وترعى هذا العمل من قبل معهد أبحاث مرض الذئبة (نيويورك، نيويورك)، NIH P01-AR49084، NIH-R21 DA026956 والمعاهد الوطنية للصحة UL1-TR00165. نشكر الدكتور روبرت P. كيمبرلي على دعمه المتواصل.

أعطى جميع الجهات المانحة المعينين لهذه الدراسة الموافقة المسبقة الخطية وتمت الموافقة على الدراسة من جامعة ألاباما في برمنغهام مجلس المراجعة المؤسسية. 1. HUVEC الثقافة الأولية وثقافة ثانوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الوريد السري الخلايا البشرية البطانية (HUVEC) في المختبر في المتوسط ​​كاملة النمو التي تتكون من الخلايا البطانية المتوسطة القاعدية (انظر قائمة المواد) تستكمل مع عوامل نمو الخلايا البطانية. ملاحظة: إن عوامل النمو المستخدمة في هذه الدراسة ما يلي: 5 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف عامل نمو البشرة (hEGF)، 1.0 ملغ / مل الهيدروكورتيزون، 50 ملغ / مل جنتاميسين و 50 نانوغرام / مل الأمفوتريسين-B (GA-1000)، 2 ٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 0.5 نانوغرام / مل الأوعية الدموية غشائي عامل نمو (VEGF)، و 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية-Basic مع الهيبارين (hFGF-B)، و 20 نانوغرام / مل المؤتلف عامل نمو الإنسان الإنسان الذي يشبه الانسولين ( R 3-IGF-1)، 1 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك، و 22.5 ميكروغرام / مل الهيبارين. المتوسط ​​كاملةوقد أعد في البداية عند 37 درجة مئوية ويمكن بعد ذلك تخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها في غضون شهر 1 من التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد قارورة للخلايا، يتم إضافة كامل متوسطة النمو إلى 75 سم 2 نسيج الثقافة قارورة (1 مل ​​/ 5 سم 2) ومن ثم يتم السماح القارورة لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 في حاضنة مرطب لل لا يقل عن 30 دقيقة. سيتم المصنفة HUVEC الإنسان مباشرة في هذه القارورة الثقافة معايرتها في كثافة 2،500-5،000 خلية / سم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن وسائل الإعلام وتوازنه، ذوبان الجليد بسرعة cryovial الأسهم HUVEC في حمام مائي 37 ° C. تفريق الخلايا في قارورة التخزين الأصلي من قبل vortexing ثم إضافتها مباشرة إلى قارورة الثقافة التي تحتوي على معايرتها قبل HUVEC المتوسطة النمو الكامل لتحقيق كثافة 2،500-5،000 خلية / سم 2. صخرة بلطف القارورة لتوزيع بالتساوي الخلايا ومن ثم العودة القارورة إلى حاضنة. وتمثل هذه الخلايا الآن مرور 1 الحادي والعشرين. </li> &lt;لى&gt; متوسطة يجب تغيير كل يومين حتى الخلايا هي 70-80٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وHUVECs ويمكن الآن أن تحصد من قارورة الثقافة مع التربسين / EDTA. ويستنشق وسائل الإعلام والثقافة من قوارير الثقافة يعقبه شطف برنامج تلفزيوني لإزالة أي البروتين المتبقية والكالسيوم من الخلايا. يتم إضافة 0.25٪ التربسين EDTA-حل وضمن 2-6 دقيقة خلية مفرزة يجب أن يكون واضحا وفقا لتقييم بواسطة المجهر الضوئي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم تقريب 90٪ من الخلايا قبالة لوحة، وقف trypsinization بإضافة حجم مساو من 2X مثبط التربسين. لتسهيل الحصاد من الخلايا، إضافة كمية متساوية من أخرى كاملة متوسطة النمو. نقل الخلايا إلى فصل العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لفصل الخلايا في 225 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف، ثم resuspend الخلايا في 2-3 مل من المتوسط ​​كاملة النمو. تحديد تركيز الخلية وقدرتها على البقاء باستخدام عدادة الكريات والتريبان الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للاستفادة من اله حصاد الخلايا لدراسة وإعادة البذور إضافية 75 سم 2 قوارير مع الخلايا في مناطق ذات كثافة من 10،000 خلية / سم 2 وانتقل إلى الخطوة 2.2. بدلا من ذلك، يمكن تجميد الخلايا في هذه المرحلة للدراسات المستقبلية. لتجميد الخلية، بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح قبالة طاف و resuspend بيليه خلية في FBS تحتوي على 10٪ DMSO بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل. ثم يتم نقل تعليق خلية إلى cryovials وتخزينها في -80 درجة مئوية بعد تجميد الخلايا في وعاء تجميد الخلية. </li></ol> 2. إعداد طبقة HUVEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجمدة HUVECs 2 الثانية المقطع: إحياء والثقافة. إذا باستخدام الخلايا بنشاط متزايد، انتقل إلى الخطوة 2.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد في cryovial تحتوي على 2 HUVECs الثانية مرور من الخطوة 1.8 بسرعة في حمام مائي 37 ° C. نقل الخلايا من cryovial إلى 15 مل العقيمة أنبوب الطرد المركزي وإضافة 10 مل النمو ميديأم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف لإزالة DMSO المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية كاملة مع النمو المتوسطة ونقل الخلايا إلى 75 سم 2 القارورة. إضافة إلى النمو متوسطة الحجم الكلي حوالي 20-25 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بصريا دراسة زراعة الخلايا لالتقاء كل يوم مع التغييرات وسائل الاعلام كل يومين. عادة في غضون 2-4 أيام، سوف تصل إلى خلايا 80-90٪ التقاء في الوقت الذي سيكون جاهزا للاستخدام في مقايسة غرفة التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحضير الطبق الثقافة التي سيتم استخدامها في غرفة التدفق (انظر القسم 5)، إضافة 1 مل من 10 ميكروغرام / مل فبرونيكتين و 0.05٪ (ث / ت) الجيلاتين إلى 35 ملم الأنسجة طبق الثقافة وماصة عدة مرات لجعل تأكد من المغلفة لوحة السطح كله. إزالة فبرونيكتين والجيلاتين حل المفرطة والهواء الجاف لوحة لمدة 30 دقيقة على الأقل لتحسين تشكيل مصفوفة البروتين. وويمكن إعادة استخدامها ibronectin والجيلاتين حل حتى 10x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا HUVEC من الخطوة 2.2 باستخدام التربسين EDTA-كما هو موضح في الخطوات 1،5-1،7. البذور 500،000 الخلايا في كل طبق زراعة الأنسجة المغلفة. إضافة 2 مل متوسطة النمو في كل طبق واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا أن تنمو إلى نقطة التقاء كما في الخطوة 2.2. الخلايا يجب فحص البصر يوميا مع التغيرات المتوسطة كل يومين. قبل مقايسة غرفة التدفق، رئيس HUVEC مع 20 نانوغرام / مل الإنسان TNF-α لمدة 4-6 ساعة إلى upregulate وتحفيز التصاق جزيء التعبير. </li></ol> 3. تنقية يجند طلاء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم دائرة قطرها 0.5 سم مع علامة أو القلم في مركز 35 ملم الأنسجة طبق الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 20 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / مل البروتين (أ) في منطقة ملحوظ. استخدام غيض ماصة لنشر البروتين حل لتغطية المنطقة كلها داخل دائرة قطرها 0.5 سم. من المهم أن لا تلمس أو تخدش سطح دإيش. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البروتين-A 3X لوحة المغلفة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 50 ميكرولتر 1٪ BSA في مجال ملحوظ لمنع ملزم غير محددة على لوحة. احتضان لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X لوحة سدت مع 1 مل من برنامج تلفزيوني كما في الخطوة 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد FC-التصاق مستقبلات البروتين يجند حلول خيالية لطلاء. في هذه التجربة، حلا ICAM-1/Fc الوهم في 25 ميكروغرام / مل والوهم P-Selectin/Fc عند 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني كان يستخدم (درجة الحموضة 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف منطقة ملحوظ مع 50 ميكرولتر من الركيزة. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يجب استخدام طبق في غضون يومين، وينبغي ألا يسمح للمنطقة المغلفة لتجف. إضافة PBS إذا لزم الأمر للحفاظ على حل 50 ميكرولتر على لوحة. </li></ol> 4. فصل العدلات (جميع الخطوات المنجزة في درجة حرارة الغرفة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على الموافقة المسبقة، وجمع مشارك في الدم عن طريق الفصد فين تخثر جمع الدم أنبوب أو vacutainer (EDTA أو الهيبارين). بعد جمع الدم، يخفف الدم 1:1 مع برنامج تلفزيوني قبل الانفصال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اثنين من طبقة Ficoll لفصل PBMC والعدلات في 50 مل أنابيب الطرد المركزي. أولا إضافة 15 مل Ficoll الثقيلة (قائمة المواد، ρ = 1،118-1،120 نرى)، ثم طبقة بعناية 10 مل ضوء Ficoll (قائمة المواد، ρ = 1،077-1،080 نرى) على رأس Ficoll الثقيلة. يجب أن يكون هناك حدود حادة بين Ficoll الخفيفة والثقيلة طبقات Ficoll. أخيرا، طبقة بعناية 25 مل من عينة من الدم المخفف على رأس Ficoll ضوء من دون إزعاج طبقة Ficoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 250 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: يجب أن يكون الطرد المركزي الفرامل الدوار قبالة لهذه يدور للحد من تعطيل محتمل لفصل الخلايا أثناء الدوار التباطؤ في نهاية الطرد المركزي. بعد الطرد المركزي، والطبقات التالية (من الأعلى إلى الأسفل) موجودة: الطبقة العليا هي البلازما فولو فوتبال شيالأربعاء قبل طبقة PBMC على رأس طبقة Ficoll ضوء، وطبقة العدلة مع عدد قليل من خلايا الدم الحمراء (RBC) هو بين الخفيفة والثقيلة Ficoll تليها طبقة Ficoll الثقيلة وكرات الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد ونقل طبقة جديدة العدلة في أنبوب 50 مل مع ماصة نقل، إضافة إلى برنامج تلفزيوني الحجم النهائي من 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، قد تكون هناك كرات الدم الحمراء مختلطة مع العدلات. نضح طاف وصولا الى علامة 10 مل. resuspend الكرية العدلة-RBC بواسطة الإثارة لطيف من الأنبوب (أو سرعة منخفضة وجيزة vortexing ل) ثم يغسل مرة أخرى مع 50 مل من برنامج تلفزيوني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل الثاني، نضح طاف. لإزالة تلويث كرات الدم الحمراء، resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني المتبقية عن طريق التحريض (أو vortexing لقصير)، إضافة 25 مل H 2 O ودوامة بلطف لمدة 10 ثانية إلى ليز RBC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 مل من 1.8٪ كلوريد الصوديوم وتخلط على الفوربواسطة الطرد المركزي في 225 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وRBC تلويث ينبغي الآن هي lysed ترك العدلة الأبيض الخلية بيليه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الخلية العدلة مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والعدلات المعزولة في RPMI المتوسطة مع FBS 10٪ وتحديد تركيز الخلية تحت المجهر الخفيفة مع عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كثافة الخلية إلى 500،000 خلية / مل مع RPMI كاملة 10٪ FBS المتوسطة. </li></ol> 5. تدفق غرفة التصاق الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع غرفة تدفق. وضع 35 مم طبق يحتوي على HUVECs متموجة أو المنقى بروابط التصاق مستقبلات على الطاولة المجهر. ربط غرفة تدفق موازية لوحة مع ضخ حقنة، ونظام الفراغ وترك سطر واحد مفتوح للمساهمة العدلة. إدراج غرفة التدفق على الجزء العلوي من لوحة وربط التجمع غرفة التدفق 13. (انظر الشكل 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء برنامج تسجيل الفيديو على جهاز كمبيوتر متصل رس المجهر. ضبط الميدان والتركيز المجهر حتى حقل واضحة مع الخلايا HUVEC نمت بشكل كامل أو حقل داخل المنطقة يجند طلاء مرئيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مضخة المحاقن، وشطف غرفة التدفق مع RPMI المتوسطة. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل غرفة أو سطر الإدخال العدلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، يمكن معبي العدلات مع جرعة منخفضة (10 -8 M) fMLP لمدة 10 دقيقة. وهذا سوف يسمح لمطابقة مستوى القاعدية من تفعيل العدلات بين مختلف الجهات المانحة 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة لحقن حقنة العدلات في غرفة التدفق بسرعات محددة (بسرعة 350 ميكرولتر / دقيقة، وهو ما يعادل 1.5 من إجهاد القص dynes / سم 2 يتم استخدامه في هذه الدراسة). تسجيل الفيديو. يمكن أن يحدث لأن العدلات التصاق بسرعة، شريط فيديو بطول 4-5 دقيقة وعادة ما يكفي ل quantitate الأحداث التصاق لتحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تعريف الخلايا الملتصقة باعتبارها الخلية التي تتحرك قطر الخلية أقل من واحدخلال 5 ثوانى على HUVEC أو يجند المغلفة سطح 15،16. عد عدد من الخلايا الملتصقة في مجال موجودة في الفيديو المسجل باستخدام هذه القاعدة. من خلال تسجيل مقاطع الفيديو طول مماثلة مع العدلات مختلف الجهات المانحة &quot;، يمكن للمرء حساب الخلايا الملتصقة / دقيقة لمقارنة خصائص الالتصاق بين مختلف الجهات المانحة. </li></ol>

<ol>
	<li>Harley, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+scan+in+women+with+systemic+lupus+erythematosus+identifies+susceptibility+variants.">Genome-wide association scan in women with systemic lupus erythematosus identifies susceptibility variants.</a> in ITGAM, PXK, KIAA1542 and other. 40, 204-210 (2008).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+ICAM1-ICAM4-ICAM5+Locus+Is+Associated+with+Systemic+Lupus+Erythematosus+Susceptibility+in+Multiple+Ancestry+Populations.">Variation in the ICAM1-ICAM4-ICAM5 Locus Is Associated with Systemic Lupus Erythematosus Susceptibility in Multiple Ancestry Populations.</a> Ann. Rheum. Diseases. 71 (11), 1809-1814 (2012).</li><li>Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+leukocyte+recruitment+in+the+inflammatory+process.">Molecular mechanism of leukocyte recruitment in the inflammatory process.</a> Cardiovasc. Res. 32 (4), 733-742 (1996).</li><li>Korthuls, R. J., Anderson, D. C., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+neutrophil-endothelial+cell+adhesion+in+inflammatory+disorders.">Role of neutrophil-endothelial cell adhesion in inflammatory disorders.</a> J. Crit. Care. 9 (1), 47-71 (1994).</li><li>Albelda, S. M., Smith, C. W., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+molecules+and+inflammatory+injury.">Adhesion molecules and inflammatory injury.</a> FASEB J. 8 (8), 504-512 (1994).</li><li>Smith, C. W., Marlin, S. D., Rothlein, R., Toman, C., Anderson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+LFA-1+and+Mac-1+with+intercellular+adhesion+molecule-1+in+facilitating+adherence+and+transendothelial+migration+of+human+neutrophils+in+vitro.">Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intercellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro.</a> J. Clin. Invest. 83 (6), 2008-2017 (1989).</li><li>Marlin, S. D., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+intercellular+adhesion+molecule-1+(ICAM-1)+is+a+ligand+for+lymphocyte+function-associated+antigen.">Purified intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) is a ligand for lymphocyte function-associated antigen.</a> Cell. 51 (5), 813-819 (1987).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+Distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: Distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65 (5), 859-873 (1991).</li><li>Smith, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+steps+involved+in+the+transition+to+stationary+adhesion+of+rolling+neutrophils:+A+brief+review.">Possible steps involved in the transition to stationary adhesion of rolling neutrophils: A brief review.</a> Microcirculation. 7, 385-394 (2000).</li><li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber.">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21 (1), 77-83 (1993).</li><li>van Kooten, T. G., Schakenraad, J. M., Vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+a+parallel-plate+flow+chamber+for+studying+cellular+adhesion+to+solid+surfaces.">Development and use of a parallel-plate flow chamber for studying cellular adhesion to solid surfaces.</a> J. Biomed. Mater. Res. 26 (6), 725-738 (1992).</li><li>Munn, L. L., Melder, R. J., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+flow+in+the+parallel+plate+flow+chamber:+Implications+for+cell+capture+studies.">Analysis of cell flow in the parallel plate flow chamber: Implications for cell capture studies.</a> Biophys. J. 67, 889-895 (1994).</li><li>Kucik, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Adhesion+Under+Flow+Conditions.">Measurement of Adhesion Under Flow Conditions.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 9.6.1-9.6.10 (2003).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Lupus+Associated+ITGAM+Variants+Alter+Mac-1+Function+on+Neutrophils.">Multiple Lupus Associated ITGAM Variants Alter Mac-1 Function on Neutrophils.</a> Arthritis. Rheum. , (2013).</li><li>Bacabac, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shear+stress+in+parallel-plate+flow+chambers.">Dynamic shear stress in parallel-plate flow chambers.</a> J. Biomech. 38 (1), 159-167 (2005).</li><li>Kucik, D. F., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell-Adhesion Assay. Methods in Molecular Biology. 294, 43-54 (2005).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., C, A., Zychlinsky, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. 36 (36), (2010).</li><li>Oh, H., Siano, B., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+isolation+protocol.">Neutrophil isolation protocol.</a> J Vis Exp. (17), 745 (2008).</li><li>Cheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variations+in+absolute+wall+shear+stress+levels+within+one+species+and+between+species.">Large variations in absolute wall shear stress levels within one species and between species.</a> Atherosclerosis. 195 (2), 225-235 (2007).</li><li>Nagaoka, T., Yoshida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+evaluation+of+wall+shear+stress+on+retinal+microcirculation+in+humans.">Noninvasive evaluation of wall shear stress on retinal microcirculation in humans.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1113-1119 (2006).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هذا البروتوكول توجه الانفصال والعزلة من العدلات تنشيط الحد الأدنى للتقدير الدقيق للالعدلات التصاق تحت ظروف الإجهاد الهائل. العدلات التصاق هو عملية حاسمة في الالتهاب. لأن أثبتت المتغيرات الجينية في جزيئات متعددة في هذه العملية ليؤهب لتطوير أمراض المناعة الذاتية 1،2، مطلوب نظام مقايسة قادرة على تقييم كمي الإنسان التصاق شركة العدلة. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح لتحديد الدقيق وكمية من إمكانات لاصقة شركة العدلات في بيئة تسيطر عليها في المختبر تحت الضغط الهائل. وبالتالي هذا الأسلوب يسمح للمقارنة مباشرة لالتصاق العدلة الكمية بين الأفراد مرمزة بالجينات لتحديد أهمية الاختلاف الجيني في جزيئات الالتصاق 14. العديد من الخطوات في هذا الأسلوب تستحق دراسة متأنية لتحقيقهنتائج ه الكمي للغاية وقابلة للتكرار. في إعداد HUVEC، فمن الأهمية بمكان لتحقيق 100٪ التقاء خلية قبل استخدامها في غرفة التدفق. لاستخدام أسطح مغطاة يجند النقي، لا ينبغي أبدا أن يسمح للمنطقة الركيزة طلاء لتجف لتجنب تغيير طبيعة يجند. بالإضافة إلى ذلك، إعداد العدلات الإنسان أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. القضايا الرئيسية في عزل العدلات من الدم وتشمل التعامل مع بلطف عن طريق تقليل vortexing لتجنب التنشيط، والحفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة (أي لا يجب أن يتم تخزين الدم على الجليد والطرد المركزي الخطوات التي ينبغي القيام بها في درجة حرارة الغرفة) واستكمال العزلة والتجربة في أقل قدر من الوقت ممكن. هناك طرق إضافية العدلة العزلة التي يمكن أيضا أن تستخدم لإعداد الخلايا لهذه المقايسات 17،18. من العملية المقايسات المنظور، التصاق باستخدام العدلات الإنسان طازجة معزولة<html> يجب أن تبدأ في غضون 3-6 ساعة بعد مشارك الفصد. كما العدلات حساسة للغاية للمناولة ويمكن الأزمنة المتطاولة بين سحب الدم والاستخدام تؤثر نتائج الفحص. تقرير دقيق للتركيز الخلية العدلة قبل مقايسة غرفة التدفق الضروري أيضا لتحقيق نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. خلال مقايسة غرفة التدفق، فمن المهم رصد وتسجيل الفيديو بدقة لضمان سرعة تدفق ثابت وليس هناك اضطرابات في جميع أنحاء طول التجربة. أن التغيرات في سرعات التدفق أو وجود اضطرابات تستلزم أن التجربة تتكرر. بعد التجربة، فإنه من المهم أيضا لتقييم العدلات المتبقية مجهريا للتأكد من أن العدلات لا التثاقل. سوف التثاقل عند هذه النقطة تشير إلى أن العدلات أصبحت تنشيط التي يمكن أن يغير بشكل كبير كثافة العدلات أثناء التجربة. المحتويات &quot;&gt; وغرفة التدفق يخلق التوتر بالقرب متجانسة الهائل داخل غرفة (τ = 6Qμ / (ملحق 2)، حيث س = معدل التدفق، μ = اللزوجة الديناميكية، وث = العرض من غرفة التدفق، ح = ارتفاع غرفة تدفق 15). في دراساتنا، استخدمنا معدل تدفق 350 ميكرولتر / دقيقة لالعدلات التصاق، مما يخلق التوتر الهائل من 1.5 dynes / سم 2 (ث = 0.25 سم، ح = 0.01 بوصة، لزوجة الماء عند 37 درجة مئوية (0.007 اتزان) كانت تستخدم تقريبي لزوجة RMPI وسائل الإعلام). للحصول على غرفة تدفق محددة، يمكن للمرء تغيير معدل التدفق لتحقيق مستويات مختلفة من الإجهاد الهائل لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة. نموذجي إجهاد القص فيزيولوجي في الأوعية الدموية يمكن أن يتراوح بين الإنسان 0.5-5.0 dynes / سم 13،16. القص التوتر في الأوعية الدموية الأخرى، وكانت الحيوانات الأخرى المدرجة في الجدول 1 113،16،19 20. في حين ركزت أسلوبنا على دراسة التصاق neutrophi الإنسانليرة سورية، وهذه الطريقة لا يقتصر على العدلات ويمكن بسهولة أن تطبق على التصاق أو دراسات المتداول من أنواع الخلايا الأخرى مع تعديلات بسيطة. أيضا، وركائز في هذا الأسلوب يمكن أن تتغير لأغراض مختلفة. على الرغم من أن هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة إلى دراسات مختلفة، وهناك بعض القيود. البروتوكول كما نفذت هنا يتطلب عدد كبير من الخلايا الأولية للتحليل. وهذا قد يحول دون تحليل الخلايا الأولية من الحيوانات الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحاجة إلى شل بروابط التصاق المنقى في التشكل النشطة / المتوفرة قد تحد من مدى بروابط. استخدام البروتينات FC-الانصهار يعزز كثيرا من فرص تحقيق التشكل يجند المناسبة على سطح اللوحة. ومع ذلك، لدينا وسيلة لديه مرونة كبيرة للسماح للتحليل الكمي للالتصاق الأحداث. هذه الدراسات سوف يعزز إلى حد كبير فهمنا للالتصاق مستقبلات يجند أزواج، وظيفة الأهمية المحتملة من المتغيرات الجينيةفي هذه البروتينات، في التسبب في الأمراض التي تصيب الإنسان.

يتم التعرف على المتغيرات الجينية في كل من β 2 لل integrins وبروابط ICAM الآن لتترافق مع تطور 1،2 أمراض المناعة الذاتية. تحديد العواقب الوظيفية لهذه المتغيرات في الخلايا المشتقة من الأفراد مع هذه المتغيرات ضروري لفهمنا لكيفية مساهمة هذه المتغيرات إلى المرضية أمراض المناعة الذاتية. مثل هذه الدراسات وظيفية تسمح لتحديد الآليات التي تحدث بشكل طبيعي المتغيرات الجينية تشكل الاستجابة المناعية في كل من الصحة والمرض. في مثال محدد من SLE، ونحن نعلم الآن أن المتغيرات في ITGAM (CD11b) ويجند لها، ICAM-1، ربط بقوة مع تطور مرض 1،2. لأن العدلات هي الحاسمة في الاستجابات الالتهابية، ودراسة كمية من العدلات التصاق قد تقدم أفكارا الآلية في كيفية المتغيرات الجينية في ITGAM / ICAM تغيير الالتهاب. NeutropHIL التصاق الخلايا البطانية لشركة (EC) هي عملية منظمة للغاية ويلعب دورا أساسيا في الاستجابات الالتهابية 3،4. التصاق شركة من العدلات يلي الأولي المتداول العدلة والقبض على المفوضية الأوروبية وفي نهاية المطاف يمكن أن يؤدي إلى التهجير في الجسم الحي. هذه العمليات تنطوي على العديد من أنواع مختلفة من جزيئات الالتصاق، بما في ذلك ICAM-1، ICAM-2، ف selectin، E-Selectin على الخلايا البطانية وβ 2 لل integrins على العدلة 5-9. وبالتالي، فإن القياس الكمي الدقيق للالعدلات التصاق من الجهات المانحة مع المتغيرات أليلية مختلفة من جزيئات الالتصاق يكون من المهم أن نفهم العواقب الوظيفية والمرضية لهذه المتغيرات الجينية. استخدام تجريبي لغرفة تدفق يمكن أن تخلق بيئة في المختبر مع إجهاد القص السائل مماثلة لتلك التي لوحظت في البيئة الأوعية الدموية في الجسم الحي 10-12. في الواقع، مقايسة غرفة التدفق إلى جانب umbili الإنسانكال الخلايا البطانية الوريد (HUVEC) يمكن أن تحاكي البيئة في الجسم الحي في أحد الاوعية الدموية. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن للمرء أن دراسة خصائص لاصقة الخلوية مال نحو الخلايا البطانية. بالإضافة إلى ذلك، البيئة رقابة شديدة من غرفة تدفق كما يسمح بتقييم خلية ملزمة لبروابط التصاق النقية مثل ICAM-1 لتسهيل دراسة التفاعلات مستقبلات يجند محددة. نقدم هنا طريقة استخدام نظام مقايسة غرفة التدفق التصاق لدراسة خصائص لاصقة من العدلات الدم المحيطي الإنسان إلى HUVEC وركائز يجند المنقى. باستخدام هذا الأسلوب مع الخلايا من الجهات المانحة التعبير عن مختلف المتغيرات جزيء التصاق أليلية يسمح لنا لتقييم كيف يمكن لهذه المتغيرات الجينية يمكن أن يغير الإنسان التصاق شركة العدلة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="677">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:677px;">Table of Reagents Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Name of reagent</td>
			<td style="width:107px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:268px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">25200-056</td>
			<td style="width:268px;">with Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">2X Trypsin inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">R-002-100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">35mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430165</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:192px;">75cm2 tissue culture flask</td>
			<td style="width:107px;">Corning Inc.</td>
			<td style="width:111px;">430641</td>
			<td>Standard Tissue Culture Treated Surface</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Dage-MTI</td>
			<td style="width:111px;">Model 300T-RC</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Cell freezing container&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Biocision</td>
			<td style="width:111px;">BCS-045</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-3156</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">EGM-2 Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc</td>
			<td style="width:111px;">CC-4176</td>
			<td style="width:268px;">HUVEC growth factors for basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">FBS</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">10082-147</td>
			<td style="width:268px;">Certified, Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Gelatin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">G9391</td>
			<td style="width:268px;">from bovine skin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:107px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:111px;">02-671-51B&#160;</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">F2006</td>
			<td style="width:268px;">from human plasma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Flow chamber</td>
			<td style="width:107px;">Glyco Tech</td>
			<td style="width:111px;">31-001</td>
			<td style="width:268px;">Circular flow chamber for 35mm dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">fMLP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">47729</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Histopaque-11191</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">11191</td>
			<td style="width:268px;">Heavy ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">HUVEC</td>
			<td style="width:107px;">Lonza Inc.</td>
			<td style="width:111px;">CC-2517A</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">ICAM-1</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">720-IC</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Lymphocyte separation medium</td>
			<td style="width:107px;">Mediatech Inc.</td>
			<td style="width:111px;">25072CV</td>
			<td style="width:268px;">Light ficoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Microscope</td>
			<td style="width:107px;">Zeiss</td>
			<td style="width:111px;">Axiovert 100</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">11875</td>
			<td style="width:268px;">with L-Glutamine and Phenol Red&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Protein A</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P6031</td>
			<td style="width:268px;">resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">P-Selectin</td>
			<td style="width:107px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:111px;">137-PS</td>
			<td style="width:268px;">Fc chimera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:107px;">KD Scientific</td>
			<td style="width:111px;">KDS270</td>
			<td style="width:268px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">TNF-a</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td style="width:111px;">PHC3015</td>
			<td style="width:268px;">Recombinant Human Protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:192px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:107px;">Life technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human neutrophil flow chamber adhesion assay

التصاق شركة العدلة إلى الخلايا البطانية يلعب دورا حاسما في التهاب في كل من الصحة والمرض. عملية التصاق شركة العدلة ينطوي على كثير من جزيئات الالتصاق مختلفة بما في ذلك أفراد الأسرة إنتغرين β 2 وبها مستقبلات لمكافحة الأسرة ICAM. في الآونة الأخيرة، والتي تحدث بشكل طبيعي المتغيرات الجينية في كل من β 2 لل integrins وذكرت ايكامس أن تترافق مع أمراض المناعة الذاتية. وبالتالي، فإن قدرة لاصقة كمية من العدلات من الأفراد مع اختلاف أشكال أليلية هذه جزيئات الالتصاق المهم دراسة فيما يتعلق الآليات الكامنة وراء تطور المناعة الذاتية. يمكن التصاق الدراسات في النظم غرفة التدفق خلق بيئة مع إجهاد القص السائل مماثلة لتلك التي لوحظت في البيئة الأوعية الدموية في الجسم الحي. هنا، نقدم طريقة استخدام نظام مقايسة غرفة التدفق لدراسة خصائص لاصقة كمية من الدم المحيطي الإنسان العدلةق الإنسان إلى الوريد السري البطانية الخلية (HUVEC) وركائز يجند المنقى. مع هذا الأسلوب، وقدرات لاصقة العدلة من الجهات المانحة مع المتغيرات أليلية مختلفة في مستقبلات الالتصاق يمكن تقييم ومقارنة. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الأسلوب لتقييم التصاق غيرها من أنواع الخلايا الأولية أو خطوط الخلية.

أمثلة من العدلات ملزمة ليجند المنقى (ICAM-1/P-Selectin) غرفة تدفق المغلفة (الشكل 2) أو من العدلات ملزمة لHUVEC المغلفة غرفة تدفق مقايسة (الشكل 3) وترد. كما هو مبين في الأرقام، لا تزال تتراكم العدلات / التمسك السطح المطلي أو HUVEC في ظل ظروف تدفق مستمر. تحت ظروفنا تجربة نموذجية، يمكننا أن نلاحظ 50-70 العدلات الإنسان التمسك بقوة إلى السطح المطلي أو HUVEC خلال فترة تسجيل اربع دقائق. ومع ذلك، من المتغيرات أليلية جزيئات الالتصاق العدلة، أو المتغيرات أليلية في الركيزة (يجند تنقيته أو HUVEC)، يمكن أن يغير بشكل كبير كمية العدلات التصاق 14. قمنا بتقييم أيضا الاعتماد وقت الأحداث التصاق العدلة لوحظ في دراساتنا. في حين أننا الحفاظ على ظروف تدفق مستمر، فمن الممكن أن خصائص لاصقة من الخلايا تتغير مع مرور الوقت. However، خلال دورات زمنية قصيرة نسبيا في دراساتنا، ونحن لا نلاحظ أي خلافات متسقة في معدل التصاق مع مرور الوقت. على سبيل المثال، تقييم التصاق في 1-2 نقاط زمنية دقيقة مقارنة مع التصاق لوحظ بين 3-4 نقاط زمنية دقيقة لا تختلف باستمرار. بطبيعة الحال، إذا كان يتم تحفيز الخلايا خلال التجربة التصاق، ثم يغير في خصائص لاصقة مع مرور الوقت يمكن أن يتوقع. في دراساتنا، ونحن الخاضعة للرقابة لعزل تفعيل العدلات الناجم عن فتيلة عمدا الخلايا مع جرعة منخفضة fMLP (10 -8 م) لمدة 10 دقيقة قبل الدراسة. الخلايا البطانية (HUVEC في دراساتنا) يتطلب أيضا تفعيل قبل upregulate التصاق جزيء التعبير الأمثل للالتصاق شركة الكرية البيضاء. في غياب ما قبل المعالجة، سوف الخلايا البطانية (HUVECs) دعم القليل جدا من العدلات التصاق. في دراساتنا، استخدمنا 10 نانوغرام / مل العلاج TNFα لمدة 4-6 ساعة قبل استخدامها. IL-1β (10 نانوغرام / مل) و<html> ويمكن أيضا LPS (0.5-1 ميكروغرام / مل) أن تستخدم ما قبل تفعيل الخلايا البطانية. الأهم من ذلك، غير المعالجة HUVEC يمكن استخدامها لمكافحة السلبية لضمان التصاق الخلية يسببه محددة (بوساطة مستقبلات) العدلة البطانية التفاعلات الخلية. بدلا من ذلك، الأجسام المضادة للمستقبلات يمكن استخدامها لمنع مستقبلات محددة لتقييم خصوصية الالتصاق. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" /> الشكل 1. تدفق التكوين غرفة على المسرح المجهر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> oad/51410/51410fig2.jpg &quot;/&gt; طلقات الشكل 2 الشاشة من شريط فيديو عينة من العدلات التمسك ICAM-1/P-Selectin السطح المطلي في نقاط زمنية مختلفة (A: 0 نقطة زمنية، B: 1 نقطة زمنية دقيقة، C: 2 نقطة زمنية دقيقة، وD: 4 نقطة زمنية دقيقة). تركيز ICAM-1 هو 25 ميكروغرام / مل و ف selectin هو 0.5 ميكروغرام / مل. سرعة تدفق العدلات هو 350 ميكرولتر / دقيقة مع الكثافة العدلة في 500،000 خلية / مل. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" /> طلقات الرقم 3 الشاشة من شريط فيديو عينة من العدلات التمسك السطح HUVEC المغلفة في نقاط زمنية مختلفة (A: 0 نقطة زمنية، B: 1 دقيقة نقطة زمنية، C: 2 نقطة زمنية دقيقة، وD: 4 دقيقة نقطة زمنية).سرعة تدفق العدلات هو 350 ميكرولتر / مل مع كثافة العدلة في 500،000 خلية / مل. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr ><td> نوع </td><td > موقع </td><td > إجهاد القص (dynes / سم 2) </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الشريان caroid المشتركة </td><td> 11.6 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الشريان خيشومي </td><td> 6.5 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الشريان الفخذي المشتركة </td><td> 4.3 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الأبهر الكظرية </td><td> 7.3 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الأبهر Supraceliac </td><td> 4.2 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الشريان fermoral سطحية </td><td> 4.4 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الوريدات </td><td> 0.5-5.0 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> أول الشرايين في شبكية العين </td><td> 40.2 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الشرايين الثانية الشبكية </td><td> 0.001 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> أول الأوردة الشبكية </td><td> 23.2 </td></tr><tr ><td> بشري </td><td> الأوردة الشبكية الثاني </td><td> 0.43 </td></tr><tr ><td> الكلب </td><td> الشريان caroid المشتركة </td><td> 15.8 </td></tr><tr ><td> أرنب </td><td> الشريان caroid المشتركة </td><td> 23.3 </td></tr><tr ><td> فأر </td><td> الشريان caroid المشتركة </td><td> 46.6 </td></tr><tr ><td> فأر </td><td> الشريان caroid المشتركة </td><td> 64.8 </td></tr><tr ><td> الكلب </td><td> الشريان الفخذي المشتركة </td><td> 9.8 </td></tr><tr ><td> أرنب </td><td> الشريان الفخذي المشتركة </td><td> 156.8 </td></tr><tr ><td> فأر </td><td> الشريان الفخذي المشتركة </td><td> 65.9 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. إجهاد القص عينة في مختلف الأجهزة والأنواع المختلفة. * تلخيص من المراجع 13، 16، 19، و 20.

Watch this Scientific Journal Video about Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay at JoVE.com

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

وتفيد التقارير ان طريقة quantitating العدلات التصاق. هذا الأسلوب يخلق بيئة ديناميكية تدفق مماثلة لتلك التي واجهتها في أحد الاوعية الدموية. لأنها تتيح التحقيق في العدلات التصاق إما جزيئات الالتصاق المنقى (يجند) أو البطانية الركيزة الخلية (HUVEC) في سياق مماثل على البيئة في الجسم الحي مع الإجهاد الهائل.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.7K Views.  University of Alabama at Birmingham.  وتفيد التقارير ان طريقة quantitating العدلات التصاق. هذا الأسلوب يخلق بيئة ديناميكية تدفق مماثلة لتلك التي واجهتها في أحد الاوعية الدموية. لأنها تتيح التحقيق في العدلات التصاق إما جزيئات الالتصاق المنقى (يجند) أو البطانية الركيزة الخلية (HUVEC) في ...

Video: Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

المبسطة الإنسان الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) عزل والمناولة

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

إعداد نخاع العظام كله لتحليل الكتلة الخلايا من الخلايا العدلية النسب

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...