فإن الكتاب أود أن أنوه جوليا Hatler ومارتن رامسدن (R &amp; D أنظمة) للمناقشة مفيدة ومراجعة مخطوطة.

1. تحريض EMT <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدافئة سائل الإعلام والثقافة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. وسائل الإعلام والثقافة المستخدمة هي نفس وسائل الإعلام المستخدمة للثقافة القياسية من الخلايا الخاصة بك من الفائدة. على سبيل المثال، يزرع خط خلية سرطان الرئة A549 الإنسان في Kaighn F12 لتستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والجلوتامين 2mm و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الحصاد الاهتمام باستخدام محلول التفكك (على سبيل المثال TrypLE اكسبرس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا في وسائل الإعلام ثقافة قبل حرارة في أنبوب 15 مل المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف بصب في حاوية النفايات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بيليه خلية في وسائل الإعلام ثقافة قبل حرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق. إزالة عينة من تعليق الخلية وتمييع في 0.4٪ حل التريبان الأزرق. وضع 10 ميكرولتر من العينة المخففة على عدادة الكريات وعدد خلايا قابلة للحياة (الخلايا التي لا تتحول الأزرق). استخدام عدد الخلايا لتحديد الخلية دensity في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا لوحة على زراعة الأنسجة المعالجة لوحات أو القوارير في 0.9-1.0 × 10 4 خلايا لكل سم 2. على سبيل المثال، 0.5 × 10 6 خلايا مطلي في لوحة 100 ملم في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على الملحق 1X EMT الإقناع وسائل الاعلام (6 مل لكل 100 ملم وسائل الاعلام لوحة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا مطلي في 37 ° C / 5٪ CO 2 الحاضنة. رصد مورفولوجيا الخلايا اليومية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أيام من الطلاء، وإزالة واستبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة قبل حرارة التي تحتوي على الملحق 1X EMT الإقناع وسائل الإعلام. تواصل الثقافة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خمسة أيام والطلاء، والخلايا جاهزة للتحليل. هو تصور مورفولوجيا الخلايا بواسطة المجهر الضوئي المقلوب. </li></ol> 2. تحليل التعبير البروتين بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العقيمة coverslips 12 ملم ل24 لوحة جيدا قبل وضع coverslips في طبق بتري تحتوي على 95٪ من الإيثانول. بلطف إزالة coverslips من الإيثانول بناجي إبرة وملقط المنحني واللهب تعقيم. وضع ساترة العقيمة في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا. كرر مع coverslips المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية كما هو موضح في القسم 1،1-1،7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1.6 × 10 4 خلايا / جيد في 0.5 مل سائل الإعلام والثقافة قبل حرارة التي تحتوي على الملحق 1X EMT الإقناع وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو وتتغذى الخلايا كما هو موضح في الأقسام 1،9-1،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد خمسة أيام والطلاء، وإزالة وسائل الإعلام وإصلاح الخلايا مع 300 ميكرولتر / جيد من بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي، وشطف الخلايا 2X مع 1X PBS، 500 ميكرولتر / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في 400 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة (1X PBS تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 10٪ مصل حمار عادي، و 0.3٪ تريتون X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في الأجسام المضادة الأولية في مصنعين أوصت التركيز في 400 ميكرولتر / جيد من عرقلة العازلة لمدة 3 ساعة في درجة حرارة الغرفةه أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. عند استخدام الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة إلى تألقي، واحتضان العينات في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات في 500 ميكرولتر / جيد من 1X PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 5 دقائق كل غسل. عند استخدام الأجسام المضادة الأولية مترافق مباشرة إلى تألقي، انتقل مباشرة إلى الخطوة 2.12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الثانوية في أوصت تركيز الشركة المصنعة في 400 ميكرولتر / جيد من 1X PBS تحتوي على 1٪ BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا ثلاث مرات في 500 ميكرولتر / جيد من 1X PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 5 دقائق كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، نوى مع حل دابي ملون مباين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الخلايا في الماء منزوع الأيونات وجبل coverslips وجهه لأسفل على شريحة باستخدام وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. </li></ol>

<ol>
	<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li><li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression.">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li><li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling.">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li><li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways.">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li><li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin/&#946;-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier.">E-cadherin/&#946;-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li><li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast.">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li><li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition.">TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li><li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition.">TGF-&#946;1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li><li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-&#946;+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells:+involvement+of+type+I+receptors.">TGF-&#946; induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li><li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+&#946;1,+&#946;2,+and+&#946;3+during+murine+palate+formation.">Differential expression of genes encoding TGFs &#946;1, &#946;2, and &#946;3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li><li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes.">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li><li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment.">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li><li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states:+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits.">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li><li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+by+transforming+growth+factor-&#946;1+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro.">Induction by transforming growth factor-&#946;1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li><li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells.">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li><li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-&#946;1-induced+EMT+in+vitro.">Activation of the Erk pathway is required for TGF-&#946;1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li><li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription:+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition.">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li><li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells.">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li><li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays.">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li></ol>

أنظمة R &amp; D، هي شركة، والشركة العامة للربح. وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المقالة عن طريق R &amp; D سيستمز

الأساليب السابقة لEMT الحث والتحفيز تستخدم عادة TGF-β أو التعديل الوراثي. على الرغم من TGF-β وحدها وقد تبين للحث على EMT في بعض أنواع الخلايا، وقد تم الآن ثبت أن TGF-β ضروري لEMT، ولكنها ليست كافية في جميع أنواع الخلايا 6،14. باستخدام التعديل الوراثي للEMT الاستقراء هو مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم مزيجا من العوامل من بينها، ومكافحة الإنسان E كادهيرين، sFRP-1 مكافحة الإنسان، ومكافحة الإنسان DKK-1، المؤتلف الإنسان WNT-5A، والمؤتلف الإنسان TGF-β1 للحث موثوق EMT. تم تصميم هذا المزيج من العوامل لمنع التصاق القائم E كادهيرين، خطوة حاسمة للتحريض EMT 4، وتعزيز الإشارات WNT بإضافة البروتين WNT-5A وكذلك باستخدام الأجسام المضادة ومنع لمثبطات WNT، sFRP-1 وDKK -1. وقد ثبت WNT وTGF-β إشارات التصرف في حلقة autocrine للحث والحفاظ على القانون الأساسي الخلية الوسيطةه 6. هذه الطريقة الحث يتجنب التلاعب الجيني وأكثر فعالية من استخدام TGF-β وحدها. الأهم من ذلك، نحن قادرون على مراقبة تحريض EMT في أنواع الخلايا، بما في ذلك MCF7 وPANC-1 الخلايا، التي ثبت سابقا عدم الرد فقط لتحفيز-TGF β (الشكل 5) 14. الخلايا المعالجة مع الملحق المعرض EMT الإقناع وسائل الإعلام التشكل على شكل مغزل أقل إحكاما وزيادة (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك، هناك انخفاض في سطح كادهيرين E التعبير المتزامنة مع زيادة في فبرونيكتين التعبير، والتي هي السمات المميزة لEMT (الشكلين 2 و 3). وupregulated علامات الوسيطة إضافية مثل Vimentin والحلزون أيضا في الخلايا التي يسببها EMT بالمقارنة مع الضوابط uninduced (الشكل 4). زيادة الهجرة والغزو قدرات هي الخصائص الفنية الرئيسية لخلايا اللحمة المتوسطة. في في المختبر </em&gt; الهجرة والغزو المقايسات، الخلايا المعالجة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام أظهرت زيادة كبيرة في القدرة على الهجرة وغزو (الشكل 6). هذه طريقة بسيطة لEMT الاستقراء هو مفيد لدراسة EMT الإشارات كما هو موضح باستخدام بيانات التعبير مجموعة الضد هو مبين في الشكل 7. أنواع مختلفة من الخلايا يمكن مقارنة قبل وبعد EMT-التعريفي للحصول على التوقيعات التعبير الشائعة المرتبطة EMT، مثل الزيادة في CREB فسفرته وERK1 / 2 ينظر في كل من MCF7 والخلايا التي يسببها EMT A549. S133 الفسفرة من CREB يحفز الحمض النووي ملزمة، ولقد ثبت أن يتصرف المصب من TGF-β1 التي يسببها EMT 15. وقد تبين أيضا ERK1 / 2 الفسفرة للعمل المصب TGF-β1 التي يسببها EMT 16. كما يمكن توضيح الاختلافات في مسارات الإشارات بين الخلايا أنواع كما رأينا مع الزيادة في GSK-3β الفسفرة في خلايا A549 مقابل p70S6K الفسفرة في MCF7. الفسفرة GSK-3β في 9 سيرين أنه يقلل وظيفة، ولقد ثبت GSK-3β لمنع عامل النسخ المؤيدة للEMT، الحلزون 17. في المقابل، يدفع p70S6K النشاط الحلزون ويرتبط الفسفرة مع تفعيل هذا البروتين 18. عموما، تحريض واضحة وموثوق بها من EMT، لا سيما في الخلايا هو موضح سابقا عدم الرد فقط لTGF-β، مفيد لفهم بيولوجيا EMT، وتحديد التوقيعات التعبير الشائع لاستخدامها بوصفها علامات النذير، وتطوير وتقييم علاجات جديدة للسرطان والمرض متليفة.

الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) هو العملية التي الخلايا الظهارية الاستقطاب يخضع لمجموعة متنوعة من التغيرات الناتجة في زنزانة الوسيطة متحركة عالية مثل الخلايا الليفية. تحدث هذه العملية، في جزء منه، من خلال التغيرات في التعبير الجيني وتدهور تقاطعات الملتصقة، مما أدى إلى زيادة القدرة على الهجرة وغزو. من الناحية الفسيولوجية، EMT تلعب أدوارا هامة أثناء التطور الجنيني والتئام الجروح. فقدان السيطرة المناسبة على EMT يمكن أن يؤدي إلى تليف وورم خبيث من سرطان 1،2. الحد من E-كادهيرين على سطح الخلايا الظهارية هو خطوة حاسمة في تطور خلية من خلال EMT 3،4. E-كادهيرين هو بروتين الغشاء تمرير واحد التي تتفاعل مباشرة مع البروتينات على الخلايا المجاورة كادهيرين. بالإضافة إلى دورها في التصاق الخلية، E-كادهيرين خلية التأثيرات إشارة عبر التفاعلات بين الذيل حشوية من E-كادهيرين ودا متنوعة من البروتينات التنظيمية، ولا سيما β-catenin. β-catenin يلعب دورا في تحقيق الاستقرار في تقاطعات الملتصقة. خلال إشارات Wnt الكنسي، ويتم تحريرها β-catenin من E-كادهيرين وtranslocated إلى النواة حيث انها بمثابة عامل النسخ المصب في مسار 3،4،5 WNT. في النواة، وقد تبين β-catenin لزيادة النسخ لعدة عوامل ذات الصلة بما في ذلك EMT تويست، سبيكة، فيبرونكتين]، ومجموعة متنوعة من metalloproteases مصفوفة 3،6. بالإضافة إلى WNTS، وقد تبين TGF-β إشارات للعب دورا هاما في EMT الحث على حد سواء خلال التطور الطبيعي في الدول المريضة و7،8،9. وتشارك TGF-β في EMT التي تحدث أثناء تشكيل الحنك وفي قلب النامية 10. كما تم المتورطين في تليف وسرطان في التقدم إلى ورم خبيث 7. الإجراء الموضح هنا العلاقات العامةovides الاستقراء ثابت من EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا دون الحاجة للتلاعب الجيني. يستخدم هذا الإجراء مزيج من E-كادهيرين، sFRP-1، وDKK-1 منع الأجسام المضادة وWNT-5A والبروتينات المؤتلف TGF-β1. تم تصميم هذا الكوكتيل لمنع E-المستندة إلى كادهيرين التصاق مع تعزيز WNT وTGF-β الإشارة. القدرة على الاستقراء EMT قوية هو أمر حاسم لفهم بيولوجيا هذه العملية وكيفية التعامل مع ذلك لأغراض علاجية. علامات الموحد الحالي للEMT، E-كادهيرين (downregulated في EMT) وVimentin (upregulated في EMT)، ويمكن الاطلاع أعرب المشارك في أمراض السرطان وبالتالي لا توفر أفضل علامات التشخيص من الخلايا المتنقل المحتملة 12. الأهم من ذلك أن تحليل مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التي خضعت EMT هو مفيد لتطوير التوقيعات التعبير الجيني الشائعة التي يمكن أن تستخدم لأغراض التشخيص في السرطان والتليف 11. بالإضافة إلى ذلك، وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن EMT قد تلعب دورا في تشكيل الخلايا الجذعية السرطانية، مما يشير إلى أن الخلايا التي خضعت EMT قد تكون مفيدة لفحص المخدرات لتحديد المركبات التي يمكن أن تستهدف هذه الخلايا 13.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Epithelial cells of interest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT Inducing Media Supplement</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CCM017</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&beta;1</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>240-B</td>
			<td>Used at 10ng/ml</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL648R</td>
			<td>Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-E-Cadherin </td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1838</td>
			<td>Used at 0.1 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-Fibronectin</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>MAB1918</td>
			<td>Used at 10 &mu;g/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>AF5718</td>
			<td>Used at 0.2 &mu;g/ml for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>NL009</td>
			<td>Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF109</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>HAF007</td>
			<td>Used at 1:2000 for western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>SC026</td>
			<td>Used according to the manufacturer's instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>96 Well BME Cell Invasion Assay</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>3455-096-K</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>ARY002B</td>
			<td>This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mounting Media</td>
			<td>R &amp; D Systems</td>
			<td>CTS011</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.4% Trypan Blue Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15350-061</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1X Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson Labs</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Roche Molecular Biochemicals</td>
			<td>789-704</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DAPI Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fine pointed curved forceps</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>08-875</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>12 mm coverslips</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>633009</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used at 5% in TBST for blocking in western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting blocking and washing</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PVDF Membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>4-20% SDS-page gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ECL substrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For western blotting</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plates/flasks, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>24-well plates, tissue culture treated</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipettes / pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet Aid / pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>37 &deg;C/5%CO2 Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition

الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) أمر ضروري لالتشكل السليم خلال التنمية. Misregulation من هذه العملية وقد تورط كحدث رئيسي في تليف وسرطان تطور إلى حالة النقيلي. فهم العمليات التي تكمن وراء EMT يتحتم على التشخيص المبكر والسيطرة السريرية لهذه الحالات المرضية. الحث موثوقة من EMT في المختبر هو أداة مفيدة لاكتشاف المخدرات وكذلك لتحديد التوقيعات التعبير الجيني المشترك لأغراض التشخيص. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة واضحة لتحريض EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد أيضا أساليب لتحليل الخلايا ما قبل وما بعد EMT-تحريض من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر مدى فعالية هذه الطريقة من خلال تحليل مجموعة القائم على الأجسام المضادة والمقايسات الهجرة / الغزو.

. وحمل EMT الظروف الثقافة الموصوفة هنا توفر وسيلة قوية للتحريض EMT في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا أرقام 1 و 2 إظهار مورفولوجية ومستويات التعبير علامة لمدة 4 مختلف خطوط الخلايا البشرية: الخلايا ورم أرومي دبقي T98G، HT29 خلايا غدية القولون ، وخلايا سرطان الرئة A549، وMCF10A الخلايا الظهارية الثديية. تغير الخلايا التي تم التعامل معها في الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام من مورفولوجيا الكلاسيكية الظهارية (أرقام 1A - 1D) إلى الوسيطة، المغزل على شكل التشكل (أرقام 1E - 1H). ظهرت الخلايا التي يسببها EMT معبأة أقل كثافة في المستعمرات ضيق مقارنة مع الخلايا uninduced. عينات الواردة Uninduced MCF10A مجموعات معبأة بإحكام وتحيط بها خلايا معبأة أكثر فضفاضة. وكانت هذه المجموعات معبأة بإحكام E-كادهيرين إيجابية (الشكل 2D) واختفى على العلاج مع EMT الإقناع الإعلامي ملحقement (الشكل 2H). تم تقييم EMT أيضا downregulation من علامات الظهارية وupregulation من علامات الوسيطة. وعادة ما لاحظ downregulation من E-كادهيرين التعبير التالي EMT الاستقراء في أنواع مختلفة من الخلايا 3،4 الشكل 2 يوضح التعبير سطح E-كادهيرين في غالبية الخلايا غير المعالجة (أرقام 2A - 2D؛ الحمراء). بالمقارنة مع غيابها بعد الحث EMT (أرقام 2E - 2H، أحمر). خط خلية واحدة، T98G وجد، أن يكون هناك مستوى منخفض للغاية من القاعدية E-كادهيرين قبل EMT الاستقراء، والتي حالت دون تحليله. Upregulation من علامة الوسيطة، فيبرونكتين]، وكان أيضا مرئية بعد الاستقراء مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام (أرقام 2A - 2D مقابل أرقام 2E - 2H؛ الأخضر). مستويات التعبير عن E-كادهيرين وفيبرونكتين] ينظر إليه من قبل كيمياء سيتولوجية مناعيةوأكد كذلك من خلال النشاف الغربي من مجموع لست] الخلية (الشكل 3). أكدت طخة غربية downregulation من E-كادهيرين وupregulation فبرونيكتين التعبير يراها مناعية. تم quantitated العصابات باستخدام كثافة وتطبيع GAPDH لتحديد التغير النسبي أضعاف التالية EMT الاستقراء. تم تخفيض مستويات كادهيرين E 6.4 و 3.4 أضعاف في A549 والخلايا MCF10A، على التوالي. وزادت مستويات فبرونيكتين 4.6، 4.1، و 2.3 أضعاف في T98G، A549، والخلايا MCF10A، على التوالي. على الرغم من أن لطخة غربية لا تظهر انخفاض كبير في مستويات البروتين E-كادهيرين في الخلايا HT29 الحث بعد EMT، والنتائج كيمياء سيتولوجية مناعية يبرهن على وجود انخفاض في التعبير سطح E-كادهيرين (الشكل 2B مقابل 2F)، والذي هو غير قادر على تمييزها في النشاف الغربي من مجموع لست] الخلية. لمزيد من تقييم الوضع EMT، علامة معروفة إضافيةوقد تم تحليل و لEMT قبل وبعد EMT-الاستقراء. يتفق مع النتائج السابقة، تم downregulated E-كادهيرين في جميع خطوط الخلايا فحصها، مشيرا إلى أن EMT كان المستحث. بالإضافة إلى ذلك، علامات الوسيطة، Vimentin والحلزون، وupregulated في A549، T98G، والخلايا MCF10A بعد العلاج مع الملحق EMT الإقناع وسائل الاعلام (الشكل 4). لم خط الخلية HT29 لا تظهر علامات التعبير عن هذه الوسيطة إما مع أو بدون تحريض EMT (لا تظهر البيانات)، والتي قد تشير إلى أن هذه الخلايا تستخدم مسارات بديلة لEMT الاستقراء. على الرغم من TGF-β كافية لإحداث EMT في الخلية بعض سياقات 7،8،9، أنواع الخلايا الأخرى لا تستجيب فقط لإضافة TGF-β 14. MCF7 الثدي البشرية الخلايا السرطانية وPANC-1 خلايا سرطان البنكرياس الإنسان أفادت بعدم الرد على TGF-β يشير حده 14 على حد سواء. لتحديد ما إذا كان أي من الخطين يمكن الخضوع EMT في vitrس، ومثقف الخلايا في وجود الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام. وقد حفز الخلايا مع المؤتلف TGF-β1 وحدها، في تركيز داخل الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام. هذه الخلايا الظهارية الاحتفاظ التشكل، تتكون من مستعمرات الخلايا معبأة بإحكام (لا تظهر البيانات) ومستويات سطح كادهيرين E كانت مشابهة لتلك التي ظهرت في خلايا التحكم (أرقام 5C و 5D مقابل أرقام 5A و 5B). في المقابل، أظهرت الخلايا حفز مع الملحق EMT الإقناع الإعلامي انخفاض حاد في مستويات سطح E-كادهيرين (أرقام 5E و5F). أيضا الحصول على هذه الخلايا أكثر التشكل الوسيطة، حيث أصبحت الخلايا أقل إحكاما وأكثر مثل المغزل (لا تظهر البيانات). تثبت هذه النتائج أن طريقة EMT حمل الموصوفة هنا هو قادرة على تعزيز التشكل EMT والتغيرات التعبير علامة في الخلايا عادة مقاومة للTGF-β-IEMT nduced. بالإضافة إلى التغييرات في علامة التعبير، السمة المميزة أخرى من خلايا اللحمة المتوسطة هي قدرتها على الهجرة وغزو. الهجرة وغزو الخلايا المستزرعة مع أو بدون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام وتحليلها باستخدام 96 خلية جيدا BME الغزو الفحص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، وكانت المصنفة الخلايا على لوحات 96 جيدا (50،000 خلية / أيضا) التي تحتوي على إدراج مرشح مع 8.0 ميكرومتر المسام. بعد 48 ساعة، وجرى تقييم هجرة calcein AM تلطيخ الخلايا التي هاجروا من خلال مرشح. تم اختبار كل عينة في ثلاث نسخ مرتين مع نتائج مماثلة. وتظهر نتائج ممثلة من تجربة واحدة في الشكل 6A. وشوهدت زيادات ذات دلالة إحصائية (P-قيمة &lt;0.003) في الهجرة الخلية مع كل من وA549-1 PANC الخلايا التالية EMT الاستقراء. لتقييم قدرة هذه الخلايا على غزو (أي الهجرة من خلال المصفوفة خارج الخلية)، وكان نفس الاختبارأجريت مع الغشاء القاعدي المغلفة استخراج التصفية. وأظهرت الخلايا التي يسببها EMT يعتد به إحصائيا (P-قيمة &lt;0.001) الزيادة في قدرات الغزو مقارنة مع الخلايا غير المعالجة كما رأينا في الشكل 6B. تحريض قوية من EMT مفيد لتحليل التغيرات في التعبير الجيني والإشارات التي تجري في هذه الخلايا. تحليل مجموعة القائم على الأجسام المضادة باستخدام لست] من خلايا كل من المعالجة وغير المعالجة هو أسلوب واحد لتحليل مستويات التعبير عن مجموعة متنوعة من الجزيئات في عينة واحدة. على سبيل المثال، قمنا بتحليل مستويات فسفرته أفراد الأسرة في MAPK لست] من الامم المتحدة والتي يسببها وEMT التي يسببها MCF7 والخلايا A549 باستخدام صفيف كيت بروتيوم التعريف البشرية الفوسفات-MAPK. تم تشغيل مجموعة من العلاجات مرتين EMT-تحريض مستقلة مع نتائج مماثلة. الشكل 7 يظهر بيانات تمثيلية من مجموعة واحدة. كلا النوعين الخلية أظهرت زيادة الفسفرة من CREB (S133)، ERK1 (T2<html> 02/Y204)، وERK2 (T185/Y187) في الخلايا التي يسببها EMT مقارنة مع الضوابط. وقد لوحظت اختلافات في إشارة الأحداث بين أنواع الخلايا اثنين أيضا. أظهرت خلايا A549 زيادة في GSK-3 β (S9) الفسفرة، في حين أظهرت خلايا MCF7 زيادة p70S6K (T421/S424) الفسفرة. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> الشكل 1. وأشار مورفولوجيا الظهارية في أنواع الخلايا الأربعة التالية الثقافة لمدة 5 أيام في وسائل الإعلام ثقافة القياسية دون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام (E - H) - الوسيطة التشكل الحث بعد التحفيز مع الملحق EMT الإقناع وسائل الاعلام (D A). مورفولوجيا الوسيطة في وأشار أربعة أنواع الخلايا المستزرعة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. الإقليم الشمالي &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="الرقم 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> الشكل 2. Downregulation من الظهارية التعبير علامة وupregulation من التعبير علامة الوسيطة في الخلايا التي يسببها EMT. تم صبغ الخلايا بواسطة المناعي للكشف عن التعبير عن علامة الظهارية، E-كادهيرين (أحمر)، وعلامة الوسيطة، فيبرونكتين] (الخضراء). (A - D) الخلايا تحكم مثقف دون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام (E - H) الخلايا المستزرعة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. وcounterstained جميع الخلايا مع دابي (الأزرق). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="الرقم 3"/> الرقم 3. تأكيد الظهارية والوسيطة التعبير علامة مع الغربية وصمة عار على<html> . alysis طخة غربية من إجمالي لست] خلية من أربعة أنواع الخلايا المشار إليها، وتعامل مع (EMT) أو بدون (-) في الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. العصابات لE-كادهيرين، فيبرونكتين]، والسيطرة GAPDH التحميل هي كما هو مبين على اليسار. علامة حجم كما هو مبين على الحق. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="الرقم 4"/> الشكل 4. Upregulation من علامات الوسيطة، Vimentin والحلزون في الخلايا التي يسببها EMT. تم صبغ الخلايا بواسطة المناعي متعدد الألوان للكشف عن التعبير عن علامة الظهارية، E-كادهيرين (الرمادي)، وعلامات الوسيطة، Vimentin (الخضراء) والحلزون (الأحمر) الخلايا تحكم مثقف دون تكملة EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام - (C A) (D - F) الخلايا المستزرعة مع الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. lways &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="الرقم 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> الرقم 5. تحريض EMT في الخلايا غير مستجيبة للTGF β1. (A و B) خلايا مثقف مع وسائل الاعلام وحدها لمدة 5 أيام. (C و D) الخلايا المستزرعة في وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل من TGF-β1 لمدة 5 أيام. (E وF) الخلايا المستزرعة في الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لمدة 5 أيام. هي ملطخة جميع الخلايا للتعبير E-كادهيرين (أحمر) و counterstained مع دابي (الأزرق). <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="الرقم 6"/> الرقم 6. وزادت الخلايا التي يسببها EMT القدرات الهجرة والغزو. A. متوسط ​​عدد الخلايا التي هاجرت من خلال تصفية المسام 8 ميكرون بعد الحضانة لمدة 48 ساعة. B. متوسط ​​عددالخلايا التي كانت قادرة على غزو من خلال تصفية المسام 8 ميكرون المغلفة مع استخراج الغشاء القاعدي بعد الحضانة لمدة 48 ساعة. أشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري أكثر من 3 آبار. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="الرقم 7"/> استنادا الأجسام المضادة الرقم 7. مجموعة تحليل التعبير عن EMT الاستقراء. واستخدمت لست] من A549 (A و C) وMCF7 (B و D) الخلايا المستزرعة مع أو بدون الملحق EMT الإقناع وسائل الإعلام لتحليل مجموعة باستخدام صفيف كيت بروتيوم التعريف البشرية الفوسفات-MAPK. أبرز النقاط في ألف وباء ثم تم quantitated باستخدام كثافة. وتظهر مقارنات من الامم المتحدة والتي يسببها لست] يسببها EMT لفي المقابلة الرسوم البيانية أدناه (C و D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لعرض أكبر شخصية &lt;</a>/ أ&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition at JoVE.com

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

يوصف طريقة واضحة لتحريض الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد وسائل لتحليل الخلايا في الدول EMT بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

induction-and-analysis-of-epithelial-to-mesenchymal-transition

Google

Research

JoVE Journal

Biology

35.5K Views.  R&D Systems, Inc..  يوصف طريقة واضحة لتحريض الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا. وترد وسائل لتحليل الخلايا في الدول EMT بواسطة كيمياء سيتولوجية مناعية. 

Video: Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

الضوء / الظلام لاختبار الانتقال الفئران

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

الكشف عن البديل خلال الربط طلائي-الوسيطة الانتقالية

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

الطريقة Cryosectioning لتسليخ مجهري الفئران القولون الغشاء المخاطي

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

مغناطيسية تنشيط الخلية فرز الاستراتيجيات الرامية إلى عزل وتنقية الزليلي المستمدة من سائل الخلايا الجذعية الوسيطة من طراز الأرنب

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...