كان مدعوما من قبل جامعة BS من برنامج تدريب ميلان صيف بيكوكا بحوث الطلاب؛ وأيد البحوث من أموال الوزارة الإيطالية الصحة ووزارة التربية والتعليم الإيطالية، جامعة والبحوث وFONDAZIONE Humanitas إلى GC، ونحن بفضل مايكل VG لاترونيكو لقراءة نقدية لل مخطوطة.

1. صيانة خالية من الطاعم والركض من الجذع خطوط الخلايا البشرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأطباق على Matrigel المغلفة. ذوبان الجليد قارورة واحدة من الإنسان ماتريكس ESC-المؤهلين على الجليد لمدة ساعة واحدة وتمييع في 25 مل DMEM-F12 المتوسطة. إضافة 1 مل لكل 35 مم لوحة (أو المبالغ المعادلة في المساحة بالمتر المربع إذا تم استخدام الأطباق الأخرى)، وحفظ كل شيء على الجليد والتأكد من أن جميع لوحات وأنابيب هي مرحلة ما قبل المبردة. تغطية لوحات بورق الألمنيوم. </li></ol> ملاحظة: تركيزات الأسهم Matrigel تختلف من دفعة واحدة. يشار إلى تعليمات التخفيف على ورقة البيانات. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على لوحات على الجليد بين عشية وضحاها وإزالته من الجليد في اليوم التالي. يمكن أن تظل لوحات في الثلاجة مدة تصل إلى أسبوع واحد قبل استخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة كاملة mTESR1 (أو ذوبان الجليد قارورة من Nutristem المتوسطة) وH-ESM (متوسطة ESC الإنسان) وفقا للجدول أدناه. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> CONC نهائي </td><td> ل 500 مل </td></tr><tr><td> خروج المغلوب استبدال المصل (KSR) </td><td> 20٪ </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 مم </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> MEM غير الضرورية، الأحماض الأمينية </td><td> 0.1 ملي </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> 100 U / مل - 0.1 ملغ / مل </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> 2 المركابتويثانول </td><td> 0.1 ملي </td><td> 900 ميكرولتر </td></tr><tr><td> B27 الملحق - دون فيتامينا </td><td> 1٪ </td><td> 10 مل </td></tr><tr><td> N2 الملحق </td><td> 1٪ </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> خروج المغلوب DMEM </td><td> - </td><td> 370 مل </td></tr></tbody></table> ويمكن تخزين المتوسطة السهم عند 4 درجة مئوية لمدة لا يزيد عن 2 أسابيع. لإعداد المتوسطة النمو الشامل، يضاف جمعية جيل المستقبل الأساسية قبل احتساب فقطالتغذية الإلكترونية في تركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل. </li></ol> ملاحظة: أكمل H-ESM مشروطة الخلايا الليفية الماوس الجنينية يمكن أن تستخدم بدلا من mTESR1 أو Nutristem لخلايا الجذع. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات مغلفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة قبل الركض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي passaged الخلايا تقريبا كل 5 أيام، حتى إن لم تكن قد وصلت التقاء. المستعمرات لا ينبغي أن لمس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة النمو مع 1 مل من dispase (1 ملغ / مل، ويحل من ملغ / مل الأسهم 10 في PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التمييز المناطق التي انسحبت الزجاج ماصات باستور. وتشمل المجالات التي يجب إزالة الهياكل الحفرة تشبه أو الكيسي في وسط المستعمرات، وأية مناطق حيث أصبحت الخلايا فصلها عن المستعمرات وبالارض ويبدو أن تهاجر إلى الخارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية تحت غطاء الثقافة حتى تصبح حدود مستعمرة أكثر إشراقا وتبدأ في فصل (عادة حوالي 5-7 دقائق). Discarد dispase. تغسل مع 1 مل H-ESM وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 1 مل H-ESM، استخدام رافعة للخلية (ملعقة تشبه مكشطة) إلى المستعمرات الحصاد وجمع في 15 مل أنبوب إيبندورف. شطف مع 1 مل H-ESM وإضافة إلى الأنبوب. تدور في إطار التعاون الإقليمي 1،000 لمدة 4 دقائق وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 1 مل المتوسطة النمو قبل حرارة (إما mTESR1 أو Nutristem). تجنب تفتيت كتل كثيرا - ماصة صعودا وهبوطا أقل من 6-8X. تحديد عدد الخلايا يجب أن يكون مطلي وإزالة الخلايا لا لزوم لها (عادة 1:04 أو 1:05 تمييع)، على سبيل المثال لوحات 2 في 01:05، إزالة 600 ميكرولتر، ثم يضاف 1.6 مل المتوسطة الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة Matrigel من لوحات. الخلايا مكان قطرة قطرة، وتوزيع بالتساوي على طبق من ذهب. تجنب هز أنبوب بشكل مفرط، وهذا سوف يسبب الخلايا على التحرك نحو الوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أنبوب مع 1 مل المتوسطة والفجوة بين لوحات. الحجم النهائي في كل لوحة يجب أن يكون 1.5 -2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير متوسطة كل يوم، باستثناء يوم بعد الركض. على الرغم من أنهمثالية لتغيير اليومية المتوسطة، وهذا قد يتغير أحيانا على تردد مرة واحدة كل يومين إذا مرت لا يزيد عن 2-3 أيام منذ صدور آخر دون التأثير المحتمل تعدد القدرات أو تمايز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا يجب تجميد خط الخلية، اعادة تعليق بدلا من ذلك في 1-2 مل mFreSR تجميد المتوسطة باستخدام 2 مل ماصة ومكان 1 مل / cryovial. مكان قارورة في cryobox في -80 درجة مئوية، ونقل إلى النيتروجين السائل في 3-4 أيام. </li></ol> ملاحظة: يجب إجراء تسليخ مجهري يدوي من خلايا الجذع تحت stereomicroscope. في المختبر الإخصاب (التلقيح الاصطناعي) محطة العمل (على سبيل المثال على محطة العمل IVF من KSystem) متكاملة مع stereomicroscope يسمح التلاعب في الخلايا في ظروف معقمة في حين يتم الاحتفاظ بها على مساحة سطح ساخن. إذا كان هذا غير متوفر، وهو stereomicroscope يمكن نقلها تحت التدفق المنتظم لالصفحي هود. 2. مضغي الشكل الهيئات تجميع والقلب Inductioن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد EBM-20 المتوسطة وفقا للجدول أدناه. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> CONC نهائي </td><td> ل 500 مل </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني (المنشأ أمريكا الجنوبية) </td><td> 20٪ </td><td> 100 مل </td></tr><tr><td> الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM </td><td> 0.1 ملي </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> البنسلين - الستربتوميسين </td><td> 100U/ml - 0.1 ملغ / مل </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0.1 ملي </td><td> 5 مل </td></tr><tr><td> 2 المركابتويثانول </td><td> 50uM </td><td> 450 ميكرولتر </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 مل </td></tr></tbody></table> استخدام FBS من أمريكا الجنوبية الأصل هو أمر حاسم لتحديد كفاءة التمايز: توظيف أنواع أخرى من الأمصال قد تؤثرعملية التمايز. لإعداد كاملة EBM-20، حمض الاسكوربيك الاعلان (AA) إلى التركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. ويمكن تخزين متوسطة النمو الكامل في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد الجذع المستعمرات كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1،6-1،9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بلطف في 1 مل EBM-20 مع 2 مل ماصة. تجنب تفتيت كتل كثيرا - ماصة صعودا وهبوطا لا يزيد عن 2-3X، والتحقق من حجم المستعمرات تحت stereomicroscope. لوحة على لوحات مرفق منخفضة للغاية في نسبة 1:1 (على سبيل المثال لمم طبق 35، واستخدام 1 بئر من لوحة 6 جيدا). شطف أنبوب مع 1 مل EBM-20 وإضافة إلى لوحة. </li></ol> ملاحظة: حجم المستعمرات تؤثر على عملية التمايز، والسيطرة على كفاءة وتوقيت الاستقراء القلب. وقد ثبت تجميع متجانس الحجم EBS للحد من تقلب وحظ خلال التمايز. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم 3، تغيير EBM-20 مرة باستخدام مجهر لتجنب إعادةmoval من EBS. الحفاظ على ماصة على مقربة من حافة لوحة، وإزالة المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 7، والتبديل EBS لوحات المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين وضعت سابقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا لزم الأمر، يمكن إزالة الجيلاتين وترك لوحات تحت غطاء الثقافة خلية O / N. إضافة 35-40 EBS لكل 35 مم طبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق EBS لضرب مناطق وتغير EBM-20 مرتين في الأسبوع. وضع علامة خارج حيث توجد مناطق الضرب على الجزء العلوي من غطاء الطبق، لتسهيل توطين هم تحت stereomicroscope. يجب أن تظهر مجالات المقاولات بعد حوالي 10-20 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما المناطق مع انكماش عفوية تظهر، قم بالتبديل إلى متوسطة EBM-2 (إعداد وEBM-20، مع FBS 2٪ بدلا من ذلك) وعزلهم كما هو موضح أدناه في القسم 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة تحقق مناطق أخرى لضرب وتغيير متوسطة مرتين في الأسبوع حتى تكون هناك حاجة لمزيد من الضرب المناطق التجارب. </li></ol> ملاحظة: كفاءة عملية التمايز تعتمد بشكل كبير علىعدة عوامل، والأكثر أهمية من التي هي خطوط الخلايا المحددة ودفعة من المصل المستخدمة للحث على تمايز القلب. للحصول على أعلى كفاءة، خطوط الخلايا اختبار لإمكانية cardiomyogenic ودفعات مختلفة من المصل. 3. ضرب مناطق العزلة والثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف لوحات ال 12 جيدا (4 سم 2 مساحة) أو لوحات في المصالح مع 5 ميكروغرام / سم 2 فبرونيكتين، مخففة في برنامج تلفزيوني لجعل حجم ما يكفي لتغطية كامل سطح تماما (300 مجموع ميكرولتر لكل بئر في لوحات 12 أيضا). الحفاظ على كشف غطاء محرك السيارة في خلية ثقافة والسماح ليجف. لوحات يمكن أن تكون ملفوفة وتخزينها في 4 درجات CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة منطقة الضرب باستخدام الزجاج سحبت ماصة باستير ومشرط، حسب الحاجة. نقل لوحات فبرونيكتين المغلفة مع 1 مل ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل EBM-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطب لوحة للإشارة إلى المناطق التي أزيلت الخلايا وتغيير المتوسطة. يمكن أن تظل لوحات لمدة تصل إلى 1 في الشهر، كما قد تبدأ مناطق أخرى بالأكل في وقت لاحق. </li></ol> ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى كتل أصغر الضرب، ماصة منطقة explanted صعودا وهبوطا عدة مرات تحت stereomicroscope، حتى يكسر إلى قطع أصغر. وهذا سيؤدي في مجموعات من بضع خلايا في الضرب (انظر فيلم 3). <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع لتصبح جاهزة للتحليل. </li></ol> ملاحظة: العضلية الحصول عليها من هذا البروتوكول تمتلك الخصائص المورفولوجية والوظيفية الجنين مثل؛ نضوج نحو النمط الظاهري الكبار مثل ويمكن الحصول من خلال زيادة الوقت في الثقافة لمواصلة تمييز هذه الخلايا. 4. واحد ضرب زنازين العزل وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف الشرائح 2 غرفة (4 سم 2 منطقة) أو دعامات مناسبة أخرى مع 5 ميكروغرام / سم 2 فبرونيكتين المخفف في برنامج تلفزيوني كافية لتغطية سطح ثقافة بأكملها. إذا تم استخدام الدعم الزجاج، ومعطف مع laminin وفبرونيكتين (5 ميكروغرام / سم &lt;سوب&gt; 2 لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ضرب المنطقة مع ماصة باستير / مشرط من لوحات من الباب 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 1 مل، نقل الخلايا إلى أنبوب مل تحتوي على 500 ميكرولتر 15 كولاجيناز الثاني (480 U / مل في برنامج تلفزيوني مع المغنيسيوم والكالسيوم)، واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، والهز الأنبوب مرة واحدة خلال فترة الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 200 ميكرولتر. إذا تبقى أي كتل، ونقل إلى طازجة كولاجيناز الثاني وكرر الخطوة 4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 4.4 حتى يتم ترك أي كتل كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل كولاجيناز مع 3 مل EBM-2 (لا AA). ويمكن بعد ذلك غادر أنبوب تحت غطاء محرك السيارة في رفوف ساخنة حتى أنابيب أخرى جاهزة. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 1،000 لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه resuspend في 1 مل 0.25٪ التربسين / EDTA (المخفف من الأسهم بنسبة 0.5٪ في برنامج تلفزيوني 1X)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الجمع بين أجزاء من الهضم من نفس العينة الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل التربسين مع 4 مل EBM-2 (لا AA). تمر الخلايا من خلال إبرة 18G على 2.5 مل حقنة لا أكثر رهان 7X. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 1،000 لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلية بيليه في 1 مل EBM-2 لكل بئر وصفيحة. الخلايا يمكن استخدامها لتحليل وظيفي والصرفية بعد 2-3 أيام الطلاء. </li></ol>

<ol>
	<li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases:+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function.">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li><li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li><li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells.">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fresh+look+at+iPS+cells.">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li><li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders.">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li><li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells.">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li><li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li><li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome.">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li><li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li><li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia.">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy.">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).</li><li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes.">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells.">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li><li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes.">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li><li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome.">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li></ol>

لا المصالح المالية في الكشف عنها.

الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على التفريق بصورة عفوية إلى CMS، ولو مع انخفاض كفاءة والتباين الشديد بين السطور. ولذلك فقد ركزت تطوير طرق تحريض رواية على تحسين كفاءة العملية والتحرك نحو بروتوكولات أكثر تحديدا. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب التمايز جديدة معقدة ج...

تاريخيا، وقد استند التحقيق في الآليات الجينية والجزيئية القيادة التنمية البشرية ومرض على توليد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. ومع ذلك، تفشل العديد من الظواهر البشرية لتكراره بنجاح في الفئران، وذلك أساسا بسبب الاختلافات البيولوجية القائمة بين هذين النوعين. من ناحية أخرى، والوصول إلى الأنسجة البشرية قد تكون محدودة وغالبا لا تسمح ما يكفي من المواد التي يمكن الحصول عليها لإجراء دراسات تجريبية متعمقة. مجال البيولوجيا القلب والأوعية الدموية يعاني من كل هذه القيود: علم وظائف الأعضاء من قلب الإنسان يختلف كثيرا عن أن من الفأرة، وكمية كبيرة من أنسجة القلب يمكن الوصول إليها إلا بعد الوفاة أو أثناء عملية جراحية في القلب. العثور على مصدر الأمثل للتمايز وظيفي الإنسان مضادة وبالتالي تصبح موضوعا مركزيا في علم الأحياء القلب والأوعية الدموية، وأحرز الكثير من الجهد لمعالجة هذه المسألة. وقد اقترحت أنواع الخلايا المختلفة، وأناالتسبب myoblasts الهيكل العظمي والخلايا الجذعية المحلية القلب، العظام والخلايا وحيدات النوى نخاع، أسلاف البطانية، والخلايا الجذعية الوسيطة. ومع ذلك، الحصول على بيانات باستخدام هذه الخلايا لم تكن متسقة 4. اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) أولا (5) واكتشاف حجر الأساس لمشروع يسببها الجذعية (آي بي إس) الخلايا المحفزة بواسطة ياماناكا وطومسون 6،7 بدا في وقت لاحق لتقديم الحلول: هذه الخلايا لها القدرة على النمو إلى أجل غير مسمى والقدرة على إعطاء ترتفع إلى جميع مشتقات الخلية من الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك اتفاقية الأنواع المهاجرة. استخدام خلايا الجذع يقدم المزيد من المزايا: مشتق من خلايا بالغة ذاتي، وأنها تحمل نفس الجينوم كما الفرد أو المريض من التي تشتق منها. وبالتالي يسمح بتطوير نماذج في المختبر أن تسهيل التحقيق في الأمراض وآليات التنمية الجينية البشرية. في فضيلة من هذه الخاصية، يمكن خلايا الجذع أيضا سمشاكل vercome المتعلقة الرفض المناعي والقضايا الأخلاقية 8. لهذه الأسباب، على الرغم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا تزال تمثل المعيار الذهبي في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية، والباحثين في جميع أنحاء العالم تتجه الآن نحو مزيد من تكنولوجيا خلايا الجذع. ويجري الآن توظيف خلايا الجذع لنموذج المرض البشري في المختبر لمختلف الظروف، بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية الخلقية 9،10. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ تطبيق الجذع خلية النمذجة المرض لالأحادية الجين اضطرابات القلب (أي متلازمات QT طويلة، كاتيكولاميني متعددة الأشكال تسرع القلب البطيني) وأمراض في القلب العيوب التي هي جزء من النمط الظاهري المعقدة (مثل ليوبارد ومتلازمات تيموثي، تمدد عضلة القلب). وأكدت هذه التقارير أن الخلايا المحفزة المريض محددة أن يتم التمييز في مضادة عرض الخصائص المظهرية والوظيفية مشابهة لهذا المرض في الجسم الحي. ومع ذلك، هناكلا تزال العديد من التحديات لتحسين فعالية تحريض خلايا الجذع في النسب القلب. جيل عفوية اتفاقية الأنواع المهاجرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان عبر تشكيل التجميعية دعا الهيئات مضغي الشكل (EBS) أثبتت نجاح 17. منذ هذا الاكتشاف، تم اقتراح العديد من الطرق الأخرى. وقد عززت العديد من الجماعات كثيرا من كفاءة بروتوكول التمايز وانتقلوا نحو الكواشف ثقافة محددة كيميائيا وخالية من المنتجات الحيوانية (انظر التمثيل الصامت، C.، وآخرون، بحوث تداول (2012) لإجراء استعراض شامل لجميع الأساليب القائمة 3 ). ومع ذلك، فإن الأسلوب الكلاسيكي على أساس تجميع EB لا يزال يمثل الأكثر استخداما لإجراء الدراسات الفنية والتحقيق في آليات المرض. ويستند لدينا البروتوكول المقترح على تجميع خلايا الجذع في EBS والثقافة في وجود حمض الاسكوربيك والمصل، وهو ما ثبت لتعزيز عملية تمايز القلب وصتؤثر sitively نضوج هذه الخلايا 18،19. في هذه المقالة سوف تذهب من خلال هذه المنهجية بالتفصيل وسوف تظهر كيفية استخدام خالية من تغذية خطوط الخلايا المحفزة لتوليد المريض محددة IPS-مشتقة اتفاقية الأنواع المهاجرة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Media and Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ESC-qualified Matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Thaw the 5 ml bottle at 4 &deg;C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 &deg;C .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0896-2MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020-1MG</td>
			<td>Working concentration: 5 &mu;g/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (no Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-515F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (with Mg and Ca), 10X</td>
			<td>Bio Sera</td>
			<td>XC-S2067/500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, neutral protease, grade II</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 &deg;C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA, 0.5%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3924</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type 2</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>4176</td>
			<td>Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10829-018</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockout Serum Replacement (KSR)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Bovine Serum (origin South America)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 &deg;C, heat-inactivate at 56 &deg;C for 30 min, aliquot and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA, 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement, 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement, 50X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12587-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>Make stock at 1% in water, store at -20 &deg;C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td>Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 &deg;C. Do not keep complete medium at 4 &deg;C for more than 1 week</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutristem hESC XF</td>
			<td>Stemgent from Biological Industries</td>
			<td>05-100-1A</td>
			<td>Thaw at 4 &deg;C O/N, aliquot and store at -20 &deg;C until use. Aliquots may be kept at 4 &deg;C for no more than a week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mFreSR</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5853</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544-25G</td>
			<td>Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 &deg;C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Plasticware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm culture dishes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scraper</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3008</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>353043</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass 2-well chamber slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>177380</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, ultra-low-attachment surface</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3471</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18G needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes, 230 mm</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>612-1702</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 ml syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300188</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equipments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVF Workstation</td>
			<td>KSystem, by Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ1500 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of human cardiomyocytes: a differentiation protocol from feeder-free human induced pluripotent stem cells

من أجل التحقيق في الأحداث التي وقعت القيادة القلب والتنمية لتحديد الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى أمراض عضلة القلب في البشر، فمن الضروري أولا لتوليد العضلية الإنسان وظيفية (CMS). ومن شأن استخدام هذه الخلايا في اكتشاف المخدرات ودراسات علم السموم تكون أيضا مفيدة للغاية، مما يسمح للجزيئات الدوائية جديدة لعلاج اضطرابات القلب يمكن التحقق من صحة ما قبل سريريا على خلايا المنشأ البشرية. من المصادر المحتملة للCMS، الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) هي من بين الأكثر واعدة، لأنها يمكن أن تستمد مباشرة من الأنسجة للمريض في متناول الجميع وتكون لديها قدرة ذاتية تثير جميع أنواع الخلايا في الجسم 1. وقد اقترحت عدة طرق للتمييز بين خلايا الجذع في CMS، بدءا من الهيئات مضغي الشكل الكلاسيكي (EBS) نهج التجميع إلى بروتوكولات محددة الصفات كيميائيا 2،3. في هذه المقالة نقترح بروتوكول المستندة EBS، وتظهر كيف أن هذا methoويمكن استخدام D لتوليد بكفاءة وظيفية CM-مثل خلايا من خلايا الجذع خالية من وحدة التغذية.

في دراساتنا ولدت لنا مضادة من عدة خطوط الخلايا المحفزة. وقد تم توليد هذه السطور مبدئيا على طبقة المغذية MEF لكنها وضعت على الفور على Matrigel باستخدام وسيلة تعريف (إما mTESR1 أو Nutristem). واستخدمت مختلف المقايسات للتحقق من الحفاظ على الخصائص المورفولوجية، والتعبير عن علامات نمو...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

الخلايا الجذعية المحفزة، إما خلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة (آي بي إس)، تشكل مصدرا قيما للخلايا متمايزة الإنسان، بما في ذلك العضلية. هنا، سوف نركز على الاستقراء القلب من خلايا الجذع، والتي تبين كيفية استخدامها للحصول العضلية الإنسان وظيفية من خلال بروتوكول مضغي الشكل القائم على الجثث.

جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K Views.  Humanitas Clinical and Research Center, Italy. الخلايا الجذعية المحفزة، إما خلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة (آي بي إس)، تشكل مصدرا قيما للخلايا متمايزة الإنسان، بما في ذلك العضلية. هنا، سوف نركز على الاستقراء القلب من خلايا الجذع، والتي تبين كيفية استخدامها للحصول العضلية الإنسان وظيفية من خلال ?...

Video: Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

تعيين جيل من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان مع الإنسان الفيروسة البطيئة TF Stemgent

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

وبنقل العدوى إلى الإنسان Nucleofecting الجذعية المحفزة المستحثة خلايا

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

كفاءة الجيل المستحثة الإنسان افرة القوة الخلايا الجذعية من الخلايا الجسدية البشرية مع سينداي الفيروسات

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

التمايز كفاءة عالية من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان لالعضلية وتوصيف بواسطة التدفق الخلوي

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.

توليد وصيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالرئيسيات المشتقة من البول

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular ...

توصيف المستضدات السطحية والقدرة على الانتشار في MSCs التي تقود hiPSC

Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are restricted by limited donation, quality variations, and biosafety, the past 10 years have seen a great rise in efforts to generate MSCs from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Past and recent efforts in the differentiation of hiPSCs into MSCs have been centered around two culture methodologies: (1) the formation of embryoid bodies (EBs) and (2) the use of monolayer culture. This protocol describes these two representative methods in deriving MSC from hiPSCs. Each method presents its advantages and disadvantages, including time, cost, cell proliferation ability, the expression of MSC markers, and their capability of differentiation in vitro. This protocol demonstrates that both methods can derive mature and functional MSCs from hiPSCs. The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation, while the EB method is characterized by lower time consumption.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في iPSCs وأبحاث الأمراض الوراثية 

This protocol describes and compares two representative methods for differentiating hiPSCs into mesenchymal stromal cells (MSCs). The monolayer method is characterized by lower cost, simpler operation, and easier osteogenic differentiation. The embryoid bodies (EBs) method is characterized by lower time consumption.

مقارنة بين طريقتين تمثيليتين لتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا إلى خلايا لحمية وسيطة

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are adult pluripotent stem cells which have been widely used in regenerative medicine. As somatic tissue-derived MSCs are ...