فإن الكتاب أود أن أشكر نانسي مورا للحصول على المساعدة الفنية لها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المنح البحثية 48573-M و168098 من المجلس الوطني دي بحوث والتكنولوجيا ذ Ciencia، والمكسيك، والمنح وIN212308 IN205311-2 من المديرية العامة للAsuntos ديل Academico الشخصية، الجامعة الوطنية المستقلة دي مكسيكو، المكسيك.

1. عزل العدلات (السوداء) من دم الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حوالي 20 مل دم الإنسان مع الهيبارين (10 U / مل)، وتخثر. وقد تم جمع الدم من المتطوعين الأصحاء البالغين من venopuncture. وقد أجريت جميع التجارب في إطار موافقة لجنة الأخلاقيات البيولوجية في معهد لأبحاث Biomédicas دي - UNAM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 2 مل من T500 ديكستران 6٪ في برنامج تلفزيوني في أنبوب 15 مل المخروطية الطرد المركزي وإضافة 10 مل من الدم. مزيج من أنبوب للقلب مرتين أو ثلاث مرات، والسماح لها الجلوس لمدة 45 دقيقة للسماح للترسيب كريات الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الطازجة المخروطية وضع 5 مل Ficoll-Paque. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ البلازما الغنية الكريات البيض التي شكلت كرات الدم الحمراء أعلاه sedimented، وماصة بعناية على أعلى من Paque-Ficoll تشكيل طبقة ثانية. تأكد من عدم ومرحلتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 516 x ج لمدة 20 دقيقة في C. ° 4 بعد الطرد المركزي، في الطور البيني من البلازما وFicoll Paque-هناك طبقة من الخلايا وحيدات النوى. شمال شرقutrophils هي في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القضاء طاف، كسر بيليه الخلية من خلال الاستفادة من أنبوب ضد الرف، و resuspend الخلايا بإضافة 10 مل من البرد (4 ° C) PBS ملاحظة: Resuspending الخلايا عن طريق pipetting صعودا ونزولا غير مستحسن لأن هذا هو أيضا تضر الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى التعليق أنبوب 50 مل المخروطية الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي الى 290 XG لمدة 5 دقائق في C. ° 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر بيليه الخلية كما في السابق وإضافة 10 مل من البرد (4 ° C) حل ناقص التوتر (0.2٪ كلوريد الصوديوم، 1٪ BSA، و 20 ملي Hepes، ودرجة الحموضة = 7.4) لكرات الدم الحمراء ليز. مزيج من دوامات الأنبوب بلطف باليد لدقيقة واحدة بالضبط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من البرد (4 ° C) حل مفرط التوتر (1.6٪ كلوريد الصوديوم، 1٪ BSA، و 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة = 7.4)، ومزيج عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (عادة&gt; 95٪ هي PMN). ملاحظة: حافظ على أنبوب مع التعليق الخلية على الجليد بينما عد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل و resuspend في 10 PMN7 خلية / مل في البرد (4 ° C) PBS. تبقي على الجليد. ملاحظة: العدلات تبقى قابلة للحياة وظيفية في 4 درجات مئوية لمدة حوالي 6 إلى 8 ساعات. </li></ol> 2. تفعيل PMN <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 100 ميكرولتر من التعليق PMN (1 × 10 7 خلية / مل) في أنبوب إيبندورف 1،5 مل. ملاحظة: يجب أن يتم أنابيب العينات على الأقل في التكرارات. يجب أن تشمل الضوابط السلبية المعتادة الضد الأول فقط، والأجسام المضادة الثانوية فقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة مستقبلات المقابلة المضادة للإنتغرين أو المضادة وحيدة النسيلة FC-(ماب) في 10 ميكروغرام / مل واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PMN بإضافة 1 مل من البرد (4 ° C) PBS، الطرد المركزي في 1743 x ج (4،500 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج، وطاف الشفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر بيليه الخلية من خلال استغلال الجزء السفلي من أنبوب ضد الرف، إضافة 1 مل PBS الباردة، ويغسل مرتين أخريين كما في الخطوة السابقة. ملاحظة: هذه الأجسام المضادة يغسل إزالة غير منضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق PMN في نفسه (فيitial) حجم الدافئة (37 ° C) PBS تحتوي على 60 ميكروغرام / مل من F (&#39;AB) 2 الماعز المضادة للمفتش الماوس. ملاحظة: إن الأجسام المضادة الثانوية مفتش مكافحة الماوس سوف ربط الأجسام المضادة المضادة للمستقبلات الأولى وسوف يسبب يشابك من مستقبلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في C ° 37 لمدة 1 20 دقيقة، اعتمادا على عامل النووية المثيرة للاهتمام. لNF-كيلوبايت 15 دقيقة عادة، وعادة ما إلك-1 5 دقائق. ملاحظة: احتضان الخلايا في 37 درجة C يحفز مستقبلات يشابك، والتي لا يمكن أن يتم في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل PBS الباردة وأجهزة الطرد المركزي 3 دقائق في 1743 XG في ميكروسنتريفوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد PMN فورا في حمام dry-ice/ethanol والاحتفاظ بها هناك لمدة 10 دقيقة. </li></ol> 3. العزلة وتثبيت نوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه PMN المجمدة في 100 ميكرولتر الباردة (4 ° C) ناقص التوتر العازلة (HEPES 10 مم، 10 ملي بوكل، 1.5 ملم MgCl 2، و 1 ملم المضافة حديثا DL-dithiothreitol [DTT]؛ درجة الحموضة = 7.9). فمن المستحسن أن تتخذ أنابيب من حمام dry-ice/ethanol واحدا تلو الآخر، وامسحي الجزء السفلي من الأنبوب قبل إضافة العازلة ناقص التوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على الجليد، والتحقق من سلامتها من تلطيخ نواة لقسامة من التعليق نوى مع الأزرق التريبان. نوى تبدو مستديرة والأزرق. لا PMN سليمة الحصول على الملون، والحطام الخلية يظهر الجسيمات الزرقاء شكل غير منتظم. ملاحظة: إذا نوى التعليق يحتوي على خلايا سليمة أو العديد من الحطام، فمن الأفضل لتجاهل إعداد وكرر الإجراء مع عينة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في نوى XG 775 (3،000 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج لمدة 10 دقيقة داخل غرفة باردة. في هذه المرحلة هي نواة ينبغي الحرص هشة للغاية وغير في الحفاظ على عينات الباردة وليس الطرد المركزي في قوات المفرطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بواسطة pipetting حذرين للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لإصلاح النوى. ملاحظة: بيليه هو فضفاض جدا علىد مضيفا المخزن المؤقت يكفي ل resuspend نواة. وينبغي تجنب pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunolabel نواة لالتدفق الخلوي أو الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى 24 ساعة في 4 درجات مئوية. </li></ol> 4. Immunolabeling نواة لتحليل قياس التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1743 x ج النوى (4،500 دورة في الدقيقة) في ميكروسنتريفوج لمدة 1 دقيقة، وإزالة طاف بواسطة pipetting لطيف جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من البرد (4 ° C) 0.1٪ تريتون X-100، بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لpermeabilize نوى. احتضان في الثلج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1743 نوى permeabilized XG في ميكروسنتريفوج وإزالة بعناية طاف. في هذه المرحلة نواة الكريات لا نعلق جيدا في الجزء السفلي من الأنبوب. فمن المستحسن أن أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى إذا كان بيليه يحصل فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق نوى في 500 ميكرولتر من الدم البارد الجنين 4٪ البقري (FBS) في برنامج تلفزيوني لحجب المواقع غير محدد ملزم، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. نبذنوى في 1743 x ج لمدة 3 دقائق في ميكروسنتريفوج وإزالة بعناية طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق نوى في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على 4٪ FBS و 2.5 ميكروغرام / مل من ماب ضد العامل النووي في المصالح. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. ملاحظة: يجب أن تشمل الضوابط السلبية المعتادة المناهضة للاسلحة النووية الأجسام المضادة العامل الوحيد، والتي تحمل علامات فقط FITC الضد الثانوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 4٪ والطرد المركزي في 1743 x ج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بعناية فائقة، نوى resuspend في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة التي تحتوي على 4٪ FBS و 10 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة التي تحمل علامات المقابلة FITC الثانوية، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرتين مع 500 نواة ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة مع FBS 4٪ كما في الخطوة السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق نوى في 400 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني. يتم وضع النواة في بارافورمالدهيد للسماح ليتم تخزينها العينة لعدة أيام دون تلوث: مذكرةالمشاكل التي يمكن أن تحدث في وجود المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل التدفق الخلوي مباشرة أو تخزينها في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام. </li></ol> 5. تدفق الخلوي تحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نوى immunolabeled في قياس التدفق الخلوي مثل هذا FACScan (بيكتون ديكنسون، فرانكلين البحيرات، NJ) أجهزة أو ما شابه ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط إعدادات اقتناء إلى: FSC في النطاق سجل في 10-1، SSC في النطاق سجل في 196، ونوى بوابة في مؤامرة دوت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على 10000 نواة لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل مضان FITC من الملطخة نوى من خلال قناة FL-1 (506 نانومتر) وضعت في النطاق سجل في 400. </li></ol>

<ol>
	<li>Sendo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+neutrophil+apoptosis:+its+biological+significance+in+inflammation+and+the+immune+response.">Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response.</a> Human Cell. 9, 215-222 (1996).</li><li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils,+from+marrow+to+microbes.">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li><li>Naussef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+human+neutrophils+kill+and+degrade+microbes.+An+integrated+view.">How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view.</a> Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).</li><li>Scapini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neutrophil+as+a+cellular+source+of+chemokines.">The neutrophil as a cellular source of chemokines.</a> Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).</li><li>Hamilton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+stimulus-specific+mechanisms+for+post-transcriptional+control+of+neutrophil+chemokine+gene+expression.">Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression.</a> J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).</li><li>Simon, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+apoptosis+pathways+and+their+modifications+in+inflammation.">Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation.</a> Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).</li><li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neutrophil+apoptosis.">Molecular control of neutrophil apoptosis.</a> FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).</li><li>Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulating+neutrophil+apoptosis:+new+players+enter+the+game.">Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game.</a> Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).</li><li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Death+and+NF-&#954;B+in+T+cell+activation:+life+at+the+edge.">Death and NF-&#954;B in T cell activation: life at the edge.</a> Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).</li><li>Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+JNK+signaling+to+NF-&#954;B:+a+key+to+survival.">Linking JNK signaling to NF-&#954;B: a key to survival.</a> J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).</li><li>Valente, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+increases+camptothecin-induced+apoptosis+by+inhibition+of+NF-&#954;B.">TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-&#954;B.</a> Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).</li><li>Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+NF-&#954;B+by+a+TAT-NEMO-binding+domain+peptide+accelerates+constitutive+apoptosis+and+abrogates+LPS-delayed+neutrophil+apoptosis.">Inhibition of NF-&#954;B by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis.</a> Blood. 102, 2259-2267 (2003).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+neutrophil+apoptosis+by+type+1+IFN+depends+on+cross-talk+between+phosphoinositol+3-kinase,+protein+kinase+C-d,+and+NF-&#954;B+signaling+pathways.">Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-&#954;B signaling pathways.</a> J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).</li><li>Garcia-Garcia, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+factor+activation+by+Fc&#947;R+in+human+peripheral+blood+neutrophils+detected+by+a+novel+flow+cytometry-based+method.">Nuclear factor activation by Fc&#947;R in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method.</a> J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).</li><li>Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fc&#947;RIIA+and+Fc&#947;RIIIB+mediate+nuclear+factor+activation+through+separate+signaling+pathways+in+human+neuthophils.">Fc&#947;RIIA and Fc&#947;RIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils.</a> J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم المصالح المتنافسة المالية.

طريقة تنقية صفها هنا يسمح للعزل العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (عن طريق الملاحظة المجهرية المقررة)، في وقت قصير. يمكن في بعض الأحيان أن تكون ملوثة من قبل العدلات الكريات الحمراء إذا لم يتم هذا الأخير هي lysed تماما. هذا لا يؤثر عادة هذه التقنية، يمكن بسهولة من...

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي 1. العدلات خلال الالتهاب والعدوى هي الخلايا الأولى لتظهر في موقع المتضررة حيث يكون بمثابة خط الدفاع الأول 2. العدلات تمتلك آليات عدة مضادات الميكروبات 3 بما البلعمة، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي بواسطة تحبب، وإنتاج السيتوكينات proinflammatory 4،5. العدلات هي خلايا قصيرة الأجل التي تحصل بسرعة من خلال تفعيل الإشارات من مختلف مستقبلات سطح الخلية. وعلى الرغم من اعتبار العدلات الخلايا الطرفية بسبب حياتهم القصيرة والخضوع لأنهم موت الخلايا المبرمج إلا إذا تفعيلها خلال عملية الالتهاب 6، فمن الواضح الآن أن يتمكنوا من تعديل النمط الظاهري أيضا عن طريق تغيير مستوى النسخ جينات معينة. إنتاج السيتوكينات (5) وتثبيط الخلايا نوعان من 7،8 طmportant وظائف الخلية التي تعتمد على تفعيل تنظيم على مستوى النسخ في العدلات. النووية كيلوبايت عامل (NF-كيلوبايت) تشارك في السيطرة النسخي من 4 وإنتاج السيتوكينات في تنظيم بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج في 9-11 أنواع الخلايا المختلفة. يتم دراسة مسارات الإشارات عادة التي تؤدي إلى تنشيط العامل النووي من الجينات مراسل المقايسات أو عن طريق فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA). ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا يتم تنفيذ المقايسات مع الجينات مراسل، حيث لا توجد تقنيات فعالة لترنسفكأيشن العدلات. وقد استخدمت المقايسات EMSA في العدلات لاستكشاف النووية تفعيل عامل 12،13، ولكن هذه المنهجية هي معقدة ومكلفة لأنه ينطوي على استخدام المواد المشعة. Nucleofection هو أسلوب آخر التي استخدمت ناجحهLLY لبالنقل حيدات 14. وهكذا، على الأقل من الناحية النظرية، يمكن أن الكشف عن تفعيل النووية عامل في العدلات من ترنسفكأيشن (على الرغم من انخفاض الكفاءة). ومع ذلك، فإن هذه التقنية أن تكون أكثر تكلفة، تستغرق وقتا طويلا وربما أقل كمية. ويمكن أيضا تحليل مجهري للخلايا immunostained أن تستخدم لكشف العوامل النووية في النواة. في الواقع، لقد اكتشفنا NF-كيلوبايت إزفاء إلى النواة بهذه الطريقة 15. للأسف، هذا الأسلوب هو أيضا تستغرق وقتا طويلا، كمية أقل، وتخضع للانحياز المراقب. هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا عن طريق integrins أو مستقبلات التيسير مع مستقبلات الأجسام المضادة المضادة لل، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى (Figure 1). وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-15 و إلك كيلوبايت-1 16 العوامل النووية في نوى العدلات. حساسية هذا الأسلوب يسمح الكشف عن التغيرات الصغيرة في مستويات عامل النووي في النواة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتحليل مستوى عوامل النسخ في النواة من أنواع الخلايا الأخرى.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Heparin </td>
 <td >PiSA (Mexico)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Dextran T500</td>
 <td >Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) </td>
 <td>T1-Dextran T500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ficoll-Paque</td>
 <td >Pharmacia</td>
 <td>17-0320-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium chloride </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S7653 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate monobasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate dibasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9390</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>A2153</td>
 <td>Cohn Fraction V</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >HEPES</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>H3375 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Potassium chloride</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P9541 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Magnesium chloride anhydrous </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>M8266 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >DL-dithiothreitol (DTT) </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>D9163</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Trypan Blue (0.4 % solution)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Paraformaldehyde</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P6148 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Triton X-100 </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>X100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Fetal bovine serum (FBS)</td>
 <td >GIBCO</td>
 <td>10437-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IV.3</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>025-1 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRII (CD32) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody 3G8</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>028-2 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRIII (CD16) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody TS2/16</td>
 <td >Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) </td>
 <td>Donated by Dr. Martin Hemler </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;1 integrin (CD29)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IB4</td>
 <td >University of California, San Francisco </td>
 <td>Donated by Dr. Eric J. Brown </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;2 integrin (CD18)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >F(ab')2 goat anti-mouse IgG </td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55468</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55665</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p50</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-114</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p65</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-109</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430291</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge, Sorvall Tabletop</td>
 <td >Dupont Instruments</td>
 <td>RT 6000D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH-meter</td>
 <td >Corning</td>
 <td>340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-20</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-200</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123601</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-1000</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hemocytometer</td>
 <td >Fisher Scientific</td>
 <td>0267110</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>Eclipse E600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>TMS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Bath Incubator</td>
 <td >Fisher Scientific </td>
 <td>2IS-M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5414C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5418</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flow Cytometer</td>
 <td >Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) </td>
 <td>FACScalibur </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي. هذه الخلايا هي الأولى في الظهور في مواضع الالتهابات والعدوى، وبذلك أصبحت خط الدفاع الأول ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. العدلات المضادة للجراثيم التي تمتلك وظائف هامة مثل البلعمة، وإطلاق سراح من الإنزيمات التحللي، وإنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية. وبالإضافة إلى هذه المهام مهمة الدفاع، العدلات أداء مهام أخرى في الاستجابة للإصابة مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. السيتوكينات تجنيد الكريات البيض الأخرى التي تساعد مسح العدوى، وتثبيط الخلايا العدلة يسمح للعيش لفترة أطول في موقع العدوى. وينظم هذه الوظائف على مستوى النسخ. ومع ذلك، لأن العدلات هي خلايا قصيرة العمر، لا يمكن دراسة الاستجابات ينظم transcriptionally في هذه الخلايا أن يؤديها مع الطرق التقليدية الجينات مراسل حيث لا توجد ايفيآاف لتقنيات ترنسفكأيشن العدلات. هنا، نقدم طريقة بسيطة وفعالة تسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى معزولة وimmunolabeled بواسطة التدفق الخلوي. وصفنا تقنيات لعزل العدلات نقية من الدم المحيطي الإنسان، وتحفيز هذه الخلايا المضادة للمستقبلات الأجسام المضادة، وعزل نواة immunolabel، وتحليل التدفق الخلوي من قبل النوى. وقد استخدمت بنجاح الأسلوب للكشف عن NF-كيلوبايت وإلك-1 العوامل النووية في نوى من العدلات وأنواع الخلايا الأخرى. وبالتالي، هذا الأسلوب يمثل خيارا لتحليل تفعيل عوامل النسخ في النواة معزولة من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

طريقة تنقية صفها هنا عادة ما يوفر العدلات unstimulated (السوداء) مع نقاء أكبر من 95٪ (الشكل 1A). ويمكن بعد ذلك أن PMN معزولة يحفزه مستقبلات خاصة يشابك مع الاجسام المضادة المحددة. حفزت مستقبلات نحن PMN من خلال التيسير وintegrins (1B الشكل). حفز مرة واحدة، وهي lysed PMN ويتم ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry at JoVE.com

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم. العدلات التي تمتلك وظائف ينظم transcriptionally مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. يمكن دراسة هذه الوظائف مع أسلوب المعروضة هنا، والذي يسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى التدفق الخلوي معزولة

طريقة بسيطة وفعالة لكشف النووية في تفعيل عامل العدلات الإنسان من قياس التدفق الخلوي

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

a-simple-efficient-method-to-detect-nuclear-factor-activation-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Views.  University of Alberta. العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم. العدلات التي تمتلك وظائف ينظم transcriptionally مثل إنتاج السيتوكينات proinflammatory و تثبيط الخلايا. يمكن دراسة هذه الوظائف مع أسلوب المعروضة هنا، والذي يسمح الكشف وتقدير من العوامل النووية في نوى التدفق الخلوي معزولة

Video: A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

التقييم الكمي لخلايا المناعة في الأنسجة النخاع الشوكي المصاب بواسطة التدفق الخلوي : رواية عن استخدام أسلوب خلية تنقية

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

دراسة التوتة اختيار الإيجابية والسلبية من قياس التدفق الخلوي

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

التصوير المباشر لآخر مضاد من قبل العدلات الإنسان الأساسية وحيدات في الاستجابة لل<em&gt; A. فوميجاتوس</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

وصف مجموعات فرعية الوحيدات البشرية بالدم كله يتدفق التحليل الخلوي

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...