هذا هو مرافق بروتوكول شامل، الخام يعزز توليد، واستخدام pouncing من المريض محددة، والثقافات من خلايا الدم المحيطية أحادية النووية. هذه التكتيكات قابلة للاستنساخ وسهلة المتابعة ، خاصة للمبتدئين. ولا تتطلب، خبير خاص في أغاني الخلايا الجذعية، أو طب القلب والأوعية الدموية.
يمكن استخدام بروتوكولنا لتوليد خلايا القلب الخاصة بالمرضى من سحب دم واحد يمكن استخدامه لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية واختبار سمية القلب للأدوية الجديدة. يتطلب هذا البروتوكول التزاما طويلا بإعادة برمجة الخلايا الجذعية والتمايز الموجه. ومع ذلك، كنت حقا نقدر مساعيكم.
عندما ترى ضرب خلايا القلب في الطبق. عندما تصل مستعمرات iPSC البشرية إلى أكثر من 90٪ التقاء ، اشطف كل بئر بثلاثة ملليلترات من DPBS قبل علاج الخلايا بميليلتر واحد من 0.5 ملليمولار EDTA في DPBS لكل بئر عند 37 درجة مئوية. بعد خمس إلى ثماني دقائق، إضافة ملليلتر واحد من iPSC تمرير المتوسطة إلى كل بئر وإزاحة الخلايا يدويا.
نقل 600 إلى 900 ميكرولتر من الخلايا إلى الآبار الفردية لديها غشاء الطابق السفلي المغلفة ستة لوحة بئر لاحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ثم قم بتحديث الثقافات مع اثنين من ملليلتر من المتوسط E8 كاملة كل يوم لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. عندما وصلت الثقافة إلى التقاء، استبدل الوسط بميليلترين من وسيط تمايز عضلة القلب، اثنان لكل بئر.
في اليوم الثاني، استبدل المضادات الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة. في اليوم الثالث، استبدل المضادات الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة الثالثة. في اليوم الخامس
استبدال supernatant مع اثنين من ملليلتر من التمايز cardiomyocyte متوسطة واحدة. في اليوم السابع إلى العاشر، استبدل الناطقة الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة الرابعة. في اليومين 11 و 13.
عند ملاحظة الخلايا المتعاقدة، استبدل الناطقة الفائقة بميليلترين من تمايز عضلة القلب المتوسطة الخامسة. في الأيام 15 و 17 و 19 و 21. استبدال supernatant مع اثنين من ملليلتر من التمايز cardiomyocyte المتوسطة أربعة.
بعد مرحلة ما قبل الثقافة مع كامل المتوسطة الدم في سبعة أيام، أصبح PBMC كبيرة مع نواة مرئية والسيتوبلازم مما يدل على أنهم على استعداد لtransfection مع عوامل إعادة برمجة فيروس سينداي. عند تقديم لإكمال المتوسطة E8. سوف ترفق الخلايا المبرمجة بالكامل وتبدأ في تشكيل المستعمرات.
بعد أربعة إلى خمسة مقاطع، سوف تتشكل مستعمرات iPSC نقية للغاية من الخلايا المبرمجة مع عدد قليل جدا من الخلايا المتمايزة التي لوحظت. في هذه المرحلة، معظم الخلايا هي OCT4 وNANOG إيجابية مؤشرا على pluripoteny بهم. عادة ما يلاحظ ضرب خلايا القلب بعد 12 يوما من التمايز.
بعد المجاعة الجلوكوز، وإعادة تمثيل المعارض iPSC cardiomyocytes، والضرب التلقائي، وهيكل ساركومير الانحياز مع تروبونين القلب المتشابكة T وتعبير أكتينين ألفا. تحتفظ المستعمرات بنقاوتها كما يتضح من تعبيرها T تروبونين. على الرغم من أن خلايا القلب iPSC غير ناضجة نسبيا بالمقارنة مع خلايا القلب الكبار.
أنها تظهر البطين وبطين مثل إمكانات العمل كما تقاس التصحيح بالجملة، المشبك. تعبر خلايا القلب البطينية عن سلسلة ضوء الميوسين الثانية ، في حين تتميز خلايا القلب الأذينية iPSC بتعبير NR2F2. تنشيط WNT تحفيز انقسام الخلية ويعزز التعبير عن المنظمين دورة الخلية.
ومن المثير للاهتمام، تنشيط WNT يحفز أيضا انتشار قوي من خلايا القلب iPSC في وقت مبكر لمقاطعتين بالمقارنة مع الضوابط، على الرغم من أن هذه القدرة التكاثرية يقلل مع مرور الوقت. تأكد من أن يتم توسيع PBMS مع النووية واضحة والسيتوبلازم قبل إدخال ناقلات إعادة برمجة iPSC كما شرط PBMs أمر بالغ الأهمية لإعادة برمجة iPSC. خلايا القلب الخاصة بالمريض ذات قيمة لنمذجة أمراض القلب والأوعية الدموية في المختبر وتوفير طن من الخلايا المانحة لعلاج الخلايا الجذعية القلبية.
