يصف هذا البروتوكول نهجًا سريعًا بديلًا لفرز إفراز الأنسولين من خطوط خلايا بيتا لتسريع اكتشاف الأدوية وتوصيفها. هذا النهج مفيد لأنه يمكن اختبار علاجات متعددة في وقت واحد ، والنتائج متوفرة مباشرة بعد التجربة ، وهذا الفحص أكثر بأسعار معقولة من غيرها. تطبيق هذه الطريقة نحو فحص لتعديلات جزيء صغيرة جديدة من إفراز الأنسولين قد تحدد مركبات الرصاص لعلاجات مرض السكري في المستقبل.
زيادة المعرفة من وظيفة الخلية بيتا يمكن أن تسهم في فهم أكبر للبروتين أو إفراز العصبي بشكل عام. وقد أنشئت هذه المراسل إفراز الأنسولين للعمل في نظام العدين في خطوط خلايا بيتا الأخرى والجزر في الإنسان. وينبغي أن يكون هذا الفحص مباشرة جدا للأفراد على دراية بثقافة الخلية وتشغيل ماصات متعددة القنوات.
قبل التخطيط لأي تجارب، تحقق من أن خطوط خلايا بيتا الأبوية أو المستقرة تستجيب بشكل صحيح للجلوكوز باستخدام الأنسولين ELISA. تبدأ من خلال إعداد كريبس رينجر Bicarbonate العازلة أو KRBH وgassia لوسيفيراز حل العمل وفقا لاتجاهات المخطوطة. يمكنك زراعة خلايا MIN6 في قارورة T75 باستخدام تقنيات ثقافة الخلايا القياسية.
إعداد خلايا INSGLuc MIN6 للطلاء عن طريق غسل قارورة 1 من الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة مليلترين من التربسين. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا، أو حتى الخلايا تنفصل عن القارورة. تحديد تركيز الخلايا وتمييع الخلايا في وسائل الإعلام الكاملة إلى مليون خلية لكل ملليلتر، وهو ما يعادل 100،000 خلية لكل 100 ميكرولترات في كل بئر من 96 بئر.
الخلايا ينبغي أن تكون التقاء بما فيه الكفاية للم مقايسة بعد ثلاثة إلى أربعة أيام. في يوم الفحص ، أعد ما يكفي من الجلوكوز مجانا KRBH للتجربة واقامة خزان. Decant المتوسطة من لوحة 96 جيدا عن طريق عكس بسرعة على بالوعة المختبر ومن ثم النشاف بحزم على كومة من المناشف الورقية لإزالة المتوسطة الزائدة.
اغسل الطبق مرتين مع 100 ميكرولترات من الجلوكوز مجانا KRBH في كل بئر، وإذا كان أداء العلاجات المخدرات، إضافة الأدوية إلى KRBH وفقا لاتجاهات المخطوطة. ثم، إضافة 100 ميكرولترات من الجلوكوز KRBH الحرة إلى كل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وتخرق العازلة ولطخة لوحة على منشفة ورقية.
إضافة 100 ميكرولترات من الجلوكوز KRBH الحرة في بئر لغسل أي خلفية المتراكمة ومن ثم decant لوحة. إضافة السيطرة والظروف المحفزة مع أو بدون العلاجات الدوائية في 100 ميكرولترس في البئر واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. من المهم تضمين عناصر تحكم أساسية ومحفزة على كل لوحة من أجل تحديد استجابة الخلايا في تجربة معينة.
إذا كانت الخلايا قد فقدت استجابتها مع مرور الوقت، وإعادة استزراعها من مخزون النيتروجين السائل الطازج. جمع بعناية 50 ميكرولترات من السوبر باستخدام ماصة متعددة القنوات، ونقلها إلى لوحة 96 مُعَسَن أبيض مبهم، والحفاظ على العينة في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء حتى تصبح جاهزة لم مقايسة لوسيفراز. إعداد حل عمل الشاشية لوسيفراز من خلال الأنابيب الكمية المطلوبة من حل CTZ في العازلة جلوك المقايسة، مع الحرص على منع CTZ من الاحترار.
استخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة بسرعة محلول عمل GLuc إلى لوحة مع KRBH supernatants. إذا كان هناك أي قطرات على جانبي الآبار، تدور لفترة وجيزة لوحة في سطح الطاولة، سوينغ دلو الطرد المركزي. ثم وضع لوحة في قارئ لوحة وقراءة الإنارة مع وقت التكامل 0.1 ثانية.
وقد تم اختبار هذا الفحص في ظل ظروف التحكم عن طريق قياس إفراز الأنسولين كاستجابة لزيادة تركيزات الجلوكوز. لوحظ القليل جدا من النشاط السري أقل من خمسة الجلوكوز ميليمولار, ويلاحظ زيادة إفراز فوق ثمانية ملليمتر. تظهر الخلايا استجابة إفرازية المتوقعة عندما تحدى مع نموذج الديازوكسيد.
يمنع علاج الديازوكسي إفراز الأنسولين إذا لم يكن هناك كلوريد البوتاسيوم خارج الخلية. عندما كلوريد البوتاسيوم موجود، يمكن تضخيم إفراز مع إضافة مزيد من الجلوكوز. وقد ثبت أيضا أن الخلايا MIN6 InsGLuc تستجيب كما هو متوقع لإفراز مركبات تحوير مثل كلوريد البوتاسيوم, الديازوكسيد, PMA, وإبينفرين.
بعد هذا الإجراء، ينبغي تأكيد النتائج الحرجة عن طريق تحليل KRBH supernatants في الأجسام المضادة القائمة ELISA أو HTRF المقايسات التي تسمح لتحديد تركيزات الأنسولين. وقد قامت مجموعة في المعهد العريض بالكثير من الأعمال الرائدة، مما مهد الطريق لي لاستخدام هذا الفحص بشكل متزايد في بحثي. العديد من المجموعات البحثية بما في ذلك لنا والمجموعة في برود، وتستخدم هذا النهج في جهود اكتشاف المخدرات في مجال مرض السكري.
