يسمح لنا هذا البروتوكول بمراقبة مجمعات الميتوفاجي الذاتية في الأنسجة البشرية مثل خلايا بيتا ، مما يسهل أبحاث الميتوفاجي في الأنسجة المحورية ذات الصلة بالترجمة. إحدى مزايا هذه التقنية هي قدرتها على تصور مجمعات الميتوباغ المهمة في الجسم الحي في الأنسجة ذات التوافر النادر أو بأعداد عينة صغيرة. بعد عزل وفقا للبروتوكولات القياسية, ثقافة أربع إلى ست مرات 10 إلى ثالث مكافئات الجزر البشرية في 10 ملليلتر من كامل البنكرياس متوسطة ليوم واحد على الأقل في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، استخدم مجهر ضوء تشريح في التكبير ثلاث مرات لحساب الجزر البشرية الفردية داخل الثقافة. اختيار 40 الجزر لكل علاج أو شرط من الفائدة في 1.5 ملليلتر أنابيب من متوسطة جزيرة. رواسب الجزر عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 50 مجهرية PR619.
عكس الأنبوب وجمع الجزر عن طريق الطرد المركزي لغسل الثانية في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى مثبطات deubiquitinase. بعد الطرد المركزي الثاني، افصل الجزر في خلايا واحدة مع 125 ميكرولترات من 0.25٪ تريبسين زائد مثبط لمدة ثلاث دقائق في 37 درجة مئوية مع الأنابيب لطيف الدورية. في النهاية من الحاضنة, إعتزل ال [ردر] مع واحدة ملليلتر من 37 درجة مئويّة يدفأ بنكرياس [هست] [هست] وسط مع PR619.
جمع الجزر عن طريق الطرد المركزي لاثنين من يغسل في برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى مثبط لكل غسل. بعد الغسيل الثاني ، resuspend الجزر المنفصلة في 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني جديد بالإضافة إلى مثبطات. للتمسك و تثبيت الجزر الفردية، cytospin حل الخلية على شرائح المجهر المشحونة المتجمدة ومخطط المنطقة الخلوية مع قلم محمّد.
ثم إصلاح الخلايا المحاصرة مع 4٪ شبهformaldehyde وBBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. للتحليل الكيميائي المناعي لعينات الجزر، قم بغسل الخلايا مع غسلين لمدة خمس دقائق في PBS في درجة حرارة الغرفة، تليها حجب ملزم غير محدد مع مصل 10٪حمار وبرنامج تلفزيوني بالإضافة إلى 0.3٪ من المنظفات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة منع، coincubate الخلايا مع الأجسام المضادة الماوس الأولية ضد الببتيداس ubiquitin محددة 8، الأجسام المضادة الأرنب الأولية ضد بروتين تدهور مستقبلات neuregulin-1، وعلامة محددة لتحديد الخلية بيتا التي لم يتم رفعها في الماوس أو الأرنب حتى لا تتداخل مع القرب ربط إشارة الاختبار بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.
في صباح اليوم التالي، غسل العينات مع اثنين من غسل خمس دقائق في برنامج تلفزيوني على الروك. إضافة المضادة المضادة Cy5 المضادة الماعز الثانوية إلى حل فحص ربط القرب أعدت حديثا. بعد الغسيل الثاني، تسمية كل عينة جزيرة مع 20 ميكرولترات من محلول التحقيق واستعادة الشرائح مع فيلم بلاستيكي لاحتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا مع اثنين من خمس دقائق يغسل في عازلة A على الروك تليها الحضانة مع 20 microlits من حل الربط الطازجة التي تكملها 0.25 وحدة لكل ميكرولتر من ligase لكل شريحة لاحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية عملية الربط، اغسل الخلايا مرتين بالمخزن المؤقت A لمدة دقيقتين لكل غسل. غطي كل عينة بـ 20 ميكروليترات من حلول التضخيم المكملة بالبوليميراز لاحتضان لمدة 100 إلى 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
لتحضير الخلايا للتصوير، قم بغسل العينات مرتين في المخزن المؤقت الطازج A لمدة 10 دقائق لكل غسيل على الروك متبوعاً بغسل واحد في المخزن المؤقت 0.1x B لمدة دقيقتين على الروك. بعد الغسيل الأخير، قم بتركيب الشرائح مع قطرة من الوسيلة المتصاعدة التي تحتوي على DAPI ووضع غطاء بعناية على كل عينة باستخدام مشرط للضغط على أي فقاعات. ثم ختم الأغطية مع طلاء الأظافر واضحة حول حواف.
لصورة العينات، ضع شريحة على خشبة المجهر قادرة على التقاط عدة طائرات بؤرية وحدد التكبير 100 مرة. تعيين ارتفاع Z-المكدس إلى ما يقرب من 0.45 ميكرومتر وصمة عار المناسبة، counterstain، وإشارة الخلية الحية المعلمات الإثارة والانبعاثات. الحصول على ما لا يقل عن تسع صور مختلفة من الطائرات المحورية.
لضمان أن الإشارات الخلفية صورة fluorescence والضوء الضال يتم تقليلها ، معالجة الصور باستخدام خوارزمية فك الوضوح الأقرب الجيران ثنائية الأبعاد باستخدام برنامج معالجة الصور القياسية المفضلة. لقياس التفاعلات المقايسة ربط القرب، افتح ImageJ وفتح صورة قياس القرب. بدءًا من الصورة الأولى في التركيز البؤري، انقر فوق صورة وحدد الضبط والعتبة.
ضبط عتبة لإزالة كل من غير محددة إشارة تحليل الربط القرب وتقديم مذكرة من التكيف عتبة في محاولة للحفاظ على إشارة متسقة طوال التحليل. انقر فوق عملية وحدد ثنائي وجعل ثنائي. تأكد من تعيين الحجم إلى صفر إلى ما لا نهاية، يتم تعيين دائري إلى صفر إلى واحد، يتم تعيين إظهار إلى حدود و تحقق من عرض النتائج ومربعات نتائج مسح.
لاحظ عدد الجسيمات التي تم تحليلها في جدول بيانات يشير إلى العينة ووضع المكدس Z. ثم انقر فوق تحليل وتحليل الجسيمات لقياس الجسيمات. عندما تم تحليل جميع المكدسات Z في التركيز للعينة، إرسال العدد الإجمالي للجسيمات للعينة في جدول البيانات لتحديد العدد الإجمالي للتفاعلات.
الأجسام المضادة المستخدمة في فحص القرب محددة لليغاندس ولا تثبت أي تداخل. كما لوحظ، بروتوكول التشتت هو كفاءة عالية في الحصول على خلايا واحدة في مجال المجهر من الرؤية لتحليل المصب وتلطيخ خلية بيتا يتم الاحتفاظ بعد قياس قرب الربط في الجزر البشرية الأولية. باستخدام التقنيات التي أثبتت, يمكن تحديد أن التفاعل من بروتين بروتين تدهور مستقبلات neuregulin-1 وubiquitin-محددة الببتيداز 8 انخفض بعد التعرض لمدة 48 ساعة إلى بالميتات, تسليط الضوء على جدوى هذا الفحص لتقييم العوامل الرئيسية الميتومائية الذاتية التالية المحفزات diabetogenic.
إن التشتت الفعال واللطيف للرقيات البشرية أمر ضروري لضمان القياس الكمي لفئات الخلايا الصحيحة في المصب. جيش التحرير الشعبي يسمح لتقييم مجمعات الميتوفاي الهامة في عينات الجزر البشرية مما يسمح لتحليل عينات المرضى البشرية الميتوفاتية والبيولوجية الهامة نقل مجال أبحاث السكري إلى الأمام.
