저자는 그녀의 기술 지원을 위해 낸시 모라 감사드립니다. 이 작품은 Consejo Nacional 드 Ciencia Y Tecnologia, 멕시코에서 연구 보조금 48,573-M과 168,098 의해 보조금 IN212308 및 IN205311-2 Direccion에서 일반 드 Asuntos 델 개인 Academico, Universidad Nacional Autonoma 드 멕시코, 멕시코에 의한 자금을 지원했다.

1. 인간의 피에서 호중구의 절연 (PMN) <ol><li> 항응고제로 헤파린 (10 U / ML)로 약 20 ML 인간의 피를 사용하십시오. 피 venopuncture으로 성인 건강 자원 봉사자로부터 수집되었다. UNAM - 모든 실험은 Instituto 드 Investigaciones Biomédicas의 생명 윤리위원회의 승인하에 수행되었다. </li><li> 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 PBS에서 6% dextran T500의 2 ML을 넣고 혈액의 10 ML를 추가합니다. 반전 지하철로 두 세 번 혼합하고 적혈구 침강을 할 수 있도록 45 분에 앉아 보자. </li><li> 신선한 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브의 5 ML Ficoll-Paque두고. </li><li> sedimented 적혈구 위에 형성 백혈구 풍부한 플라즈마을 가지고, 신중하게 두 번째 층을 형성 Ficoll-Paque 상단에 피펫. 두 단계가 있는지 확인합니다. </li><li> 4 ° C.에 20 분에 516 XG에 원심 분리기 원심 분리 한 후, 플라즈마 및 Ficoll-Paque의 계면에서 mononuclear 세포의 층이 있습니다. NEutrophils는 튜브의 하단에 있습니다. </li><li> 표면에 뜨는을 제거, 선반 위에 튜브를 활용하여 세포 펠렛을 아프게하고, 감기의 10 ML (4 ° C) PBS 참고 추가하여 세포를 resuspend :. 최대 pipetting하여 세포를 Resuspending이 너무이기 때문에 다운이 권장하지 않습니다를 세포에 손상. </li><li> 4 ° C.에서 5 분 동안 290 XG에서 50 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 전송 </li><li> 이전처럼 세포 펠렛을 부숴 10 감기 ML (4 ° C) 적혈구를 lyse 할 수 hypotonic 솔루션 (0.2 % NaCl, 1 % BSA, 20 MM Hepes, 산도 = 7.4).을 추가 정확히 1 분 손으로 부드럽게 관을 회전하여 섞는다. </li><li> 10 감기 ML (4 ° C) hypertonic 솔루션 (1.6 % NaCl, 1 % BSA, 20 MM HEPES, pH를 = 7.4), 믹스와 hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다 (일반적으로&gt; 95 %는 PMN합니다.)을 추가 참고 : 셀을 계산하는 동안 얼음에 세포 현탁액으로 관을하세요. </li><li> 이전처럼 원심 분리기와 10 PMN을 resuspend추위 7 셀 / ML (4 ° C) PBS. 얼음 계속. 참고 : 호중구는 4에서 가능한 및 기능 유지 8-6에 대한 시간에 대한 ° C. </li></ol> 2. PMN 활성화 <ol><li> 100 PMN의 정지 μl (1 × 10 7 셀 / ML) 1.5 ML Eppendorf 튜브에. 놔 참고 : 샘플 튜브가 최소 중복으로 수행해야합니다. 대개 부정적인 컨트롤은 만 사용 항체, 및 보조 항체를 포함해야합니다. </li><li> 10 μg / ML에서 해당 항 인테그린 또는 안티 FC 수용체 단클론 항체 (적인 mAb)를 추가하고 15 분에 얼음에 품다. </li><li> 한 감기 ML (4 ° C) PBS, microcentrifuge에서 1,743 XG (4,500 RPM)에서 centrifuging하고 표면에 뜨는을 aspirating.을 추가하여 PMN을 씻으십시오 </li><li> 랙에 대한 관의 하단을 클릭하여 세포 펠렛을 부숴, 1 ML 차가운 PBS를 추가하고 두 번 이전 단계에서와 같이을 씻는다. 참고 :이 언 바운드 항체를 제거 씻는다. </li><li> 동일한에 Resuspend의 PMN (에따뜻한의 itial) 볼륨 (37 ° C) PBS는 F의 60 μg / ML (AB &#39;) 2 염소 안티 - 마우스 IgG를 포함하는. 참고 : 보조 안티 마우스 IgG 항체가 첫 번째 반 수용체 항체에 바인딩되며, 수용체의 crosslinking가 발생합니다. </li><li> 관심 핵 요인에 따라 1-20 분에 대해 37 ° C에서 알을 품다. NF-κB 보통 15 분을 위해, 그리고 보통 엘크-1 5 분에. 참고 : 37에서 셀을 잠복기가 4시에 개최 할 수 없습니다 ° C 유도 수용체 crosslinking, ° C. </li><li> 한 ML 차가운 PBS를 추가하고 microcentrifuge에서 1,743 XG에서 3 분 원심 분리기. </li><li> 표면에 뜨는 제거 </li><li> dry-ice/ethanol 욕조에서 즉시 PMN 10 분 동안 거기를 유지 멈춰 봐. </li></ol> 3. 핵의 절연 및 고정 <ol><li> 100 μl 추위에 Resuspend 냉동 PMN 펠릿 (4 ° C) hypotonic 버퍼 (10 MM의 HEPES, 10 MM KCl, 1.5 MM MgCl 2, 1 ㎜ 갓 부가 DL-dithiothreitol [DTT], 산도 = 7.9). 그것은 하나 dry-ice/ethanol 욕조 하나의 튜브를 꺼내하고, hypotonic 버퍼를 추가하기 전에 관의 바닥을 청소 닦아 것이 좋습니다. </li><li> 얼음에 장소, 그리고 trypan 파랑과 핵 정지의 나누어지는 얼룩에 의해 핵의 무결성을 확인합니다. 핵은 원형과 파란색 봐. 그대로 PMN는 물들, 그리고 세포 파편이 불규칙 모양의 푸른 색 입자로 표시되지 않습니다. 참고 : 핵 서스펜션은 많은 손상 셀이나 먼지가 포함 된 경우는 준비를 버리고 다른 샘플과 절차를 반복하는 것이 좋습니다. </li><li> 감기 객실 내 10 분에 microcentrifuge에 775 XG (3,000 RPM)에서 핵을 원심 분리기. 이 포인트 핵에서 매우 약한 및 엑스트라 케어 샘플은 추위와 과도한 힘에 centrifuging하지 유지에서 촬영해야합니다. </li><li> 아주 조심 pipetting하여 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 핵 문제를 해결하기 위해 PBS에 찬 4 % paraformaldehyde 100 μl를 추가합니다. 참고 : 펠렛은 매우을 상실합니다D 버퍼를 추가하면 핵을 resuspend에 충분하다. 아래로 Pipetting하며 피해야한다. </li><li> 20 분에 얼음에 품다. </li><li> Immunolabel의 유동 세포 계측법을위한 핵 또는 4에서 최대 24 시간까지 위해를 유지 ° C. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 분석을위한 핵의 Immunolabeling <ol><li> 1 분에 microcentrifuge에서 1,743 XG (4,500 RPM)에서 핵을 원심 분리기, 매우 부드러운 pipetting하여 표면에 뜨는 제거합니다. </li><li> 100 감기 μl (4 ° C) 0.1 % 트리톤 X-100, 핵을 permeabilize하기 위해 PBS에 4 % paraformaldehyde.을 추가 10 분 동안 얼음에 품다. </li><li> 원심 분리기는 microcentrifuge에서 1,743 XG에서 핵을 permeabilized 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. 이 시점에서 핵 알약은 튜브의 하단에 잘 부착하지 않습니다. 이 펠릿을 떨어 도착하면 다시 원심 분리기하는 것이 좋습니다. </li><li> 특이 현상 바인딩 사이트를 차단하고 20 분에 얼음을 품다하기 위해 PBS에 찬 4% 태아 소 혈청 (FBS) 500 μl에 Resuspend 핵. 원심 분리기1743의 핵은 microcentrifuge에서 3 분 동안 XG 조심스럽게 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 4퍼센트 FBS와 2.5 μg / 관심의 핵 요소에 대한적인 mAb의 ML을 포함하는 차가운 PBS 100 μl에 핵을 Resuspend. 20 분에 얼음에 품다. 참고 : 대개 부정적인 컨트롤은 안티 핵 인자 항체를 포함 FITC-라벨 차 항체 만합니다. </li><li> 4퍼센트 FBS와 3 분에 1,743 XG에서 centrifuging과 차가운 PBS 500 μl를 두 번 씻으십시오. </li><li> 4퍼센트 FBS 및 10 μg / 해당 FITC-라벨 차 항체의 ML을 포함하는 차가운 PBS 100 μl에, 아주 조심 resuspend 핵을 표면에 뜨는을 제거하고, 20 분에 얼음에 품다. </li><li> 이전 단계에서와 같이 4퍼센트 FBS와 차가운 PBS 500 μl를 두 번 핵을 씻으십시오. </li><li> PBS의 추운 4 % paraformaldehyde 400 μl에 핵을 Resuspend. 참고 : 핵은 샘플이 오염없이 며칠 동안 저장 될 수 있도록 paraformaldehyde에 배치됩니다혈청의 면전에서 발생할 수있는 문제. </li><li> 최대 3 일에 4에 유동 세포 계측법이나 어둠 속에서 매장 ° C에서 즉시 분석 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 또는 이와 유사한 장치, 흐름 cytometer 같은 FACScan (프랭클린 호수, NJ Becton 디킨슨)에 immunolabeled 핵을 분석합니다. </li><li> 196에서 로그 스케일에서 SSC, 그리고 점 플롯의 게이트 핵, 10-1에서 로그 스케일로 FSC :에 수집 설정을 조정합니다. </li><li> 샘플 당 만 핵을 습득. </li><li> 400 로그 스케일로 설정 FL-1 채널 (506 nm 정도)를 통해 FITC-스테인드 핵의 형광을 분석합니다. </li></ol>

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제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

여기에 설명 된 정화 방법은 짧은 시간에 95 % (현미경 관찰에 의해 평가)보다 큰 결함이있는 unstimulated 호중구의 분리 (PMN)를 할 수 있습니다. 후자가 완전히 lysed되지 않은 경우 때때로 호중구는 적혈구에 의해 오염 될 수 있습니다. 적혈구와 PMN 쉽게 유동 세포 계측법에 의해 서로 다른 세포 집단으로 구별 할 수 있기 때문에 이것은 보통, 기술에 영향을주지 않습니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 사실, PMN은 또한 약리 방법이나 다양한 기판 또는 다른 셀에 부착하여 자극 할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법은 세포가 실질적으로 관련 생물학적 자극에 의​​해 활성화 된 후 PMN 핵의 핵 요인의 변화로 이어질 신호 경로를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. PMN이 자극되면이 문서에 설명 된 방법은 신속하고 effici이 가능immunofluorescence 및 유동 세포 계측법 분석에 의한 NF-κB의 이러한 핵의 핵과 탐지를위한 다닐 정화. 특정 수용체의 PMN의 자극 후에는 세포질에 NF-κB은 그 억제제 IκB에서 출시 한 다음 핵 (그림 1B)에 traslocated. 따라서, NF-κB 활성화의 수준은 핵에 NF-κB 존재의 양에 의해 결정됩니다. 이 방법은 핵에 NF-κB의 양을 감지하고 측정 할 수 있기 때문에 쉽게 핵 요소의 활성화를 확인할 수 있습니다. 자신의 정품 인증이 핵 수준의 변화에​​ 연결되어 때 방법은 비슷한 방식으로 다른 핵 요소의 활성화를 검색 할 수 있습니다. 가의 경우와 같이, 또는 요소의 분자 구조에 이러한 인산화 등의 변경, 핵 요인의 변경 사항을 활성화하면이 NF-KB의 경우와 같이, 핵의 요소 존재의 양의 변화로 인해 수 있습니다 엘크 - 1. 이 방법은 C를 감지하는 데 사용할 수 있습니다특정 항체를 사용할 수있는 모든 분자의 핵 수준의 hanges. 이 방법은 간단하고 빠른 방법으로 순수한 핵 인구를 산출. 세포는 세포가 열려 파열 및 손상 핵을 떠난 hypotonic 버퍼에 냉동과 lysed 있습니다. 그대로 PMN 또는 격리 된 핵은 일반적으로 유동 세포 계측법 점 플롯 그래프에서 두 개의 인구로 나타납니다. 세포와 핵은 그대로 전지 및 절연 핵에 대해 서로 다른 문을 만들어 독립적으로 분석 할 수 있습니다. 그대로 세포 샘플에서는 게이트는 대부분의 세포가 나타나는 주변 생성됩니다. 마찬가지로, 핵 샘플과 게이트는 대부분의 핵이 표시 주변 생성됩니다. 일반적으로이 두 문은 점 플롯 그래프의 다른 장소에 있습니다. 때때로 이러한 문에서 검출 입자는, 보통 셀 또는 핵 쓰레기 있으며, 그들은 분석 밖으로 남아 있습니다. 세포와 핵 문이 겹칠 경우, 그것은 일반적으로 핵 준비는 CLE하지 않다는 것을 의미합니다. 이 핵 준비의 분석 신뢰할 수 없습니다, 그것은 신선한 버퍼로 절차를 반복하는 것이 좋습니다. 방법은 인간의 PMN 함께 작동하도록 개발되었습니다,하지만 또한 성공적으로 백혈구 기원 15 다양한 세포 라인에 적용되었습니다. 방법은 쉽게 다양한 세포 유형에서 핵을 분리하도록 구성 할 수 있습니다. 그것은 효율적인 유동 세포 계측법 분석을위한 충분한 핵을 얻기 위해, 1 × 10 6 세포의 최소한의 절차를 시작하는 것이 중요합니다. 핵의 작은 번호가 끝 부분에 얻을 경우, 정기적으로 3 개 10 6 세포와 방법을 시작하는 것이 좋습니다. 용해 단계에서, 냉동 세포는 해동 할 수 없습니다해야합니다. 셀 저하로 인해 낮은 수율에있는이 발생합니다. 따라서,이 세포를 lyse 할 dry-ice/ethanol 목욕탕의 한 번에 하나의 관을하는 것이 좋습니다. 또한,이 hypotonic 용해를 추가하기 전에 관의 외부를 청소 닦아 것이 중요버퍼. 이 작업을 수행하지 않을 경우, 버퍼는 가끔 비효율적 인 세포 용해를 제공하고 그대로 세포에 의해 오염되어 핵의 준비의 결과로, 관에서 정지. 하지만,이 대부분의 경우에 그대로 세포와 핵이 유동 세포 계측법에 의해 분리 될 수 있다는 것을 감안하면 심각한 문제가되지 않습니다. 그 문제가 해결되기 전에 핵은 매우되기 때문에 얼음을 보관하여 4 ° C에서 모든 버퍼 솔루션은 추위가하는 것이 중요합니다. 표면에 뜨는을 제거 할 때 원심 분리 한 후, 핵 알약은 튜브의 하단에 때로는 느슨한 있으므로, 추가주의가되어야합니다. 이것은 더 나은 진공 흡인에 비해 micropipette으로 이루어집니다. 상황에서 튜브를 다시 centrifuged 할 수 있지만,이 손해는 핵 때문에 권장 원심 분리의 힘은 과도한 안됩니다. 방법은 감지 NF-κB의 p50 subunit (그림 2)에 특정 항체를 사용하여 활성화하고, ALSp65 subunit에게이 핵 요소의 15 O. 또한, ERK 및 엘크-1 수용체 - 시작 핵 활성화 정량화도 성공적으로 분자에 대한 해당 특정 항체를 사용하여이 방법을 16을 통해 달성되었다. 또한 FC의 약리 억제로 인해 또한 작은 integrins의 다른 유형 (그림 2)에 의한 PMN의 차동 자극에 의한 NF-κB의 핵 수준의 변화, 그리고이 방법 허용 감지의 감도는 신호 경로 16을 수용체가 시작 . 좋은 특정 항체와 효율적인 휘황 - 라벨 차 항체의 결합으로 좋은 감도를 제공하며, 핵 내부의 관심이 핵 요소의 양의 작은 변화 감지 할 수 있습니다. 이 다른 자극 조건 전후의 핵 요소의 수준 양적 비교를 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 분리 된 뉴에 감지 할 수 있습니다clei, 좋은 특정 항체를 사용할 수있는 대한 거의 모든 분자. 또한, immunolabeling 부분은 직접뿐 아니라 감성을 향상 fluorochome, 라벨이 항체를 사용하여 단순화 할 수 있습니다. 여러 가지 fluorochomes를 사용할 수 있기 때문에 마지막으로, 방법은 큰 유연성을 제공합니다. 따라서,이 방법은 핵에서 단백질 수준의 변화를 포함 여러 가지 신호 전달 연구에 적용 할 수 있습니다. 결론적으로, 본 논문에서 설명하는 방법의 광범위한 적용과 감성은 세포 유형의 다양한 핵에서 단백질 수준의 변화를 포함 신호 전달 연구를위한 간단하고 경제적 인 옵션으로 넣습니다.

호중구는 말초 혈 1의 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 염증과 감염 호중구 동안 그들은 방어 2의 첫 번째 줄의 역할을 어디에 해당 사이트에 표시 할 수있는 최초의 세포입니다. 호중구는 phagocytosis, 반응성 산소 종의 생산, degranulation의 lytic 효소의 출시, 그리고 4,5 염증성 크린 시토 킨의 생산 등 여러 가지 항균 메커니즘 3 가지고 있습니다. 호중구는 빠른 속도로 다양한 세포 표면 수용체에서 신호를 통해 작동하게 수명이 짧은 세포입니다. 호중구는 자신의 짧은 수명으로 인해 터미널 셀을 고려하여 염증 과정을 여섯 동안 활성화하지 않는 한 그들은 apoptosis를 받아야하기 때문에, 그것은 그들은 또한 특정 유전자의 전사 수준을 변경하여 자신의 표현형을 수정할 수 있도록 지금 명확되어 있지만. 크린 시토 킨 5 apoptosis 7,8의 억제의 생산은 두있다,mportant 활성화에 의존적 세포 기능은 호중구의 전사 수준에서 조절. 원자력 요소 κB (NF-κB)는 시토 킨 생산 (4)의 전사 조절과 세포 생존과 다양한 세포 유형에 apoptosis 9-11의 규정에 참여하고 있습니다. 핵 인자 활성화로 이어질 신호 경로는 일반적으로 기자 유전자 assays 또는 전기 영동 이동의 assays (EMSA)에 의한 연구하고 있습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 호중구 transfection에 대한 효율적인 기술이 없으므로 다만,이 셀에 transcriptionally 규제 응답의 연구는, 기자 유전자 assays을 수행 할 수 없습니다. EMSA의 assays는 핵 인자 활성화 12,13을 둘러 호중구에 사용 된, 그 방사성 물질의 사용을 포함하기 때문에 그러나,이 방법은 복잡하고 비용이 있습니다. Nucleofection는 successfu 사용되었습니다 또 다른 방법입니다베드로 단핵 세포 14 transfect합니다. 따라서, 적어도 이론적으로는, 핵 인자 정품 인증 (낮은 효율에도 불구하고) transfection에 의해 호중구에서 감지 될 수 있습니다. 그러나,이 기술은 더 비싼 시간이 오래 걸릴뿐 아니라 아마도 덜 정량 것이다. immunostained 세포의 현미경 분석도 핵에 핵 요소를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 사실, 우리는 핵이 방법 15로 NF-κB의 translocation를 발견했습니다. 불행하게도,이 기술은 또한 시간이 많이 걸리는 덜 양적, 그리고 관찰자의 편견에 따라 달라질 수 있습니다. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 호중구를 분리하는 기술을 설명, (F, 안티 - 수용체 항체와 integrins 또는 FC 수용체를 통해 이러한 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석igure 1). 방법이 성공적으로 NF-κB 15 호중구 핵의 엘크-1 16 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 이 방법의 감도는 핵의 핵 요소 수준의 작은 변화를 감지 할 수 있습니다. 이 방법은 다른 세포 유형에서 핵에서 전사 인자의 수준을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Heparin </td>
 <td >PiSA (Mexico)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Dextran T500</td>
 <td >Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) </td>
 <td>T1-Dextran T500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Ficoll-Paque</td>
 <td >Pharmacia</td>
 <td>17-0320-01 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium chloride </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S7653 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate monobasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9638</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Sodium phosphate dibasic</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>S9390</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>A2153</td>
 <td>Cohn Fraction V</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >HEPES</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>H3375 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Potassium chloride</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P9541 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Magnesium chloride anhydrous </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>M8266 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >DL-dithiothreitol (DTT) </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>D9163</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Trypan Blue (0.4 % solution)</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>T8154</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Paraformaldehyde</td>
 <td >Sigma</td>
 <td>P6148 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Triton X-100 </td>
 <td >Sigma</td>
 <td>X100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Fetal bovine serum (FBS)</td>
 <td >GIBCO</td>
 <td>10437-028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IV.3</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>025-1 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRII (CD32) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody 3G8</td>
 <td >Medarex (Annandale, NJ) </td>
 <td>028-2 </td>
 <td>Human-specific anti-FcRIII (CD16) </td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody TS2/16</td>
 <td >Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) </td>
 <td>Donated by Dr. Martin Hemler </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;1 integrin (CD29)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >Monoclonal antibody IB4</td>
 <td >University of California, San Francisco </td>
 <td>Donated by Dr. Eric J. Brown </td>
 <td>Human-specific anti-&beta;2 integrin (CD18)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td >F(ab')2 goat anti-mouse IgG </td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55468</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55522</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG</td>
 <td >Cappel (Aurora, OH)</td>
 <td>55665</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p50</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-114</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-NF-&kappa;B p65</td>
 <td >Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td>
 <td>sc-109</td>
 <td>Rabbit polyclonal antibody</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430791</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50-ml centrifuge tube</td>
 <td >Corning</td>
 <td>430291</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge, Sorvall Tabletop</td>
 <td >Dupont Instruments</td>
 <td>RT 6000D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>pH-meter</td>
 <td >Corning</td>
 <td>340</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-20</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-200</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123601</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pipetman pipette P-1000</td>
 <td >Gilson </td>
 <td>F123602</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hemocytometer</td>
 <td >Fisher Scientific</td>
 <td>0267110</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>Eclipse E600</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted microscope</td>
 <td >Nikon </td>
 <td>TMS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Bath Incubator</td>
 <td >Fisher Scientific </td>
 <td>2IS-M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5414C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge</td>
 <td >Eppendorf</td>
 <td>5418</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Flow Cytometer</td>
 <td >Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) </td>
 <td>FACScalibur </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry

호중구는 말초 혈에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 이러한 세포 따라서 미생물을 침해에 대한 방어의 첫 번째 줄되고, 염증 및 감염의 사이트에 게재 처음입니다. 호중구는 phagocytosis, lytic 효소의 출시, 그리고 반응성 산소 종의 생산과 같은 중요한 항균 기능을 가지고 있습니다. 다음과 같은 중요한 방어 기능뿐만 아니라, 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등의 감염에 대한 응답으로 다른 작업을 수행 할 수 있습니다. 크린 시토 킨은 감염을 선명하게 할 수 다른 백혈구를 모집하고, apoptosis의 억제는 호중구는 감염의 사이트에 더 오래 살 수 있습니다. 이 함수는 스크립트 수준의 규제를받습니다. 호중구는 수명이 짧은 세포이기 때문에 더 effi가 없기 때문에 그러나, 이러한 세포의 transcriptionally 규제 응답의 연구는 종래의 리포터 유전자 방법으로 수행 할 수 없습니다호중구 transfection에 대한 cient 기술. 여기, 우리는 유동 세포 계측법에 의한 분리 및 immunolabeled 핵의 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수있는 간단하고 효율적인 방법을 제시한다. 우리는 인간의 말초 혈액에서 순수 호중구를 분리하는 기술을 설명, 안티 - 수용체 항체와 함께이 세포를 자극 분리하고 immunolabel의 핵 및 유동 세포 계측법에 의해 핵을 분석 할 수 있습니다. 방법이 성공적으로 호중구 및 다른 세포 유형에서 핵으로 NF-κB와 엘크-1 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 따라서,이 방법은 세포 유형의 다양한 절연 핵에서 전사 인자의 활성을 분석하기위한 옵션을 나타냅니다.

정화 방법은 여기에 설명하는 것이 95 % (그림 1A)보다 큰 결함으로 unstimulated 호중구 (PMN)를 제공합니다. 절연 PMN 그런 다음 특정 단클론 항체와 crosslinking 특정 수용체​​에 의해 자극 될 수 있습니다. 우리는 FC 수용체와 integrins (그림 1B)를 통해 PMN을 자극했다. 일단 자극, PMN은 lysed하고 핵은 높은 수율로 분리되어 있습니다. 핵은 그러한 특정 항체와 핵 요소 κB (NF-κB), (그림 1B) 등의 특정 핵 요소에 대한 immunolabeled 있습니다. 핵은 쉽게 점 플롯 (그림 2A)로 흐름 cytometer에 그대로 PMN에서 다른 인구로 인식 할 수 있습니다. 쉬고있는 PMN에서 NF-κB의 기저 수준은 세포 핵 (그림 2B)에서 찾을 수있다. crosslinking β1 integrins에 의해 자극되면, NF-κB는 핵이 increm에 translocated 수 있습니다<html> 핵 NF-κB의 다닐은 형광 (그림 2B)의 증가로 검출된다. 형광 (그림 2C)의 증가로 표시로서 마찬가지로, crosslinking β2 integrins에 의한 PMN의 자극은 NF-κB 활성화를 유도. 이 방법의 민감도는 수 사실에 의해 입증으로 핵 요소 수준의 작은 변화를 감지 이러한 다른 세포에 접착 분자에 바인딩 β2 integrins,보다 fibronectin, 유도 강한 NF-κB 활성화와 같은 세포 외 기질 단백질에 바인딩 β1 integrins, (그림 2B와 2C을 비교). 이 방법은 성공적으로 PMN의 FC 수용체 자극 후 NF-κB 15 절연 핵의 엘크-1 16 핵 요소를 검색하는 데 사용되었습니다. 이 방법은 간단하고 경제적이며, 따라서 그것은 쉽게 다른 세포 유형의 핵 요인을 분석하고 수정할 수 있습니다. 내용 &quot;강한 : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50410/50410fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50410/50410fig1highres.jpg"/> 1 그림. 개략적 인 혈액에서 호중구 (PMN) 정화의 표현, 세포의 자극, 핵의 분리 및 격리 핵의 핵 요인의 immunolabeling. A) 헤파린 처리 된 혈액은 적혈구를 교착하는 dextran과 혼합되어 있습니다. 적혈구의 침전 후, 백혈구 풍부한 플라즈마는 붉은 세포의 상단에 있습니다. 이 백혈구 풍부한 플라즈마가 다른 관에 양도하고 Ficoll-Paque의 상단에 층을합니다. 원심 분리 후, mononuclear 세포 (MNC)의 층 플라즈마와 Ficoll-Paque의 계면에서 발견됩니다. PMN은 튜브의 하단에 있습니다. B) 절연 PMN은 crosslinking 셀 멤브레인 특정 단클론 항체와 수용체 (적인 mAb) (오렌지)과 이차 항체 (진한 녹색에 의해 자극). 원자력 요소 카파 B (NF-κB)는 핵으로의 억제제 IκB와 translocates에서 분리합니다. 핵은 다음 격리 permeabilized 및 NF-κB 또는 특이적인 mAb (노란색)과 또 다른 핵 요소와 FITC-라벨 차 항체 (밝은 녹색)에 대해 immunolabeled 있습니다. 고정 핵은 유동 세포 계측법 (FACS)에 의해 분석하면. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50410/50410fig1large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50410/50410fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50410/50410fig2highres.jpg"/> 그림 2. 호중구 (PMN)의 NF-κB 활성화의 분석. A) 그대로 PMN (왼쪽 패널) 또는 절연 핵 (오른쪽 패널)는 유동 세포 계측법 점 플롯 그래프에서 두 개의 인구로 나타납니다. 세포와 핵이에 의해 독립적으로 분석 할 수손상 세포에 대한 R1 (빨간색) 및 절연 핵에 대한 R2 (파란색)은 서로 다른 문을 만드는 두 가지 방법이 있습니다. PMN 격리 B 및 C) 핵은 (녹색 점선)하기 전에, NF-κB (p50 subunit)에 대한 immunolabeled, 또는 셀 이후 한 에 의해 활성화 된 교차 연결 (B) TS2/16 (파란색 선) 특정 단클론 항체와 β1 integrins를, 특정 단클론 항체 IB4 (빨간색 선)으로 또는 β2 integrins (C). 회색 지역은 혼자 FITC-라벨 보조 항체의 기초 형광입니다.

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A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

호중구는 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등 transcriptionally 규제 기능을 가지고 있습니다. 이 기능은 절연 핵에 유동 세포 계측법에 의해 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수 있습니다 여기에 제시된 방법으로 공부 할 수 있습니다

유동 세포 계측법에 의해 인간 호중구에 핵 팩터 활성화를 감지 할 간단하고 효율적인 방법

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

a-simple-efficient-method-to-detect-nuclear-factor-activation-human

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K 조회수.  University of Alberta. 호중구는 혈액에서 가장 풍부한 백혈구 수 있습니다. 호중구는 전 염증성 크린 시토 킨 및 apoptosis의 억제 생산 등 transcriptionally 규제 기능을 가지고 있습니다. 이 기능은 절연 핵에 유동 세포 계측법에 의해 핵 요인의 감지 및 정량화 할 수 있습니다 여기에 제시된 방법으로 공부 할 수 있습니다

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

의 상호 작용을 연구<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

간단한 유세포 방법은 전체 혈액에서 단핵구 부분 집단에 대한 당 흡수 및 포도당 운송업자 발현을 측정하는

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...