يصف هذا البروتوكول سير عمل لتوليد وصيانة وتحليل بصري للكرويات القلبية. هذه الكرويات القلبية ضرورية لسد الفجوة في نماذج الأمراض الحالية في المختبر. تسمح هذه التقنية للباحثين بإنشاء الجيل التالي من الفحص عالي الإنتاجية والتخزين الوظيفي للكرويات القلبية.
ابدأ بإضافة ملليلتر واحد لكل سنتيمتر مربع من محلول انفصال القلب المعقم إلى كل بئر من صفيحة الثقافة التي تحتوي على خلايا عضلية قلبية مشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات متقاربة يسببها الإنسان. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تأكد من انفصال الخلايا من خلال مراقبة الخلايا البيضاء والمستديرة الشكل تحت تكبير 4x لمجهر المجال الساطع.
باستخدام ماصة سعة خمسة ملليلتر ، قم بفصل الخلايا ميكانيكيا عن طريق غسلها بملليلتر من الوسط القاعدي الدافئ لإعداد تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق في 300g. ثم نضح المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسائط إعادة الطلاء hiPSC-CM.
استخدم طرف ماصة 1،000 ميكرولتر لفصل حبيبات الخلية. بعد ثلاث أو أربع خلطات ، حيث يبدو المحلول متجانسا ، قم بتحميله في كاسيت لحساب الخلايا ، ونقل الكمية المناسبة من الخلايا في 100 ميكرولتر من وسط إعادة الطلاء إلى كل بئر من ملحق منخفض للغاية ، مستدير القاع ، 96 صفيحة بئر. ضع صفيحة الكرات القلبية على شاكر مداري في الحاضنة عند 70 دورة في الدقيقة مع درجة حرارة 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، و 21٪ أكسجين ، و 90٪ رطوبة لمدة 24 ساعة.
لتجنب تمزق الكرة ، قم بشفط 50 ميكرولترا فقط من الوسط من كل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من RPMI بالإضافة إلى وسط B27 لكل بئر لأول 48 ساعة. بعد ذلك ، امسح 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ، وأضف 100 ميكرولتر من وسط النضج لكل بئر. الحفاظ على الخلايا في وسط النضج ، وتحديث الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام.
ضع الصفيحة الكروية على الثلج لمدة 10 دقائق للتبريد المسبق قبل الطرد المركزي للوحة لمدة ثلاث دقائق عند 70 جم. قم بإزالة الوسط حتى يبقى 50 ميكرولترا في البئر. ثم أضف 200 ميكرولتر من وسط التجميد hiPSC البارد لكل بئر.
ختم اللوحة مع فيلم ختم لوحة. لتحضير قالب السيليكون ، امزج مكونات مجموعة المطاط الصناعي السيليكوني بنسبة 10 إلى 1 ، وأضف المحلول داخل الجزء السفلي من لوحة البئر. قم بإزالة الفقاعات من المحلول باستخدام مضخة تفريغ لمدة 15 إلى 20 دقيقة.
ضع القالب في فرن ، وقم بمعالجته عند 60 درجة مئوية لمدة ثماني ساعات للحصول على مطاط صناعي شبه مرن يتم تقشيره من الطبق. ضع اللوحة محكمة الغلق بعناية في قالب سيليكون ، مما يضمن تبادلا حراريا موحدا بين لوحة البئر والفريزر. قم بتجميد اللوحة عند 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن أربع ساعات في قالب السيليكون المحضر قبل نقل اللوحة إلى خزان النيتروجين السائل أو الفريزر 150 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
لضمان ذوبان سريع للكرويات القلبية ، اجمع صفيحة خلية واحدة مع كرويات قلبية في وقت واحد من النيتروجين السائل ، وضعها في الحاضنة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ أكسجين و 90٪ رطوبة. قم بإزالة فيلم الختم من اللوحة ، ونضح 150 ميكرولترا من كل بئر قبل إضافة 200 ميكرولتر من الوسط القاعدي الدافئ إلى كل بئر. قم بطرد الطبق على 70 جم لمدة ثلاث دقائق ، وكرر الغسيل المتوسط القاعدي الدافئ.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بإزالة 150 ميكرولترا من الوسط ، وأضف 200 ميكرولتر من وسط ذوبان خلايا عضلة القلب في كل بئر. ثم كرر غسل RPMI كما هو مذكور أثناء توليد كروية القلب ، متبوعا بالحفاظ على الخلايا في وسط النضج. بعد أسبوع واحد من المزرعة ، تكون كرويات القلب المذابة مثالية للتصوير البصري للتعامل مع الكالسيوم.
نضح 150 ميكرولتر من كل بئر. عالج كرويات القلب المذابة ب 100 ميكرولتر من وسط صبغة الكالسيوم Cal-520 AM لكل بئر في الظروف المظلمة ، واحتضان اللوحة لمدة 60 دقيقة. قم بإعداد نظام اكتساب وتحليل الكالسيوم عن طريق تشغيل المجهر والتأكد من تشغيل خيار التحكم البيئي.
اضبط أبعاد الكاميرا وفتحة الإطار لتقليل مساحة الخلفية. لقياس إشارة الكالسيوم ، باستخدام ليزر 488 نانومتر ، اضبط التباين على خلفية سوداء مع إشارة خضراء ساطعة أثناء إطلاق الكالسيوم. سجل مقطع فيديو ببث ثابت من 2 إلى 10 قمم في غضون 10 ثوان.
سجل مقطع فيديو مدته 10 ثوان ، وامسح عبر اللوحة المكونة من 96 بئرا ، وانتقل في البداية إلى اليسار ، ثم لأسفل بطريقة متعرجة لتغطية اللوحة بأكملها. بعد الحصول على عابرات الكالسيوم ، قم بتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل آثار التألق. اكتسبت كرويات القلب بنية 3D بحلول اليوم الأول بعد البذر ، والتي يمكن استزراعها لمدة تصل إلى ستة أسابيع.
أعربت غالبية الكرات القلبية البالغة من العمر ثلاثة أسابيع عن تنظيم عضلي منتظم مع ألفا أكتينين وتروبونين T.أشارت المستويات العالية من ألفا أكتينين في اليوم صفر وكرويات القلب البالغة من العمر ثلاثة أسابيع إلى تكوين خلوي ثابت ونقي للغاية أثناء الاستزراع. لوحظ زيادة التعبير عن جينات القلب ، والديسموسومات ، والميتوكوندريا في الأجسام الكروية من hiPSC-CMs المزروعة في 2D لمدة 90 يوما. كانت نسبة ضربات الأجسام الكروية القلبية مماثلة في الأسابيع الثلاثة الأولى بعد التوليد وانخفضت بشكل ملحوظ في الأسبوع السادس بسبب تدهور الكرويات القلبية.
انخفض معدل الضرب بشكل ملحوظ في الأسبوع الثالث مقارنة وانخفض في الأسبوع السادس نتيجة للتدهور. أشارت المعلمات العابرة للكالسيوم إلى قيمة ذروة أعلى في الأسبوع الثاني ، في حين أن وقت الارتفاع ووقت الاضمحلال ومدة عبور الكالسيوم عند 90٪ من الاضمحلال زادت بشكل ملحوظ في الأسبوع الثالث ، مما يدل على أن الكرويات المشتقة من hiPSC-CM كانت مثالية وظيفيا في الأسبوعين الثاني والثالث بعد الجيل. زاد حجم الكرة مع عدد الخلايا المستخدمة في البذر.
في حجم أكبر ، كرويات قديمة ، كان الضرب أعلى بكثير. تم عرض معدل ضرب مماثل وأعلى بشكل ملحوظ بواسطة كرويات 5k و 10k و 20k مقارنة ب 2.5k كروية. لم يؤثر الحفظ بالتبريد على صلاحية الخلية داخل كرويات القلب.
يشير التعبير المماثل للبروتينات الساركومية في الأجسام الكروية المذابة والطازجة المطابقة للعمر إلى كفاءة الحفظ بالتبريد. لم يكن هناك تغيير كبير في معدل ضربات كرويات القلب المذابة أو الطازجة. لم تلاحظ أي تغييرات كبيرة في وقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال ، و CTD90 من CS المذاب أو الطازج. بجانب نمذجة الأمراض وفحوصات الأدوية عالية الإنتاجية ، يمكن أيضا استخدام هذه الأجسام الكروية في المفاعلات الحيوية لإنتاج الحويصلة خارج الخلية والعلاجات المتعلقة بالحويصلة خارج الخلية.
أيضا ، يمكن استخدام البنوك الحيوية لهذه الأجسام الكروية كمصدر جديد لخلايا عضلة القلب لاستراتيجيات التجدد. تشير الأدلة المتراكمة إلى أن البنوك الحيوية لنماذج الخلايا الجذعية المشتقة من المريض للتليف الكيسي والسرطان وكروية القلب لديها إمكانات كبيرة لتفكيك الآليات الجزيئية لفحوصات الأدوية والطب الشخصي.
