نشكر يلكنز ستيفان لمساعدة في انتقال المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AG023731.

وقد أظهرت دراسات سابقة أن أول محطة الأمينية 22 مخلفات Mgm101 يتم المشقوق بعد الاستيراد في الميتوكوندريا 19. للتعبير في الإشريكية القولونية، يتم تضخيمه MGM101 إطار القراءة المفتوح تفتقر إلى الكودونات أول 22 بواسطة PCR وضعت المصب من تسلسل ذكر ترميز البروتين ملزمة المالتوز (ب ب) في نسخة معدلة من ناقلات التعبير pMAL-C2E. هذا يولد الانصهار MBP-Mgm101 مع رابط موقع يحتوي على الانقسام لالبروتيني PreScission (الشكل 3). البلازميد هي التي شيدت أول من خلال تحديد E. transformants القولونية دون IPTG وXgal اختيار أزرق / أبيض. ثم يتم إدخال البلازميد الناتج pMAL-C2E-MGM101 في E. كولاي سلالة BL21-CodonPlus (DE3)-ريلاينس اندستريز من خلال تحديد الأمبيسلين والمستعمرات مقاومة الكلورامفينيكول. 1. التعبير، والاستقراء، تحلل الخليوي وأنا الدناز العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شركة النفط الوطنية العراقيةulate transformants الطازجة في 10 مل من المتوسط ​​LB (1٪ Bacto تريبتون، 0.5٪ مستخلص الخميرة، 1٪ كلوريد الصوديوم) تستكمل مع الجلوكوز (0.2٪)، الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) والكلورامفينيكول (50 ميكروغرام / مل). احتضان عند 37 درجة CO / N مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح preculture مل 10 إلى 2 ليتر من المتوسط ​​LB تستكمل على النحو الوارد أعلاه. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية مع الهز حتى تصل إلى 0.5 OD 600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحث على التعبير عن بروتين الانصهار MBP-Mgm101 بإضافة الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في تركيز النهائي من 0.3 ملم. تنمو الخلايا مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية لمدة 5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي باستخدام بيكمان JA-10 الدوار (5،500 x ج، 4 ° C، 10 دقيقة). بعد تجاهل طاف، resuspend وبيليه خلية في 30 مل من تحلل العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 و 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (25 leupeptin ميكرومتر، ميكرومتر 1 pepstatin A و 1 ملي PMSF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن تعليق الخلية على الجليد لمدة 20ثانية باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية (نظم الحرارة؛ نموذج W-385) في دورة العمل 50٪، والسماح لتبرد على الجليد لمدة 30 ثانية، وكرر 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من 1 الأسهم الدناز في 2 ملغ / مل. صخرة المحللة الخلية في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط كلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 500 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 XG في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. </li></ol> 2. تنقية أميلوز مع تقارب اللوني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتوازن 1.5 مل من راتنج أميلوز (50٪ الطين) في تحلل العازلة. إضافة الراتنج أميلوز معايرتها إلى المحللة الخلية. صخرة بلطف عند 4 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مزيج المحللة الراتنج على عمود اللوني فندق Econo عمود تركيبها في غرفة باردة. السماح للبروتينات غير منضم لتمرير العمود عن طريق الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الراتنج أميلوز مع 300 مل من غسل العازلة الأول (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4؛ 400 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار غسل مع 150 مل من غسل العازلة الثاني (20 ملي TRIS، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من شطف العازلة (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF، 10 ملي المالتوز) إلى العمود، واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وجمع شطافة وكرر لأكثر من مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين eluates، وتحديد العائد ونقاء MBP-Mgm101 عن طريق تحميل قسامة من شطافة على هلام SDS-PAGE تليها coomassie تلطيخ (الشكل 4). </li></ol> 3. PreScission الشق البروتيني والموجبة تبادل اللوني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 وحدة من الأنزيم البروتيني PreScission إلى شطافة MBP-Mgm101. أداء انشقاق في 4 درجات CO / N والسماح لها بمواصلة خلال غسيل الكلى ضد العازلة غسيل الكلى (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم، 2 مم DTT؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4، و0.2 ملم PMSF) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من كفاءة الانقسام على هلام SDS-PAGE (الشكل 5A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل المشقوق MBP-Mgm101 بواسطة حقن متعددةالأيونات على الحيوية البسيطة مقياس ماكرو الإعدادية عالية S خرطوشة متصلا DuoFlow بيولوجي نظام FPLC بيو راد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء اللوني تبادل الأيونات الموجبة عن طريق تطبيق التدرج خطوة الملح 5 ملم، 300 ملم، 500 ملم، 750 ملم و 1،000 ملم من كلوريد الصوديوم الذي يتم إنشاؤه عن طريق خلط العازلة A (5 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملي PMSF) والعازلة B (1 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.2، 1 ملم PMSF). ضبط معدل تدفق عند 0.5 مل / دقيقة. جمع الكسر Mgm101 والتحقق من نقاء من البروتين على هلام SDS-PAGE (الشكل 5B). </li></ol> 4. حجم اللوني الاستبعاد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكسور البروتين من اللوني تبادل الأيونات الموجبة. Dialyze البروتين في المخزن موازنة GF (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم؛ 1MM EDTA، ودرجة الحموضة 7.4؛ 5 مم 2 المركابتويثانول؛ 0.2 ملم PMSF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز البروتين مع VIVASPIN 15R الترشيح الفائق عمود الدوران للحد من حجم إلى ~ 1 مل من خلال الدوران في 3،000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل Mgm101 سNA معايرة Superose 6 الإعدادية الصف العمود معايرتها مع العازلة اللوني (20 ملي اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.0، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي β-المركابتويثانول؛ 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.4؛ 0.2 ملم PMSF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الاستبعاد حجم المخزن المؤقت مع اللوني تشغيل بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكسور لتنقية Mgm101 القمم. تحميل مأخوذة من الكسور على 12٪ SDS-PAGE لفحص الجودة النهائية من البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز البروتين مع VIVASPIN 6، ثم تجمد بسرعة العينات في N2 السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام Mgm101 العينات في غضون 6-12 شهرا لفحص ssDNA ملزم (الشكل 8) وعن التصور الهيكلي من قبل انتقال الإلكترون المجهري (الشكل 9). </li></ol>

<ol>
	<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+eukaryotic+homologous+recombination.">Mechanism of eukaryotic homologous recombination.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).</li><li>Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMC1:+a+meiosis-specific+yeast+homolog+of+E.+coli+recA+required+for+recombination,+synaptonemal+complex+formation,+and+cell+cycle+progression.">DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression.</a> Cell. 69, 439-456 (1992).</li><li>Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rad51+protein+involved+in+repair+and+recombination+in+S.+cerevisiae+is+a+RecA-like+protein.">Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein.</a> Cell. 69, 457-470 (1992).</li><li>Passy, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Dmc1+protein+binds+DNA+as+an+octameric+ring.">Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).</li><li>Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+E.+coli+recA+protein+monomer+and+polymer.">The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer.</a> Nature. 355, 318-325 (1992).</li><li>Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+dynamics+in+the+helical+filaments+formed+by+RecA+and+Rad51+on+DNA.">Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).</li><li>Conway, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Rad51+filament.">Crystal structure of a Rad51 filament.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).</li><li>Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+allele+of+RAD52+that+causes+severe+DNA+repair+and+recombination+deficiencies+only+in+the+absence+of+RAD51+or+RAD59.">A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59.</a> Genetics. 153, 1117-1130 (1999).</li><li>Bai, Y., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rad52+homolog+is+required+for+RAD51-independent+mitotic+recombination+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).</li><li>Paques, F., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+of+recombination+induced+by+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).</li><li>Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+recombinases+in+bacteriophage+genomes+unveils+Rad52,+Rad51+and+Gp2.5+remote+homologs.">Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs.</a> Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).</li><li>Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+structure+and+quaternary+organization+of+the+bacteriophage+P22+Erf+protein.">Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein.</a> J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).</li><li>Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rings+and+filaments+of+beta+protein+from+bacteriophage+lambda+suggest+a+superfamily+of+recombination+proteins.">Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).</li><li>Ploquin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+basis+for+a+bacteriophage+homolog+of+human+RAD52.">Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52.</a> Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).</li><li>Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGM101,+a+nuclear+gene+involved+in+maintenance+of+the+mitochondrial+genome+in+Saccharomyces+cerevisiae.">MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).</li><li>Meeusen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101p+is+a+novel+component+of+the+mitochondrial+nucleoid+that+binds+DNA+and+is+required+for+the+repair+of+oxidatively+damaged+mitochondrial+DNA.">Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA.</a> J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).</li><li>Mbantenkhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mgm101+is+a+Rad52-related+protein+required+for+mitochondrial+DNA+recombination.">Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination.</a> J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).</li><li>Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+properly+configured+ring+structure+is+critical+for+the+function+of+the+mitochondrial+DNA+recombination+protein.">A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein.</a> Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).</li><li>Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+core+of+the+mitochondrial+genome+maintenance+protein+Mgm101p+in+Saccharomyces+cerevisiae+determined+with+a+temperature-conditional+allele.">A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele.</a> FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).</li><li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+packaging+proteins+Glom+and+Glom2+coordinately+organize+the+mitochondrial+nucleoid+of+Physarum+polycephalum.">DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum.</a> Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).</li><li>Janicka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RAD52-like+single-stranded+DNA+binding+protein+affects+mitochondrial+DNA+repair+by+recombination.">A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination.</a> Plant J. 72, 423-435 (2012).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

لقد كان التحدي لإنتاج مستقر، وأصلي المؤتلف Mgm101 البروتين من E. القولونية وربما يعود ذلك إلى الذوبان في الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير، وتبين لنا أن الاستراتيجية MBP الانصهار يسمح للبروتين أن أعرب على مستوى عال إلى حد معقول. باستخدام السلبية تلطيخ انتقال المجهر ?...

إعادة التركيب مثلي المهم لإصلاح مزدوج الجديلة فواصل (DSBs) وinterstrand crosslinks، وباستعادة تكرار الحمض النووي من تكرار الشوك المنهارة 1. في إعادة التركيب مثلي التقليدية، يتم تحفيز رد الفعل المركزي من قبل recombinases التي تعتمد على ATP بما في ذلك RECA في بدائيات النوى، وRad51 وDmc1 في حقيقيات النوى 1-3. هذه recombinases تشكيل خيوط البروتين النووي على ssDNA، التي تعتبر ضرورية للبدء في البحث عن التماثل وغزو حبلا ضمن قوالب الحمض النووي المزدوجة (الشكل 1، لوحة اليسار) 4-7. بالإضافة إلى مخطط التقليدية، ويمكن إعادة التركيب مثلي أيضا أن تأخذ مكان بطريقة RecA/Rad51-independent (الشكل 1، لوحة على اليمين). على سبيل المثال، يمكن أن الخميرة Rad52 وRad59 البروتينات تحفز بشكل مباشر على الصلب من فروع ssDNA التكميلية التي يتعرض لها من قبل resectioning من فواصل dsDNA. هذه العملية إعادة التركيب، والمعروفة باسم الغناءجنيه حبلا الصلب، وعموما لا تنطوي على الاقتران مثلي مع القوالب dsDNA. بعد الصلب، يتم إزالة ذيول مغاير من قبل exonucleases وو تربط النكات لاستعادة 8-10 استمرارية الجينوم. وغالبا ما يترافق إصلاح من قبل آلية الصلب حبلا واحد عن طريق الحذف من تسلسل الجينوم بين المناطق المتكررة مباشرة. Rad52 ينتمي إلى مجموعة متنوعة من البروتينات إعادة التركيب التي هي على نطاق واسع بين البكتيريا 11. وتعرف هذه البروتينات أيضا باسم ضفيرة واحدة البروتينات التليين (SSAPs)، على أساس نشاطهم في تعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. أفضل SSAPs البكتيريا تتميز هي Redβ وإيرف من البكتيريا λ وP22، مصحح من RAC طليعة العاثية والبروتين ساك من فج lactococcal ul36. وتتميز هيكليا SSAPs من قبل أضعاف β-β-β-α نموذجي، على الرغم من التشابه هو undetect تقريباقادرة في تسلسل الابتدائي. أنهم جميعا شكل حلقات هومو بلازميدة قليلة القسيمات كبير من 10-14 أضعاف التناظر في المختبر 12-14. الآثار الوظيفية لهذه المنظمة مميزة مرتبة أعلى الهيكلية ليست مفهومة جيدا. ونحن مهتمون في فهم آلية إعادة التركيب مثلي في الجينوم الميتوكوندريا. حددنا سابقا الجين MGM101 التي لا غنى عنها للحفاظ على و mtDNA في خميرة الخباز 15. تم العثور MGM101 في وقت لاحق أن تكون مرتبطة مع nucleoids الميتوكوندريا ومطلوب من أجل التسامح و mtDNA من الحمض النووي للعوامل المضرة 16. ومع ذلك، فقد تم عقد دراسة Mgm101 مرة أخرى في العقد الماضي من قبل صعوبة لإنتاج Mgm101 المؤتلف. لقد نجحنا مؤخرا في إنتاج Mgm101 قابل للذوبان في كميات كبيرة من E. القولونية باستخدام استراتيجية MBP الانصهار. وقد مكن هذا لنا لإثبات أن Mgm101 سهمأوجه التشابه البيوكيميائية والهيكلية مع Rad52-عائلة من البروتينات 17،18. في هذا التقرير، وصفت إجراء تنقية ثلاث خطوات، والتي تنتج Mgm101for التحليلات البيوكيميائية والهيكلية متجانس (الشكل 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vector pMAL-c2E</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#N8066S</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PreScission Protease</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>#27-0843-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells</td>
			<td>Strategene</td>
			<td>#230245</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11034626001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11359053001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#10837091001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#DN25-1G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td>#11411446001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amylose resin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>#E8021L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Econo-Column chromatography column</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#7372512</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#732-4130</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS15RH02</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superose 6 prep grade column</td>
			<td>Amersham Bioscirnces</td>
			<td>#17-0489-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)</td>
			<td>Sartorius Stedium</td>
			<td>#VS0611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the mgm101 recombination protein by mbp-based tagging strategy

تم التعرف على الجين MGM101 قبل 20 عاما لدوره في الحفاظ على الحمض النووي. واشارت دراسات عدة مجموعات من أن البروتين Mgm101 وتشارك في إصلاح تهجيني من الحمض النووي. وأشارت التحقيقات الأخيرة التي Mgm101 تتعلق Rad52 من نوع إعادة التركيب عائلة البروتين. هذه البروتينات تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبير وتعزيز الصلب من جزيئات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد مثلي. ومع ذلك، فقد أعاقت توصيف Mgm101 من صعوبة في إنتاج البروتين المؤتلف. هنا، يوصف إجراء موثوق بها لإعداد المؤتلف Mgm101. المالتوز البروتين ملزمة (ب ب) الموسومة Mgm101 يتم التعبير الأول في الإشريكية القولونية. يتم تنقيته من البروتين الانصهار في البداية من قبل أميلوز تقارب اللوني. بعد إطلاق سراحه من قبل انشقاق بروتين، يتم فصل Mgm101 من MBP بواسطة الموجبة اللوني الصرف. يتم الحصول على Monodispersed Mgm101 ثمحسب حجم الاستبعاد اللوني. العائد من ~ 0.87 ملغ من Mgm101 للتر الواحد من ثقافة البكتيرية ويمكن الحصول بشكل روتيني. وMgm101 المؤتلف ديه الحد الأدنى من التلوث من الحمض النووي. يتم استخدام عينات معدة بنجاح لالبيوكيميائية والهيكلية واحد الجسيمات تحليلات صورة Mgm101. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لإعداد البروتينات الحمض النووي ملزم بلازميدة قليلة القسيمات الكبيرة الأخرى التي يمكن أن تتجمع وسامة للخلايا البكتيرية.

Mgm101 هو بروتين إعادة التركيب ذات الصلة Rad52 في الميتوكوندريا. وقد درس على نطاق واسع Rad52 لدورها في إعادة التركيب الحمض النووي (الشكل 1). المؤتلف Mgm101 يمكن أن تعده إجراء ثلاث خطوات (الشكل 2). ومما يسهل ذلك عن طريق استخدام استراتيجية MBP الجغرافية التي تسمح Mgm101...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy at JoVE.com

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموجبة وحجم الاستبعاد اللوني.

إعداد البروتين التوحد Mgm101 بواسطة استراتيجية توصيف المستندة إلى MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

preparation-mgm101-recombination-protein-mbp-based-tagging

Research

JoVE Journal

Biology

12.0K Views.  State University of New York Upstate Medical University. الخميرة الميتوكوندريا البروتين نوواني، Mgm101، هو من نوع البروتين Rad52 إعادة التركيب التي تشكل حلقات بلازميدة قليلة القسيمات كبيرة. يوصف بروتوكول لإعداد Mgm101 المؤتلف للذوبان باستخدام البروتين ملزمة مالتوز (ب ب) الجغرافية الاستراتيجية إلى جانب تبادل الأيونات الموج?...

Video: Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the BRCA1 have been complicated by the lack of a robust assay for the full length BRCA1 protein and the difficulties inherent in working with cell lines that express hypomorphic BRCA1 protein1,2,3,4,5. We developed a system whereby the endogenous BRCA1 protein in a cell was acutely depleted by RNAi targeting the 3'-UTR of the BRCA1 mRNA and replaced by co-transfecting a plasmid expressing a BRCA1 variant. One advantage of this procedure is that the acute silencing of BRCA1 and simultaneous replacement allow the cells to grow without secondary mutations or adaptations that might arise over time to compensate for the loss of BRCA1 function. This depletion and add-back procedure was done in a HeLa-derived cell line that was readily assayed for homologous recombination activity. The homologous recombination assay is based on a previously published method whereby a recombination substrate is integrated into the genome (Figure 1)6,7,8,9. This recombination substrate has the rare-cutting I-SceI restriction enzyme site inside an inactive GFP allele, and downstream is a second inactive GFP allele. Transfection of the plasmid that expresses I-SceI results in a double-stranded break, which may be repaired by homologous recombination, and if homologous recombination does repair the break it creates an active GFP allele that is readily scored by flow cytometry for GFP protein expression. Depletion of endogenous BRCA1 resulted in an 8-10-fold reduction in homologous recombination activity, and add-back of wild-type plasmid fully restored homologous recombination function. When specific point mutants of full length BRCA1 were expressed from co-transfected plasmids, the effect of the specific missense mutant could be scored. As an example, the expression of the BRCA1(M18T) protein, a variant of unknown clinical significance10, was expressed in these cells, it failed to restore BRCA1-dependent homologous recombination. By contrast, expression of another variant, also of unknown significance, BRCA1(I21V) fully restored BRCA1-dependent homologous recombination function. This strategy of testing the function of BRCA1 missense mutations has been applied to another biological system assaying for centrosome function (Kais et al, unpublished observations). Overall, this approach is suitable for the analysis of missense mutants in any gene that must be analyzed recessively.

We provide a method for testing BRCA1 variants in a tissue culture based assay for homologous recombination repair of DNA damage by depleting endogenous BRCA1 protein from a cell using RNAi and replacing it with a BRCA1 point mutant that contains a coding change.

تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1

The functional analysis of missense mutations can be complicated by the presence in the cell of the endogenous protein. Structure-function analyses of the ...

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood 4. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo5. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-1116,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands8. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

A technique to genetically manipulate epithelial cells within whole ex vivo cultured embryonic mouse submandibular glands (SMGs) using viral gene transfer is described. This method takes advantage of the innate ability of SMG epithelium and mesenchyme to spontaneously recombine after separation and infection of epithelial rudiments with adenoviral vectors.

تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a genetic model organism for human-disease related research. Recent years have seen technical advancements like homologous recombination and recombineering. However, generating unequivocal null mutations or tagging endogenous proteins remains a substantial effort for most genes. Here, we describe and demonstrate techniques for using recombineering-based cloning methods to generate vectors that can be used to target and manipulate endogenous loci in vivo. Specifically, we have established a combination of three technologies: (1) BAC transgenesis/recombineering, (2) ends-out homologous recombination and (3) Gateway technology to provide a robust, efficient and flexible method for manipulating endogenous genomic loci. In this protocol, we provide step-by-step details about how to (1) design individual vectors, (2) how to clone large fragments of genomic DNA into the homologous recombination vector using gap repair, and (3) how to replace or tag genes of interest within these vectors using a second round of recombineering. Finally, we will also provide a protocol for how to mobilize these cassettes in vivo to generate a knockout, or a tagged gene via knock-in. These methods can easily be adopted for multiple targets in parallel and provide a means for manipulating the Drosophila genome in a timely and efficient manner.

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

Homologous recombination techniques greatly advance Drosophila genetics by enabling the creation of molecularly precise mutations. The recent adoption of recombineering allows one to manipulate large pieces of DNA and transform them into Drosophila6. The methods presented here combine these techniques to rapidly generate large homologous recombination vectors.

Recombineering مثلي التركيبات التوحد في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

تحسين نسبة نجاح تبلور البروتين بواسطة عشوائية Microseed ماتريكس فحص

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4&#039;,6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في ايليجانس كاينورهابديتيس

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

الكشف عن وتوصيف البروتين التجميع الذاتي في الجسم الحي عن طريق قياس التدفق

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

فحص كيميائي محسن للتعرف السريع على الجاذبات الكيميائية الريزوبكتيرية في إفرازات الجذر

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...