Name: manipulating the murine lacrimal gland
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

يود المؤلفون أن نعترف التمويل المقدم من برنامج UCSF تخصيص الموارد.

تم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان تحت يتفق تماما مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو. 1. الفأر الجنينية الغدد الدمعية (LG): حصاد وتسليخ مجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفقا للإجراءات المعتمدة من الحيوانات المؤسسية لجنة أخلاقيات البحث العلمي، والموت ببطء توقيت الحوامل CD-1 (أو المعدلة وراثيا) من الإناث مع ارتفاع CO 2 الاستنشاق، تليها تأكيد خلع عنق الرحم للأجنة الحصاد في اليوم الجنينية المناسب. تعيين يوم المهبلي اكتشاف المكونات E0. ملاحظة: الغدد الدمعية (خطابات الضمان) يمكن حصادها من برعم واحد E14 المرحلة فصاعدا. ومع ذلك، E16 (من 5 - 10 براعم) الأجنة تعطي نتائج أكثر اتساقا للثقافة فيفو السابقين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الخامسالجانب entral من الفأرة باستخدام الايثانول 70٪. قرصة الجلد وإجراء شق في خط الوسط مع مقص جراحي معقم. قطع طريق الجلد أو الغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن. إزالة قرون الرحم 2 عن طريق قطع على طول مسراق الرحم على رأس كل قرن الرحم ومكان في برنامج تلفزيوني الباردة (الفوسفات مخزنة المالحة) أو DMEM سائل الاعلام F12 تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط (رقم 5)، وإزالة الأجنة من الحويصلات الأمنيوسي ووضع في طبق بتري معقمة الثانية تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة. يجب الحرص على عدم لمس العينين أو منطقة الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجنين على مجهر تشريح مع قاعدة تضوء. إذا كان الجنين هو &lt;E17، نفذ الخطوات 1،5-1،7. إذا الأجنة&gt; E17، قد تكون هذه الخطوات مفيدة ولكنها ليست ضرورية، لذلك انتقل إلى الخطوة 1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الرأس عن الجذع أسفل الفك السفلي (الخطوة 1، الشكل 2) النقيبالجا مشرط معقم (# 10 شفرة). تدوير الرأس بحيث يكون الفك السفلي هو الآن على لوحة تشريح. استخدام ملقط لتحقيق الاستقرار في الرأس ومشرط لإزالة حوالي ¼ من الجانب الظهري من المخ (الخطوة 2، 1 قطع شارع، الشكل 2) - وهذا أمر مهم خاصة عندما يصلب الغضروف حول E15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه رأسه بحيث يمكن أن تخترق مشرط الأنف بين العينين. اجراء خفض خلال وسط الرأس، بحيث العيون الآن على نصفين منفصلين (الخطوة 2، 2 قطع الثانية، الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين # 5 ملقط، تأخذ نصف واحد من الرأس وإزالة الأنسجة الزائدة (راجع الخطوة 3، الشكل 2). تأكد من توجيه رئيس حتى لا يتم فقدان LG (الموجود في الركن الخلفي السفلي للعين) في هذه العملية إزالة. إزالة الشلل الزائد والغضاريف، والأنسجة الأنفية المحيطة بها، وتحت العين. منذ الغدة هي بالكاد مرئية في هذه المرحلة، وضمان العين وموجهة بشكل صحيح بعد إزالة الأنسجة الزائدة رس تجنب فقدان موقع LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتزاع بعناية البشرة من الخلفية، الزاوية السفلى من العين مع ملقط على حد سواء. إزالة الجلد عن طريق سحب بعناية مفتوحة مع ملقط لفضح LG. استخدام إضاءة إضافية فوق وتحت الأنسجة لمساعدة تصور LG. ملاحظة: LG، يمكن تمييزها من خلال مظهره كما برعم على القناة ضمن أكثر قتامة، اللحمة المتوسطة المختصرة، يجب أن تكون واضحة في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ بعناية لتشريح LG واللحمة المتوسطة المرتبطة بها (الرجوع إلى الرسم التخطيطي والصور) بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها باستخدام ملقط، والحرص على عدم انتزاع LG أو القناة المرتبط به. مرة واحدة الغدة خالية من الأنسجة المحيطة بها، وإزالة بلطف الغدة بأكملها تجتاح ظهائر المحيطة بالعين في قاعدة القناة LG. الحرص على الحفاظ على اللحمة المتوسطة المحيطة ظهارة، والتي يمكن ملاحظتها بأنه اللحمة المتوسطة المختصرة التي invaginates في ظهارة. ملاحظة: بعض إزالة إضافية من TISSUه (أي شظايا العظام الصغيرة والعضلات والنسيج الضام) قد يكون ضروريا لتجنب الإشارات العوامل / النمو من الأنسجة المجاورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للثقافة والحصاد 5 - 4 الغدد وما يرتبط بها من اللحمة المتوسطة في لوحة (ومطلي خطابات الضمان فور تشريح)؛ جمع ما لا يقل عن 14 الغدد في 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي العازلة تحلل لRT-PCR 6. </li></ol> 2. إعداد لوحات للفيفو السابقين الثقافة ويستند هذا الإجراء على أن يعمل للغدة اللعابية تطوير 7،8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من DMEM F12 (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / الستربتومايسين مل) سائل الإعلام والثقافة مع 50 ميكروغرام / مل حمض الاسكوربيك و 50 ميكروغرام / مل هولو-ترانسفيرين إلى 50 مم طبق قطره microwell ذات القاع الزجاجي 7. ملاحظة: تم اختيار DMEM F12 كما كنا في السابق وجدت أنه لتعظيم التشكل في الغدة اللعابية الجنينية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطفو على 13 ملم البومرشح غشاء onate مع 0.1 ميكرون المسام على رأس وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة اختيارية: تمييع 3-D laminin 1: 1 مع DMEM / F12 لجعل تركيز النهائي من 3 ملغ / مل (استخدم 200 ميكرولتر ماصة لخلط بلطف، الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة إذا ظهرت فقاعات). إضافة 15 ميكرولتر من هذا المخفف 3-D laminin لتصفية. ملاحظة: تم العثور على هذا التخفيف ليكون الأمثل للحفاظ على LG 3D في الدولة دون المساس المتفرعة الظهارية. ومع ذلك، فإنه ليس من الضروري لثقافة LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 5 - 4 LG على مرشح أو في laminin. ثقافة خطابات الضمان فيفو السابقين ل24 - 48 ساعة (الشكل 3) أو إصلاح مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة لمزيد من التحليل قبل QPCR أو المناعية (الشكل 4). لتحليل QPCR من الأنسجة الغدية الجنينية، يرجى الرجوع إلى Rebustini وآخرون، 2011. لتحليل مناعي من الأنسجة الجنينية غدي يرجى الرجوع إلى الاستشهادات التالية: هوفمان وآخرون، (2002)، وشتاينبرغ ه.ر آل.، (2005). </li></ol> 3. الفأرة بعد الولادة والغدد الدمعية الكبار (LG): تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس ما بعد الولادة وفقا للمعايير المناسبة جنة أخلاقيات الحيوان. لالجراء بعد الولادة يوم 8 أو أقل، الموت ببطء بقطع الرأس مع مقص العقيمة. ليوم ما بعد الولادة 8 أو السن، رش الفراء مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد موقع LG، وضع الماوس الوحشي الجانب حتى تشريح تحت المجهر مع إضاءة من فوق. ملاحظة: يتم يحد LG ما بعد الولادة وتعليم الكبار من خلال الشريان السباتي، والعضلات الماضغة والأدمة (انظر الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص تشريح الصغيرة، وجعل شق صغير في البشرة أفقيا من حيث يجب أن يكون موجودا في LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، وسحب تفتح البشرة تجاه الأذن لفضح LG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لتخفيف بلطف LG من الأنسجة المحيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تحرير LG من الأنسجة المحيطة، وإزالة بعناية LG من قبل القناة،بواسطة تجتاح حيث القناة وظهائر المحيطة بالعين الاتصال (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطابات الضمان في وضع RNA العازلة تحلل لRT-PCR، أو إصلاح مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة للالمناعية. </li></ol>

<ol>
	<li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca.">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403 (2014).</li><li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development.">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, 2563-2572 (2000).</li><li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes:+relevance+in+dry+eye+diseases.">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li><li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs.">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li><li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development.">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, 2730-2739 (2012).</li><li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis.">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li><li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development:+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms.">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li><li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis.">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, 1223-1234 (2005).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. 329, 1645-1647 (2010).</li><li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+vessels+restrain+pancreas+branching,+differentiation+and+growth.">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li><li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF10/FGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis.">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11 (2005).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li><li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration.">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

براعة للثقافة والتلاعب LG فيفو السابقين يوفر مزايا هامة لدراسة تطورها. وهذا يشمل السرعة التي يستطيع الباحث لاختبار الفرضيات والعديد من الاضطرابات التي يمكن القيام بها لتقييم مدى الظهارية، الخلايا العصبية، والخلايا البطانية mesencyhmal تتفاعل لتشكيل الجهاز. ومع ذلك?...

الغدة الدمعية (LG) هي المسؤولة عن إفراز المسيل للدموع المائي الحرج لحدة البصر والصحة، والصيانة، وحماية خلايا سطح العين. النتائج LG الخلل في واحدة من اضطرابات العين الشائعة والمنهكة: مرض العين الجافة تعاني من نقص مائي، التي تتميز تهيج العين، والحساسية الخفيفة، وانخفضت الرؤية 1. في الإنسان يقيم LG في المدار فوق نهاية الجانبية للعين حيث 5 - 3 مطرح الدموع القنوات ديعة على سطح العين. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن (exorbital) بالدموع السفر إلى العين عبر القناة المفرغة واحد. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق للم شبكة مترابطة معقدة من عنيبات ​​إفرازية والقنوات (الشكل 1) 2. خلال تطوير يصبح ظهارة أوعية دموية، وكذلك بشدة معصب من قبل الأعصاب الحركية للعقدة الجناحية وإلى حد أقل من قبل الأعصاب متعاطفة من العقدة الرقبية العلوية 3. التفاعل بين كل هذه الخلايا، أي أنواع الخلايا العصبية، الظهارية، البطانية والوسيطة، ضرورية لوظيفة وصيانة الأنسجة الكبار. ومع ذلك، فإن الآليات الجزيئية الكامنة تنسيق LG التنمية والتجدد وكذلك كيف يرشد نوع الاتصال بين الخلايا هذه العمليات لا تزال غير واضحة. وقد سمح ظهور الجنينية الثقافة فيفو السابقين تقنيات تحديد مسارات النمو والتجدد في العديد من الأجهزة المتفرعة 4. زراعة فيفو السابقين يعطي للباحث القدرة على التعامل مع الجهاز (ليالميكانيكي أو وراثية أو كيميائية) في ظل ظروف محددة بالإضافة إلى تميز الجهاز وتطوير خلية خلية التفاعل في الوقت الحقيقي. إل جي exorbital من الفأرة هي قابلة للغاية لهذه التقنية وحددت الدراسات التي أجريت مؤخرا الأنظمة التي تنظم تطوره 2،5 الإشارة. ومع ذلك، على الرغم من الحاجة إلى فهم الاشارات الجزيئية التي تقوم عليها LG التطوير والتجديد، وأنه لا يزال حاليا دراسة سلوكه، على الأرجح بسبب الصعوبات التقنية في عزل الجهاز. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية عزل وتنفيذ فيفو السابقين الثقافة من الفئران الجنينية LG لتحديد البرامج التنموية.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 without HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>P0781</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Albumin solution from bovine serum</td><td>A9576</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% Solution</td><td>15710</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Diluted to 4% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Prepared from 10x stock</td></tr><tr><td>holo-Transferrin bovine</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>L-ascorbic acid (Vitamin C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&amp;nbsp;mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50&amp;nbsp;&amp;mu;g/ml.</td></tr><tr><td>BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>130182</td><td>Thermo Scientific</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>Stereo Microscope with substage iluminator</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.</td></tr><tr><td>Substage Illuminator Base for Stereo Microscope</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&amp;nbsp;mm Tissue Culture Treated Dishes</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Non-tissue culture-treated plates can also be used.</td></tr><tr><td>50 mm uncoated glass bottom dishes</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Widefield fluorescence microscope</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.</td></tr><tr><td>SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2&amp;nbsp;cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.</td></tr><tr><td>Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11&amp;nbsp;cm)</td><td>91150-20</td><td>Fine Science Tools (USA), Inc.</td><td>Ideal for harvesting glands from embryos.</td></tr><tr><td>Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10</td><td>4-310</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit</td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12</td></tr><tr><td>Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice</td><td></td><td>Charles River Labs</td><td>Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0).</td></tr><tr><td>Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1&amp;nbsp;&amp;mu;m pore size, 13&amp;nbsp;mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Optional mice for learning how to locate the LG.</td></tr></tbody></table>

manipulating the murine lacrimal gland

الغدة الدمعية (LG) تفرز الدموع المائية اللازمة للحفاظ على بنية ووظيفة القرنية، وهي النسيج الشفاف الأساسية للرؤية. في الإنسان يقيم في LG واحدة في المدار فوق نهاية الجانبية من كل عين تقديم الدموع على سطح العين خلال 5 - 3 قنوات. الماوس لديه ثلاثة أزواج من الغدد العين الرئيسية، والأكثر درس منها الغدة الدمعية exorbital (LG) الواقعة الأمامي وبطني إلى الأذن. على غرار أجهزة غدي أخرى، فإن إل جي تطور من خلال عملية التشكل المتفرعة الظهارية التي برعم الظهارية واحد داخل اللحمة المتوسطة المختصرة يخضع جولات متعددة من برعم وتشكيل لاصق لتشكيل شبكة مترابطة معقدة من عنيبات ​​إفرازية والقنوات. وقد تم توثيق هذه العملية معقدة بشكل جيد في العديد من أجهزة الظهارية أخرى مثل البنكرياس والغدة اللعابية. ومع ذلك، فقد كانت LG أقل تكتشف الكثير وآليات السيطرة على التشكل وضعيفة تحتوقفت. نعتقد أن هذا التمثيل الناقص كنظام النموذج هو نتيجة للصعوبات المرتبطة الحقائق، تشريح وزراعة وLG. وبالتالي، هنا وصفنا التقنيات لتشريح الجنينية الحصاد وبعدها LG وطرق فيفو السابقين الثقافة من الأنسجة.

<html> إل جي تطور من خلال عملية الظهارية التشكل المتفرعة. صور Brightfield من خطابات الضمان الجنينية تشريح في E14، E15، E16، E17، وP2 توضح هذا الحدث. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. ...

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating the Murine Lacrimal Gland at JoVE.com

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

الغدة الدمعية (LG) هي جهاز المتفرعة التي تنتج مكونات المائية للدموع اللازمة للحفاظ على صحة العين والرؤية. نحن هنا وصف الفئران LG تشريح والثقافة فيفو السابقين تقنيات فك مسارات الإشارات المشاركة في LG التنمية.

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K Views.  University of California San Francisco.  الغدة الدمعية (LG) هي جهاز المتفرعة التي تنتج مكونات المائية للدموع اللازمة للحفاظ على صحة العين والرؤية. نحن هنا وصف الفئران LG تشريح والثقافة فيفو السابقين تقنيات فك مسارات الإشارات المشاركة في LG التنمية. 

Video: Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for quality of life and health care costs. The lack of informative animal models that recapitulate its key features impedes the search for new therapeutic agents for DED. Available DED animal models have limited reproducibility and efficacy. A model is presented here in which DED is induced by injecting the mitogen concanavalin A (Con A) into the orbital lacrimal glands of rabbits. Innovative aspects of this model are the use of ultrasound (US) guidance to ensure optimal and reproducible injection of Con A into the inferior lacrimal gland; injection of Con A into all orbital lacrimal glands that limits compensatory production of tears; and use of periodic repeat injections of Con A that prolong the state of DED at will. DED and its response to test agents are monitored with a panel of parameters that assess tear production, the stability of the tear film, and the status of the corneal and conjunctival mucosa. They include tear osmolarity, tear break-up time, Schirmer&#39;s tear test, rose bengal staining, and tear lactoferrin levels. The induction of DED and the monitoring of its parameters are described in detail. This model is simple, robust, reproducible, and informative. This animal model is suitable for the study of tear physiology and of the pathophysiology of DED as well as for the assessment of the efficacy and safety of candidate agents for the treatment of DED.

This article describes the development of a method to induce acute or chronic dry eye disease in rabbits by injecting concanavalin A to all portions of the orbital lacrimal gland system. This method, superior to those already reported, generates a reproducible, stable model of dry eye suitable for the study of pharmacological agents.

نموذج أرنب من مرض العين الجاف المُقوّل المُسبّب بواسطة Concanavalin حقنة في الغدد اللارِسية: تطبيق على دراسات فعالية الدواء

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

Medicine

Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic step. Despite advances in our understanding of DED, significant knowledge gaps remain. Advances are limited in part due to the lack of informative animal models. The authors recently reported on a method of DED induced by injecting all orbital lacrimal gland (LG) tissues with the lectin concanavalin A. Here, we report a novel model of aqueous-deficient DED based on the surgical resection of all orbital LG (dacryoadenectomy) tissues. Both methods use rabbits because of their similarity to human eyes in terms of the size and structure of the ocular surface. One week after removal of the nictitating membrane, the orbital superior LG was surgically removed under anesthesia, followed by removal of the palpebral superior LG, and finally removal of the inferior LG. Dacryoadenectomy induced severe DED, evidenced by a marked reduction in the tear break up time test and the Schirmer&#39;s tear test, and significantly increased tear osmolarity and rose bengal staining. Dacryoadenectomy-induced DED lasted at least eight weeks. There were no complications and animals tolerated the procedure well. The technique can be mastered relatively easily by those with adequate surgical experience and appreciation of the relevant rabbit anatomy. Since this model recapitulates the features of human aqueous-deficient DED, it is suitable for studies of ocular surface homeostasis, DED, and candidate therapeutics.

A novel approach is presented to induce chronic dry eye disease in rabbits by surgically removing all orbital lacrimal glands. This method, distinct from those previously reported, produces a stable, reproducible model of aqueous deficient dry eye well suited to study tear physiology and pathophysiology and ocular therapeutics.

إنشاء نموذج العين الجافة الشديدة باستخدام استئصال الددريوادادينال الكامل في الأرانب

Dry eye disease (DED) is a complex disease with multiple etiologies and variable symptoms, having ocular surface inflammation as its key pathophysiologic ...

Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ductal epithelial, and myoepithelial cells (MECs). MECs express alpha smooth muscle actin (&#945;SMA) and have a contractile function. They are found in multiple glandular organs and are of ectodermal origin. In addition, the LG contains SMA+ vascular smooth muscle cells of endodermal origin called pericytes: contractile cells that envelop the surface of vascular tubes. A new protocol allows us to isolate both MECs and pericytes from adult murine LGs and submandibular glands (SMGs). The protocol is based on the genetic labeling of MECs and pericytes using the SMACreErt2/+:Rosa26-TdTomatofl/fl mouse strain, followed by preparation of the LG single-cell suspension for fluorescence activated cell sorting (FACS). The protocol allows for the separation of these two cell populations of different origins based on the expression of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) by MECs, whereas pericytes do not express EpCAM. Isolated cells could be used for cell cultivation or gene expression analysis.

The lacrimal gland (LG) has two cell types expressing &#945;-smooth muscle actin (&#945;SMA): myoepithelial cells (MECs) and pericytes. MECs are of ectodermal origin, found in many glandular tissues, while pericytes are vascular smooth muscle cells of endodermal origin. This protocol isolates MECs and pericytes from murine LGs.

عزل الخلايا العضلية الفطرية من الغدد الفكه البالغة الدمعية

The lacrimal gland (LG) is an exocrine tubuloacinar gland that secretes an aqueous layer of tear film. The LG epithelial tree is comprised of acinar, ...

خلل الغدة الدمعية الناجم عن سكوبولامين في الفئران

A Rat Dry Eye Model with Lacrimal Gland Dysfunction Induced by Scopolamine

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal tear production can lead to a disturbance in the ocular surface environment, including corneal damage and inflammation. In severe cases, ADDE can cause vision loss or even blindness. Currently, dry eye treatment is limited to eye drops or physical therapy, which can only alleviate eye discomfort symptoms and cannot fundamentally cure dry eye syndrome. To restore the function of the lacrimal gland in dry eye, we have created an animal model of lacrimal gland dysfunction in rats induced by scopolamine. Through the comprehensive evaluation of the lacrimal gland, corneas, conjunctivas, and other factors, we aim to provide a full understanding of the pathological changes of ADDE. Compared with the current dry eye mouse model, this ADDE animal model includes a functional evaluation of the lacrimal gland, providing a better platform for studying lacrimal gland dysfunction in ADDE.

تسليط الضوء على المؤلف: التحديات في تطوير نماذج جفاف العين واتجاهات البحث المستقبلية

Here, we establish a rat model of lacrimal gland dysfunction to provide a basis for the study of aqueous-deficient dry eye.

نموذج جفاف العين للفئران مع خلل في الغدة الدمعية الناجم عن سكوبولامين

Aqueous-deficient dry eye (ADDE) is a type of dry eye disease that can result in the reduction of tear secretion quantity and quality. Prolonged abnormal ...

Three-Dimensional, Serum-Free Culture System for Lacrimal Gland Stem Cells

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture method to obtain a sufficient number of LG stem cells (LGSCs) is one obstacle for further research and application. The three-dimensional (3D), serum-free culture method for adult mouse LGSCs is well established and shown here. The LGSCs could be continuously passaged and induced to differentiate to acinar or ductal-like cells.
For the LGSC primary culture, the LGs from 6-8-week-old mice were digested with dispase, collagenase I, and trypsin-EDTA. A total of 1 &#215; 104 single cells were seeded into 80 &#181;L of matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in each well of a 24-well plate, precoated with 20 &#181;L of matrix gel-LGSCM matrix. The mix was solidified after incubation for 20 min at 37 &#176;C, and 600 &#181;L of LGSCM added.
For LGSC maintenance, LGSCs cultured for 7 days were disaggregated into single cells by dispase and trypsin-EDTA. The single cells were implanted and cultured according to the method used in the LGSC primary culture. LGSCs could be passaged over 40 times and continuously express stem/progenitor cell markers Krt14, Krt5, P63, and nestin. LGSCs cultured in LGSCM have self-renewal capacity and can differentiate into acinar or ductal-like cells in vitro and in vivo.

The three-dimensional, serum-free culture method for adult lacrimal gland (LG) stem cells is well established for the induction of LG organoid formation and differentiation into acinar or ductal-like cells.

نظام استزراع ثلاثي الأبعاد خال من المصل للخلايا الجذعية للغدة الدمعية

Lacrimal gland (LG) stem cell-based therapy is a promising strategy for lacrimal gland diseases. However, the lack of a reliable, serum-free culture ...

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its underlying mechanisms. Therefore, we developed a mouse model of dry eye disease by surgically removing both the extraorbital lacrimal glands (ELG) and intraorbital lacrimal glands (ILG) to investigate the ocular surface pathology in the context of aqueous deficiency dry eye. Two weeks post operation, the mice exhibited severe dry eye manifestations, including reduced tear secretion, corneal epithelial irregularities, positive fluorescein sodium staining, and neovascularization. Histological examination via hematoxylin and eosin staining revealed inflammatory cell infiltration and corneal epithelium dysplasia. Immunofluorescence staining and quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction revealed decreased expression of the normal corneal epithelial biomarkers K12 and Pax6 and increased expression of Sprr1b in the corneal epithelium. These ocular manifestations indicated abnormal corneal epithelial differentiation. Furthermore, immunofluorescence staining of Ki67 revealed the increasing cell proliferation. In conclusion, the ELG plus ILG excision model proved suitable for studying changes in the ocular surface and elucidating the mechanisms underlying aqueous deficiency dry eye.

Here, we present a method to establish a mouse model of aqueous-deficient dry eye by excising the extraorbital and infraorbital lacrimal glands and evaluate the changes in the ocular surface in aqueous deficiency dry eye.

Dry eye disease is a prevalent condition affecting 5%-50% of the global population. Animal model investigations play a crucial role in understanding its ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from desiccation stress and external insults. Little is known about lacrimal gland (patho)physiology because of the lack of adequate in vitro models. Organoid technology has proven itself as a useful experimental platform for multiple organs. Here, we share a protocol to establish and maintain mouse and human lacrimal gland organoids starting from lacrimal gland biopsies. By modifying the culture conditions, we enhance lacrimal gland organoid functionality. Organoid functionality can be probed through a "crying" assay, which involves exposing the lacrimal gland organoids to selected neurotransmitters to trigger tear release in their lumen. We explain how to image and quantify this phenomenon. To investigate the role of genes of interest in lacrimal gland homeostasis, these can be genetically modified. We thoroughly describe how to genetically modify lacrimal gland organoids using base editors-from guide RNA design to organoid clone genotyping. Lastly, we show how to probe the regenerative potential of human lacrimal gland organoids by orthotopic implantation in the mouse. Together, this comprehensive toolset provides resources to use mouse and human lacrimal gland organoids to study lacrimal gland (patho)physiology.

This protocol describes how to establish, maintain, genetically modify, differentiate, functionally characterize, and transplant lacrimal gland organoids derived from primary mouse and human tissue.

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Superior Lacrimal Gland Removal: A Surgical Technique to Remove the Palpebral and Orbital Parts of Superior Lacrimal Gland from Rabbit Model

Source: Honkanen, R. A. et al., <a href="https://www.jove.com/v/60126">Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the surgical procedure to remove the two parts: palpebral and orbital of the superior lacrimal gland from a rabbit to create a dry eye disease model. This rabbit model is suitable for studies of ocular surface homeostasis, pathophysiology and ocular therapeutics.

إزالة الغدة الدمعية الفائقة: تقنية جراحية لإزالة الأجزاء الجفنية والمدارية من الغدة الدمعية العلوية من نموذج الأرنب

Source: Honkanen, R. A. et al., Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (2020).
This video ...

التلاعب في الغدة الدمعية الفئران

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

نموذج أرنب من مرض العين الجاف المُقوّل المُسبّب بواسطة Concanavalin حقنة في الغدد اللارِسية: تطبيق على دراسات فعالية الدواء

إنشاء نموذج العين الجافة الشديدة باستخدام استئصال الددريوادادينال الكامل في الأرانب

عزل الخلايا العضلية الفطرية من الغدد الفكه البالغة الدمعية

نموذج جفاف العين للفئران مع خلل في الغدة الدمعية الناجم عن سكوبولامين

نموذج جفاف العين للفئران مع خلل في الغدة الدمعية الناجم عن سكوبولامين

نموذج جفاف العين للفئران مع خلل في الغدة الدمعية الناجم عن سكوبولامين

نظام استزراع ثلاثي الأبعاد خال من المصل للخلايا الجذعية للغدة الدمعية

Establishment of A Mouse Model of Aqueous Deficiency Dry Eye

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

إزالة الغدة الدمعية الفائقة: تقنية جراحية لإزالة الأجزاء الجفنية والمدارية من الغدة الدمعية العلوية من نموذج الأرنب