آثار التفاعلات العابر للخلايا. هنا، وهي طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا هو أن described. هذه الطريقة تنطبق على إفراز الانسولين خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1-4 خلايا، والقوارض الأولية فصلها أو خلايا بيتا الإنسان. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا يمكن تحديد البروتينات التي تدفع تشكيل المشبك 5،6. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن وظيفة خلايا بيتا والنضج وظيفية قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة 7-9. من أجل تحقيق هذه التفاعلات، قمنا بتطوير نظام الموصوفة هنا التي يتم cocultured خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة 10. هذا النظام يسمح السيتوبلازم خلايا بيتا لتظل بمنأى بينما يتم معالجته خارج الخلية البروتين البروتين التفاعلات.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K830001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18324012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-312</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/strep solution</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-652-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-808-1/30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-404</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-434</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-710-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985023</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell stripper</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45000-668</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>BD</td>
			<td>1368065</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50980487</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>45001-130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0278</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

coculture analysis of extracellular protein interactions affecting insulin secretion by pancreatic beta cells

التفاعلات بين البروتينات على سطح الخلية مساعدة في تنسيق وظيفة الخلايا المجاورة. تتجمع خلايا بيتا في البنكرياس معا داخل البنكرياس الجزر والتصرف بطريقة منسقة للحفاظ على توازن الجلوكوز. لقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التفاعلات بين البروتينات عبر الغشاء على أسطح خلايا بيتا المجاورة عوامل هامة في تحديد وظيفة خلايا بيتا. توضيح أدوار معينة التفاعلات العابر للخلايا التي كتبها دراسات ضربة قاضية، أو خروج المغلوب من overexpression في خلايا بيتا أو مثقف في الجسم الحي يستلزم اضطراب مباشرة من مرنا والتعبير البروتين، ويحتمل أن تؤثر في صحة خلايا بيتا و / أو وظيفة في الطرق التي يمكن أن نخلط التحليلات للآثار من التفاعلات المحددة. هذه النهج أيضا تغيير مستويات من المجالات داخل الخلايا من البروتينات المستهدفة وربما منع الآثار الناجمة عن التفاعلات بين البروتينات داخل نفس غشاء الخلية لتكون DIStinguished من آثار التفاعلات العابر للخلايا. هنا يتم تقديم طريقة لتحديد تأثير التفاعلات العابر للخلايا معينة على قدرة إفراز الأنسولين واستجابة خلايا بيتا. هذه الطريقة تنطبق على خطوط خلايا بيتا، مثل INS 1 خلايا، وفصلها إلى خلايا بيتا الأولية. لأنه يقوم على نماذج coculture التي وضعتها بيولوجيا عصبية، الذين وجدوا أن تعرض الخلايا العصبية مثقف للبروتينات الخلايا العصبية المحددة التي أعربت عن HEK293 (أو COS) طبقات الخلايا البروتينات التي تم تحديدها مهم للقيادة تشكيل المشبك. ونظرا لأوجه التشابه بين آلات إفرازية من نقاط الاشتباك العصبي الخلايا العصبية وخلايا بيتا، ونحن مسبب أن نضوج وظيفية خلايا بيتا قد تكون مدفوعة من قبل التفاعلات العابر للخلايا مماثلة. قمنا بتطوير نظام حيث يتم استزراع خلايا بيتا على طبقة من الخلايا معربا عن HEK293 بروتين من الفائدة. في هذا النموذج، يتم بمنأى السيتوبلازم خلايا بيتا في حين خارج الخلية interactio البروتين البروتينيتم التلاعب نانوثانية. على الرغم من أننا نركز هنا في المقام الأول على دراسات من الجلوكوز في حفز إفراز الأنسولين، وعمليات أخرى يمكن تحليلها، على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني على النحو الذي يحدده immunoblotting أو QPCR.

باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، لدينا اختبار تأثير أنواع مختلفة من neuroligin البروتين على إفراز الأنسولين. هذا يكمل عملنا نشرت التحقيق في تأثير neuroligin-2 على وظيفة خلايا بيتا 10. الشكل 2، على سبيل المثال، يصور النتائج التي تم الحصول عليها من INS-1 coculturing خلايا بي?...

Watch this Scientific Journal Video about Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells at JoVE.com

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

تفاعلات البروتين العابر للخلايا هي محددات هامة من البنكرياس وظيفة خلايا بيتا. مفصلة هنا هو الأسلوب مقتبس من نموذج coculture من synaptogenesis للتحقيق في كيفية تأثير البروتينات عبر الغشاء محددة إفراز الأنسولين. Transfected HEK293 خلايا التعبير عن البروتينات في المصالح؛ خلايا بيتا لا تحتاج إلى transfected أو خلاف ذلك مضطرب مباشرة.

تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

coculture-analysis-extracellular-protein-interactions-affecting

Research

JoVE Journal

Medicine

12.8K Views.  University of California, San Diego. تفاعلات البروتين العابر للخلايا هي محددات هامة من البنكرياس وظيفة خلايا بيتا. مفصلة هنا هو الأسلوب مقتبس من نموذج coculture من synaptogenesis للتحقيق في كيفية تأثير البروتينات عبر الغشاء محددة إفراز الأنسولين. Transfected HEK293 خلايا التعبير عن البروتينات في المصالح؛ خلايا بيتا ...

Video: Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose concentrations, even in non-diabetic patients, predicts poor outcomes.1-4 The 2008 consensus statement by the American Association of Clinical Endocrinologists (AACE) and the American Diabetes Association (ADA) states that "hyperglycemia in hospitalized patients, irrespective of its cause, is unequivocally associated with adverse outcomes."5 It is important to recognize that hyperglycemia occurs in patients with known or undiagnosed diabetes as well as during acute illness in those with previously normal glucose tolerance.
The Normoglycemia in Intensive Care Evaluation-Survival Using Glucose Algorithm Regulation (NICE-SUGAR) study involved over six thousand adult intensive care unit (ICU) patients who were randomized to intensive glucose control or conventional glucose control.6 Surprisingly, this trial found that intensive glucose control increased the risk of mortality by 14% (odds ratio, 1.14; p=0.02). In addition, there was an increased prevalence of severe hypoglycemia in the intensive control group compared with the conventional control group (6.8% vs. 0.5%, respectively; p&lt;0.001). From this pivotal trial and two others,7,8 Wyoming Medical Center (WMC) realized the importance of controlling hyperglycemia in the hospitalized patient while avoiding the negative impact of resultant hypoglycemia. 
Despite multiple revisions of an IV insulin paper protocol, analysis of data from usage of the paper protocol at WMC shows that in terms of achieving normoglycemia while minimizing hypoglycemia, results were suboptimal. Therefore, through a systematical implementation plan, monitoring of patient blood glucose levels was switched from using a paper IV insulin protocol to a computerized glucose management system. By comparing blood glucose levels using the paper protocol to that of the computerized system, it was determined, that overall, the computerized glucose management system resulted in more rapid and tighter glucose control than the traditional paper protocol. Specifically, a substantial increase in the time spent within the target blood glucose concentration range, as well as a decrease in the prevalence of severe hypoglycemia (BG &lt; 40 mg/dL), clinical hypoglycemia (BG &lt; 70 mg/dL), and hyperglycemia (BG &gt; 180 mg/dL), was witnessed in the first five months after implementation of the computerized glucose management system. The computerized system achieved target concentrations in greater than 75% of all readings while minimizing the risk of hypoglycemia. The prevalence of hypoglycemia (BG &lt; 70 mg/dL) with the use of the computer glucose management system was well under 1%.

When compared to the previous paper protocol, implementation of a computerized glucose management system results in a substantial increase in blood glucose concentration measurements within the target range. Using a computerized glucose management system to monitor blood glucose levels, decreases in severe hypoglycemia (&lt;40 mg/dL), clinical hypoglycemia (&lt;70 mg/dL), and hyperglycemia (&gt;180 mg/dL) also can be observed.

رابعا تحسين إدارة الأنسولين في مستشفى محلي

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

العزلة، وتوصيف المقارن التمييز بين الخلايا الجذعية البشرية الأسنان اللب المستمدة من الأسنان الدائمة باستخدام طريقتين مختلفتين

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Coculture System with an Organotypic Brain Slice and 3D Spheroid of Carcinoma Cells

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in particular the role of the resident (stromal) cells. Studies in primary carcinomas demonstrate the influence of the microenvironment on metastasis, even on prognosis1,2. Especially the tumor associated macrophages (TAM) support migration, invasion and proliferation3. Interestingly, the major target sites of metastasis possess tissue-specific macrophages, such as Kupffer cells in the liver or microglia in the CNS. Moreover, the metastatic sites also possess other tissue-specific cells, like astrocytes. Recently, astrocytes were demonstrated to foster proliferation and persistence of cancer cells4,5. Therefore, functions of these tissue-specific cell types seem to be very important in the process of brain metastasis6,7.
Despite these observations, however, up to now there is no suitable in vivo/in vitro model available to directly visualize glial reactions during cerebral metastasis formation, in particular by bright field microscopy. Recent in vivo live imaging of carcinoma cells demonstrated their cerebral colonization behavior8. However, this method is very laborious, costly and technically complex. In addition, these kinds of animal experiments are restricted to small series and come with a substantial stress for the animals (by implantation of the glass plate, injection of tumor cells, repetitive anaesthesia and long-term fixation). Furthermore, in vivo imaging is thus far limited to the visualization of the carcinoma cells, whereas interactions with resident cells have not yet been illustrated. Finally, investigations of human carcinoma cells within immunocompetent animals are impossible8.
For these reasons, we established a coculture system consisting of an organotypic mouse brain slice and epithelial cells embedded in matrigel (3D cell sphere). The 3D carcinoma cell spheres were placed directly next to the brain slice edge in order to investigate the invasion of the neighboring brain tissue. This enables us to visualize morphological changes and interactions between the glial cells and carcinoma cells by fluorescence and even by bright field microscopy. After the coculture experiment, the brain tissue or the 3D cell spheroids can be collected and used for further molecular analyses (e.g. qRT-PCR, IHC, or immunoblot) as well as for investigations by confocal microscopy. This method can be applied to monitor the events within a living brain tissue for days without deleterious effects to the brain slices. The model also allows selective suppression and replacement of resident cells by cells from a donor tissue to determine the distinct impact of a given genotype. Finally, the coculture model is a practicable alternative to in vivo approaches when testing targeted pharmacological manipulations.

The organotypic brain slice coculture with carcinoma cells enables visualizing morphological changes by fluorescence as well as bright field (video) microscopy during the process of carcinoma cell invasion of brain tissue. This model system also allows for cell exchange and replenishment approaches and offers a wide variety of manipulations and analyses.

نظام Coculture مع عضوي النمط شريحة الدماغ و 3D كروي من خلايا سرطان

Patients with cerebral metastasis of carcinomas have a poor prognosis. However, the process at the metastatic site has barely been investigated, in ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

الإنسان دوبوترين<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة لدراسة Myofibroblasts وخارج الخلية مصفوفة التفاعلات

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

دراسة سرطان البنكرياس الجذعية خصائص الخلايا لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-beta Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It is well established that synapse loss and ensuing neurodegeneration are the best predictors for memory impairments in AD. Latest studies have emphasized the neurotoxic role of soluble amyloid-beta oligomers (A&#946;o) that begin to accumulate in the human brain approximately 10 to 15 yr before the clinical symptoms become apparent. Many reports indicate that soluble A&#946;o correlate with memory deficits in AD models and humans. The A&#946;o-induced neurodegeneration observed in neuronal and brain slice cultures has been more challenging to reproduce in many animal models. The model of repeated A&#946;o infusions shown here overcome this issue and allow addressing two key domains for developing new disease modifying therapies: identify biological markers to diagnose early AD, and determine the molecular mechanisms underpinning A&#946;o-induced memory deficits at the onset of AD. Since soluble A&#946;o aggregate relatively fast into insoluble A&#946; fibrils that correlate poorly with the clinical state of patients, soluble A&#946;o are prepared freshly and injected once per day during six days to produce marked cell death in the hippocampus. We used cannula specially design for simultaneous infusions of A&#946;o and continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps. This innovative in vivo method can now be used in preclinical studies to validate the efficiency of new AD therapies that might prevent the deposition and neurotoxicity of A&#946;o in pre-dementia patients.

To study the effects of A&#946;o in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble A&#946;o coupled with continuous infusion of A&#946;o antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of A&#946;o.

التنكس العصبي في نموذج حيواني من المزمن اميلويد بيتا قليل وحدات ضخ وتصدى بواسطة الأجسام المضادة العلاج يملؤه المضخات الأسموزية

Decline in hippocampal-dependent explicit memory (memory for facts and events) is one of the earliest clinical symptom of Alzheimer&#39;s disease (AD). It ...

Application of End-to-end Anastomosis in Robotic Central Pancreatectomy

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of pancreatic body. With technological development, the robotic surgical system has shown its advantage in minimally invasive surgery and been increasingly applied in central pancreatectomy. However, reconstruction of the continuity of pancreas with end-to-end anastomosis after robotic central pancreatectomy has not been applied. In this study, we report surgical techniques for robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis. The pancreas is reconstructed by duct-to-duct anastomosis of the pancreatic duct with a pancreatic stent inserted in the two stumps of pancreatic duct, and by end-to-end anastomosis of the pancreatic parenchyma. Compared with traditional central pancreatectomy with pancreaticoenteric anastomosis, this approach decreases the operative injury to the patient, and also conserves the integrity and continuity of the digestive duct and pancreatic duct. The robotic surgical system integrated with multiple instruments with flexible and precise movement is particularly suitable for the dissection and reconstruction of the pancreatic duct. We found that robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is safe and feasible, and we need more experience to evaluate its best indications and long-term outcomes.

The robotic central pancreatectomy with end-to-end anastomosis is feasible and safe for tumor in the pancreatic neck and proximal portion of pancreatic body. The operative techniques of this operation are presented.

تطبيق ملامسة نهاية إلى نهاية في بانكريتيكتومي الوسطى إليه (روبوت)

Central pancreatectomy is carried out for the treatment of benign or low-malignant potential tumors located in the pancreatic neck or proximal part of ...

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous insulin assays have existed for decades, the recent advent of homogeneous time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer (HTRF) technology has significantly simplified these measurements. This is a rapid, cost-effective, reproducible, and robust optical assay reliant upon antibodies conjugated to bright fluorophores with long lasting emission which facilitates time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer. Moreover, HTRF insulin detection is amenable for the development of high-throughput screening assays. Here we use HTRF to detect insulin secretion in INS-1E cells, a rat insulinoma-derived cell line. This allows us to estimate basal levels of insulin and their changes in response to glucose stimulation. In addition, we use this insulin detection system to confirm the role of dopamine as a negative regulator of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). In a similar manner, other dopamine D2-like receptor agonists, quinpirole, and bromocriptine, reduce GSIS in a concentration-dependent manner. Our results highlight the utility of the HTRF insulin assay format in determining the role of numerous drugs in GSIS and their pharmacological profiles.

Homogeneous Time-resolved F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Here, we present homogeneous time resolved FRET (HTRF) as an efficient method for rapid detection of insulin secreted from cells.

متجانسة فورستر حل وقت الرنين الطاقة القائم على نقل التحليل للكشف عن إفراز الأنسولين

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

علم الطاقة الحيوية التحقيق المبيضات البيض "باستخدام" الوقت الحقيقي خارج الخلية التمويه التحليل

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...