يود المؤلفون أن نعترف التمويل المقدم من برنامج UCSF تخصيص الموارد.

تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان تحت يتفق تماما مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. 1. الفأر الجنينية الغدد الدمعية (LG): حصاد وتسليخ مجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفقا للإجراءات المعتمدة من الحيوانات المؤسسية لجنة أخلاقيات البحث العلمي، والموت ببطء توقيت الحوامل CD-1 (أو المعدلة وراثيا) من الإناث مع ارتفاع CO 2 الاستنشاق، تليها تأكيد خلع عنق الرحم للأجنة الحصاد في اليوم الجنينية المناسب. تعيين يوم المهبلي اكتشاف المكونات E0. ملاحظة: الغدد الدمعية (خطابات الضمان) يمكن حصادها من برعم واحد E14 المرحلة فصاعدا. ومع ذلك، E16 (من 5 - 10 براعم) الأجنة تعطي نتائج أكثر اتساقا للثقافة فيفو السابقين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الخامسالجانب entral من الفأرة باستخدام الايثانول 70٪. قرصة الجلد وإجراء شق في خط الوسط مع مقص جراحي معقم. قطع طريق الجلد أو الغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن. إزالة قرون الرحم 2 عن طريق قطع على طول مسراق الرحم على رأس كل قرن الرحم ومكان في برنامج تلفزيوني الباردة (الفوسفات مخزنة المالحة) أو DMEM سائل الاعلام F12 تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط (رقم 5)، وإزالة الأجنة من الحويصلات الأمنيوسي ووضع في طبق بتري معقمة الثانية تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة. يجب الحرص على عدم لمس العينين أو منطقة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين على مجهر تشريح مع قاعدة تضوء. إذا كان الجنين هو &lt;E17، نفذ الخطوات 1،5-1،7. إذا الأجنة&gt; E17، قد تكون هذه الخطوات مفيدة ولكنها ليست ضرورية، لذلك انتقل إلى الخطوة 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الرأس عن الجذع أسفل الفك السفلي (الخطوة 1، الشكل 2) النقيبالجا مشرط معقم (# 10 شفرة). تدوير الرأس بحيث يكون الفك السفلي هو الآن على لوحة تشريح. استخدام ملقط لتحقيق الاستقرار في الرأس ومشرط لإزالة حوالي ¼ من الجانب الظهري من المخ (الخطوة 2، 1 قطع شارع، الشكل 2) - وهذا أمر مهم خاصة عندما يصلب الغضروف حول E15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه رأسه بحيث يمكن أن تخترق مشرط الأنف بين العينين. اجراء خفض خلال وسط الرأس، بحيث العيون الآن على نصفين منفصلين (الخطوة 2، 2 قطع الثانية، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين # 5 ملقط، تأخذ نصف واحد من الرأس وإزالة الأنسجة الزائدة (راجع الخطوة 3، الشكل 2). تأكد من توجيه رئيس حتى لا يتم فقدان LG (الموجود في الركن الخلفي السفلي للعين) في هذه العملية إزالة. إزالة الشلل الزائد والغضاريف، والأنسجة الأنفية المحيطة بها، وتحت العين. منذ الغدة هي بالكاد مرئية في هذه المرحلة، وضمان العين وموجهة بشكل صحيح بعد إزالة الأنسجة الزائدة رس تجنب فقدان موقع LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتزاع بعناية البشرة من الخلفية، الزاوية السفلى من العين مع ملقط على حد سواء. إزالة الجلد عن طريق سحب بعناية مفتوحة مع ملقط لفضح LG. استخدام إضاءة إضافية فوق وتحت الأنسجة لمساعدة تصور LG. ملاحظة: LG، يمكن تمييزها من خلال مظهره كما برعم على القناة ضمن أكثر قتامة، اللحمة المتوسطة المختصرة، يجب أن تكون واضحة في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ بعناية لتشريح LG واللحمة المتوسطة المرتبطة بها (الرجوع إلى الرسم التخطيطي والصور) بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها باستخدام ملقط، والحرص على عدم انتزاع LG أو القناة المرتبط به. مرة واحدة الغدة خالية من الأنسجة المحيطة بها، وإزالة بلطف الغدة بأكملها تجتاح ظهائر المحيطة بالعين في قاعدة القناة LG. الحرص على الحفاظ على اللحمة المتوسطة المحيطة ظهارة، والتي يمكن ملاحظتها بأنه اللحمة المتوسطة المختصرة التي invaginates في ظهارة. ملاحظة: بعض إزالة إضافية من TISSUه (أي شظايا العظام الصغيرة والعضلات والنسيج الضام) قد يكون ضروريا لتجنب الإشارات العوامل / النمو من الأنسجة المجاورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للثقافة والحصاد 5 - 4 الغدد وما يرتبط بها من اللحمة المتوسطة في لوحة (ومطلي خطابات الضمان فور تشريح)؛ جمع ما لا يقل عن 14 الغدد في 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي العازلة تحلل لRT-PCR 6. </li></ol> 2. إعداد لوحات للفيفو السابقين الثقافة ويستند هذا الإجراء على أن يعمل للغدة اللعابية تطوير 7،8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من DMEM F12 (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) سائل الإعلام والثقافة مع 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك و 50 ميكروغرام / مل هولو-ترانسفيرين إلى 50 مم طبق قطره microwell ذات القاع الزجاجي 7. ملاحظة: تم اختيار DMEM F12 كما كنا في السابق وجدت أنه لتعظيم التشكل في الغدة اللعابية الجنينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطفو على 13 ملم البومرشح غشاء onate مع 0.1 ميكرون المسام على رأس وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة اختيارية: تمييع 3-D laminin 1: 1 مع DMEM / F12 لجعل تركيز النهائي من 3 ملغ / مل (استخدم 200 ميكرولتر ماصة لخلط بلطف، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة إذا ظهرت فقاعات). إضافة 15 ميكرولتر من هذا المخفف 3-D laminin لتصفية. ملاحظة: تم العثور على هذا التخفيف ليكون الأمثل للحفاظ على LG 3D في الدولة دون المساس المتفرعة الظهارية. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري لثقافة LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 5 - 4 LG على مرشح أو في laminin. ثقافة خطابات الضمان فيفو السابقين ل24 - 48 ساعة (الشكل 3) أو إصلاح مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة لمزيد من التحليل قبل QPCR أو المناعية (الشكل 4). لتحليل QPCR من الأنسجة الغدية الجنينية، يرجى الرجوع إلى Rebustini وآخرون، 2011. لتحليل مناعي من الأنسجة الجنينية غدي يرجى الرجوع إلى الاستشهادات التالية: هوفمان وآخرون، (2002)، وشتاينبرغ ه.ر آل.، (2005). </li></ol> 3. الفأرة بعد الولادة والغدد الدمعية الكبار (LG): تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس ما بعد الولادة وفقا للمعايير المناسبة جنة أخلاقيات الحيوان. لالجراء بعد الولادة يوم 8 أو أقل، الموت ببطء بقطع الرأس مع مقص العقيمة. ليوم ما بعد الولادة 8 أو السن، رش الفراء مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد موقع LG، وضع الماوس الوحشي الجانب حتى تشريح تحت المجهر مع إضاءة من فوق. ملاحظة: يتم يحد LG ما بعد الولادة وتعليم الكبار من خلال الشريان السباتي، والعضلات الماضغة والأدمة (انظر الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص تشريح الصغيرة، وجعل شق صغير في البشرة أفقيا من حيث يجب أن يكون موجودا في LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، وسحب تفتح البشرة تجاه الأذن لفضح LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لتخفيف بلطف LG من الأنسجة المحيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحرير LG من الأنسجة المحيطة، وإزالة بعناية LG من قبل القناة،بواسطة تجتاح حيث القناة وظهائر المحيطة بالعين الاتصال (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطابات الضمان في وضع RNA العازلة تحلل لRT-PCR، أو إصلاح مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة للالمناعية. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

براعة للثقافة والتلاعب LG فيفو السابقين يوفر مزايا هامة لدراسة تطورها. وهذا يشمل السرعة التي يستطيع الباحث لاختبار الفرضيات والعديد من الاضطرابات التي يمكن القيام بها لتقييم مدى الظهارية، الخلايا العصبية، والخلايا البطانية mesencyhmal تتفاعل لتشكيل الجهاز. ومع ذلك?...

الغدة الدمعية (LG) هي المسؤولة عن إفراز المسيل للدموع المائي الحرج لحدة البصر والصحة، والصيانة، وحماية خلايا سطح العين. النتائج LG الخلل في واحدة من اضطرابات العين الشائعة والمنهكة: مرض العين الجافة تعاني من نقص مائي، التي تتميز تهيج العين، والحساسية الخفيفة، وانخفضت الرؤية 1. في الإنسان يقيم LG في المدار فوق نهاية الجانبية للعين حيث 5 - 3 مطرح الدموع القنوات ديعة على سطح العين. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن (exorbital) بالدموع السفر إلى العين عبر القناة المفرغة واحد. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق للم شبكة مترابطة معقدة من عنيبات ​​إفرازية والقنوات (الشكل 1) 2. خلال تطوير يصبح ظهارة أوعية دموية، وكذلك بشدة معصب من قبل الأعصاب الحركية للعقدة الجناحية وإلى حد أقل من قبل الأعصاب متعاطفة من العقدة الرقبية العلوية 3. التفاعل بين كل هذه الخلايا، أي أنواع الخلايا العصبية، الظهارية، البطانية والوسيطة، ضرورية لوظيفة وصيانة الأنسجة الكبار. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة تنسيق LG التنمية والتجدد وكذلك كيف يرشد نوع الاتصال بين الخلايا هذه العمليات لا تزال غير واضحة. وقد سمح ظهور الجنينية الثقافة فيفو السابقين تقنيات تحديد مسارات النمو والتجدد في العديد من الأجهزة المتفرعة 4. زراعة فيفو السابقين يعطي للباحث القدرة على التعامل مع الجهاز (ليالميكانيكي أو وراثية أو كيميائية) في ظل ظروف محددة بالإضافة إلى تميز الجهاز وتطوير خلية خلية التفاعل في الوقت الحقيقي. إل جي exorbital من الفأرة هي قابلة للغاية لهذه التقنية وحددت الدراسات التي أجريت مؤخرا الأنظمة التي تنظم تطوره 2،5 الإشارة. ومع ذلك، على الرغم من الحاجة إلى فهم الاشارات الجزيئية التي تقوم عليها LG التطوير والتجديد، وأنه لا يزال حاليا دراسة سلوكه، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزل الجهاز. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية عزل وتنفيذ فيفو السابقين الثقافة من الفئران الجنينية LG لتحديد البرامج التنموية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Name</td>
			<td style="width:129px;">Catalog #.</td>
			<td style="width:213px;">Company</td>
			<td style="width:997px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12 without HEPES</td>
			<td>SH3027101</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>P0781</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin solution from bovine serum</td>
			<td>A9576</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde 16% Solution</td>
			<td>15710</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>Diluted to 4% in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from 10X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">holo-Transferrin bovine</td>
			<td>T1283</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">L- Ascorbic acid (Vitamin C)</td>
			<td>A4544</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>130182</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereo Microscope with substage iluminator</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td rowspan="2">Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td>
			<td>TLB 4000</td>
			<td>Diagnostics Instruments, Inc.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes</td>
			<td>353001</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mm uncoated glass bottom dishes</td>
			<td>P50G-1.5-14-F</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Widefield fluorescence microscope</td>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td style="width:213px;">Carl Zeiss</td>
			<td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached 
			digital camera.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td style="width:213px;">Leica Microsystems</td>
			<td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm)</td>
			<td>17-305X</td>
			<td>Integra LifeSciences Corporation</td>
			<td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm)</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td>
			<td>Ideal for harvesting glands from embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td>
			<td>4-30</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td>
			<td>4-310</td>
			<td colspan="2">Integra LifeSciences Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td>
			<td>AM1931</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td>
			<td>3446-005-01</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:428px;">Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td>
			<td></td>
			<td style="width:213px;">Charles River Labs</td>
			<td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm</td>
			<td>110405</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice</td>
			<td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

manipulating the murine lacrimal gland

الغدة الدمعية (LG) تفرز الدموع المائية اللازمة للحفاظ على بنية ووظيفة القرنية، وهي النسيج الشفاف الأساسية للرؤية. في الإنسان يقيم في LG واحدة في المدار فوق نهاية الجانبية من كل عين تقديم الدموع على سطح العين خلال 5 - 3 قنوات. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية exorbital (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق لتشكيل شبكة مترابطة معقدة من عنيبات ​​إفرازية والقنوات. وقد تم توثيق هذه العملية معقدة بشكل جيد في العديد من أجهزة الظهارية أخرى مثل البنكرياس والغدة اللعابية. ومع ذلك، فقد كانت LG أقل تكتشف الكثير وآليات السيطرة على التشكل وضعيفة تحتوقفت. نعتقد أن هذا التمثيل الناقص كنظام النموذج هو نتيجة للصعوبات المرتبطة الحقائق، تشريح وزراعة وLG. وبالتالي، هنا وصفنا التقنيات لتشريح الجنينية الحصاد وبعدها LG وطرق فيفو السابقين الثقافة من الأنسجة.

<html> إل جي تطور من خلال عملية الظهارية التشكل المتفرعة. صور Brightfield من خطابات الضمان الجنينية تشريح في E14، E15، E16، E17، وP2 توضح هذا الحدث. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. ...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

الغدة الدمعية (LG) هي جهاز المتفرعة التي تنتج مكونات المائية للدموع اللازمة للحفاظ على صحة العين والرؤية. نحن هنا وصف الفئران LG تشريح والثقافة فيفو السابقين تقنيات فك مسارات الإشارات المشاركة في LG التنمية.

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  University of California San Francisco.  الغدة الدمعية (LG) هي جهاز المتفرعة التي تنتج مكونات المائية للدموع اللازمة للحفاظ على صحة العين والرؤية. نحن هنا وصف الفئران LG تشريح والثقافة فيفو السابقين تقنيات فك مسارات الإشارات المشاركة في LG التنمية. 

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Silicon Microchips for Manipulating Cell-cell Interaction

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from development to malignant transformation.&nbsp; In particular, interaction with neighboring stroma has been implicated in a plethora of biological phenomena; however, conventional techniques limit the ability to interrogate the spatial and dynamic elements of such interactions.
In Micromechanical Reconfigurable Culture (RC), we employ a micromachined silicon substrate with moving parts to dynamically control cell-cell interactions through mechanical repositioning. Previously, this method has been applied to investigate intercellular communication in co-cultures of hepatocytes and non-parenchymal cells, demonstrating time-dependent interactions and a limited range for soluble signaling 1.
Here, we describe in detail the preparation and use of the RC system. We begin by demonstrating the handling of the device parts using tweezers, including actuating between the gap and contact configurations (cell populations separated by a narrow 80-&micro;m gap, or in direct intimate contact). Next, we detail the process of preparing the substrates for culture, and the multi-step cell seeding process required for obtaining confluent cell monolayers. Using live microscopy, we then illustrate real-time manipulation of cells between the different possible experimental configurations. Finally, we demonstrate the steps required in order to regenerate the device surface for reuse: toluene and piranha cleaning, polystyrene coating, and oxygen plasma treatment.

This article describes an experimental approach for dynamic regulation of cell-cell interactions between adherent cells on a micrometer scale. Manipulation of intercellular communication between hepatocytes and stromal cell is demonstrated. The developed platform enables investigation of cell-cell interactions in a variety of biological processes, including development and pathogenesis.

السيليكون لمعالجة الرقائق خلية خلية التفاعل

The role of the cellular microenvironment is recognized as crucial in determining cell fate and function in virtually all mammalian tissues from ...

Using Laser Tweezers For Manipulating Isolated Neurons In Vitro

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult retinal neurons in vitro. Procedures for preparing retinal cell cultures start with the dissection, digestion and trituration of the retina, and end with the plating of isolated retinal cells on dishes made especially for use with laser tweezers. These dishes are divided into a cell adhesive half and a cell repellant half. The cell adhesive side is coated with a layer of Sal-1 antibodies, which provide a substrate upon which our cells grow. Other adhesive substrates could be used for other cell types. The cell repellant side is coated with a thin layer of poly-HEMA. The cells plated on the poly-HEMA side of the dish are trapped with the laser tweezers, transported and then placed adjacent to a cell on the Sal-1 side to create a pair. Formation of cell groups of any size should be possible with this technique. "Laser-tweezers-controlled micromanipulation" means that the investigator can choose which cells to move, and the desired distance between the cells can be standardized. Because the laser beam goes through transparent surfaces of the culture dish, cell selection and placement are done in an enclosed, sterile environment. Cells can be monitored by video time-lapse and used with any cell biological technique required. This technique may help investigations of cell-cell interactions.

This video describes the manipulation of cultured neurons using laser tweezers in vitro.

باستخدام الملقط ليزر لمعالجة الخلايا العصبية معزولة في المختبر

In this paper and video, we describe the protocols used in our laboratory to study the targeting preferences of regenerating cell processes of adult ...

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

فأري إجراء زراعة الكلى

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

تقييم التنمية وظيفة الغدة الثديية في نماذج الماوس

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

حقن ينترادوكتال لتسليم المخدرات المترجمة إلى ماوس الغدة الثديية

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

المناعي غير المباشر على أقسام المجمدة من الماوس الغدة الثديية

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.